全 文 ：半边旗抗肿瘤有效成分 5F的纯化及其体外增效作用＊
兰柳波 梁念慈 莫丽儿 邓亦峰
(广东医学院生物化学与分子生物学研究所 ,湛江 524023)
2003 02 07收稿 , 2003 03 11修回
＊国家自然科学基金资助课题 , No 3987099和广东省自然科学基金
资助课题 , No 940586
作者简介:兰柳波 ,男 , 27岁 , 硕士。研究方向:中草药的生化药理
学。 Tel:0759-2388582 , E-mail:lanlanyu@21cn.com;
梁念慈 ,男 , 62岁 , 教授 ,博士生导师。研究方向:生化药
理和细胞生化
中国图书分类号 R 282.71;R 284.1;R 329.24;R 733.7;
R 914.4;R 979.1
文献标识码 A 文章编号 1001-1978(2003)07-0804-04
摘要 目的 寻找半边旗中二萜类有效成分之一 5F纯化的
新方法 ,研究 5F对常用抗肿瘤药物的体外增效作用。方法
应用结合了 AgNO3 的普通层析用硅胶来纯化 5F ,应用台
盼蓝拒染法测定药物对细胞的抑制率。结果 纯化后所得
到的产品中 5F 的含量达到 99%以上 , 是迄今为止纯度最高
的产品。较低浓度的 5F 分别与氟尿嘧啶(5-Fu)、顺铂(CD-
DP)及长春新碱(VCR)合用可以增强它们对 HL-60 、K562细
胞株的杀伤作用。结论 结合了 AgNO3 的普通硅胶可有效
地分离纯化 5F 。5F 可增强上述几种药物对 HL-60、K562 细
胞的杀伤作用 ,可能与几种药物对细胞周期影响不同有关。
关键词 半边旗;纯化;增效作用
半边旗(PsL)是凤尾蕨科凤尾蕨属植物 ,其体
内外抗肿瘤作用已经得到充分证实[ 1] 。5F 为其有
效成分之一 ,但分离时常伴有一无效成分 4F ,它与
5F 的结构差别仅在于 16 、17位 C原子之间有无双
键(如 Fig 1所示)[ 2] ,故二者常混合在一起 ,难于分
开。本文尝试用结合了 AgNO3的硅胶进行柱层析 ,
分离纯化 5F 和 4F 的混合物 ,并观察了 5F 与几种
常用抗肿瘤药物联合作用于 HL-60 、K562细胞的效
果。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 受试药物与试剂 半边旗提取物 5F(不纯)
由本所植化室提取分离 , 5-Fu 、CDDP 、VCR均购于
广东医学院附属医院药房 。新生小牛血清购自杭州
四季青公司 , RPM I 1640培养基为Gibco 产品 ,硅胶
HF 254购自青岛海洋化工厂(薄层层析用), AgNO3
为广州化学试剂厂生产(分析纯)。
Fig 1 The structure of compounds 5F and 4F
1.1.2 细胞株 人早幼粒白血病细胞株 HL-60 、人
慢性髓原白血病细胞株 K562均购于中科院上海细
胞所 ,本所保存。用 RPM I 1640 培养液 ,内含体积
分数为 0.1的新生小牛血清 、1×105 U·L-1青霉素
和 125 mg·L-1链霉素 , 常规传代 ,置 37℃、0.05
CO2 培养箱中培养 ,取对数生长期的细胞进行实验 。
1.2 实验方法
1.2.1 化合物 5F 的纯化 用少量水溶解 AgNO3
后 ,再用丙酮稀释成 0.59 mol·L-1的溶液 ,浸泡硅
胶 HF254 ,避光放置过夜。次日挥干丙酮及其中的
水份 ,装柱(2×40 cm)[ 3] 。将半边旗提取物 5F 上
柱 ,避光条件下进行硅胶柱层析 ,用氯仿/甲醇进行
梯度洗脱(体积比从 99.5∶0.5至 98∶2),分部收集 、
浓缩 ,用薄层层析进行初步鉴定(展开剂为体积比
95∶5的氯仿/甲醇),经重结晶后得到纯化产品 5F。
所得产品用岛津公司 LCMS-QP8000α液质联用仪
鉴定结构及纯度 ,并与纯化前的 5F 提取物进行比
较 。
1.2.2 联合用药实验 将纯化得到的 5F 用二甲
基亚砜配制成原液 ,分装 ,临用前用磷酸盐缓冲液稀
释至所需浓度 。处理细胞时 ,二甲基亚砜的最终浓
度≤0.1%,实验表明该浓度对细胞生长没有影响。
其他药物直接用磷酸盐缓冲液配制成所需浓度 。
·804· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2003 Jul;19(7):804 ～ 7
收集对数生长期 HL-60 、K562 细胞 1 ×108·
L-1 ,分装入 24孔板中 ,每孔 990 μl ,用药组加 10 μl
受试药液 ,溶剂对照组加 10 μl相应溶剂 ,并设空白
对照组 , 均为 4 个平行孔。加药后于 37℃、0.05
CO2 饱和湿度孵箱中保温 24 h后 ,用台盼蓝拒染法
测定细胞成活率 ,计算出药物对细胞生长的抑制率
(IR)。
为判断两药合用是拮抗 、相加或增强 ,按照金氏
公式求 q值[ 4] 。
q=E(A+B)/[ EA +(1-EA)×EB]
E(A+B)为两药合用时的抑制率;EA 、EB 为各药
单独使用时的抑制率 。q<0.85表示两药合用有拮
抗作用;q>1.15表示两药合用有增强作用;1.15≥
q≥0.85表示两药合用有相加作用 。
2 实验结果
2.1 纯化产品的检测 用液质联用仪检测纯化前
后的物质 ,根据液相质谱图中 5F 及 4F 出现的峰
图 ,采用峰面积归一化的方法计算出其中 5F 、4F 的
含量 ,结果如 Tab 1 。可以看出 ,用结合了 AgNO3
的硅胶纯化得到的产品中 ,5F 的含量由普通硅胶纯
化的 35.42%升高到 99.27%,效果令人满意 。
2.2 5F与其它抗肿瘤药物联合应用的结果 本文
采用台盼蓝拒染法测定了半边旗有效成分 5F 单独
应用及分别与 5-Fu 、CDDP 、VCR 联合应用对 HL-
60 、K562细胞株的体外杀伤作用 。结果见 Tab 2 ,
3。我们发现:5F 与其他几种抗肿瘤药物联合作用 ,
比单独应用 5F 时对 HL-60 、K562 细胞的杀伤力要
大 ,计算出来的 q 值介于 0.85 ～ 1.15之间 ,有个别
大于 1.15。提示:5F 与 5-Fu 、CDDP 和 VCR的体
外抗肿瘤作用具有相加或者是增强作用。
3 讨论
关于半边旗抗肿瘤作用的有效成分已有报道 ,
主要为 6F 、A 及 5F[ 2] ,其中 5F 虽然抗肿瘤作用不
是最强 ,但是由于其提取过程较简单 ,含量最高 ,因
此是目前将半边旗开发成新药的首选目标 。利用以
往的常规提取工艺所得到的 5F 由于与 4F 结构的
相似性 ,二者在物理及化学性质上差异甚小 ,因此
5F 多与 4F 混合在一起 ,要得到纯度较高的 5F 产品
比较困难 。虽然 4F 不影响 5F 的抗肿瘤作用 ,但对
于进一步的成分分析及定量研究有不利的影响 。
本文借鉴饱和及不饱和脂肪酸的分离方法 ,利
用 AgNO3结合到普通硅胶上 ,将混合物经过柱层析
分离后可以得到 5F 和 4F 的纯品。其作用原理
可能是基于 Ag+与 π电子的相互作用 ,含不饱和键
Tab 1 The change of amount of 5F and 4F after puri fication
Compound
5F
Peak area/ artif icial unit Total/ %
4F
Peak area/ arti ficial unit Total/ %
5F purified by routine silica gel column 15052044 35.42 27438204 64.58
5F purif ied by silica gel column combined w ith
AgNO3
50014023 99.27 367321 0.73
Tab 2 Combined effect of 5F with other antitumor agents on the growth of HL-60 cell l ines
Treatment
/μmol·L-1
No 5F
IR/ %
6.02μmol·L-1
5F I R/ % q
12.1μmol·L -1
5F IR/ % q
24.1μmol·L -1
5F IR/ % q
0 - 7.2±0.1 - 26.8±0.4 - 55.6±0.5 -
5-Fu
12.0 23.5±0.4 28.0±0.6 0.97 42.5±1.0 0.97 70.6±0.8 1.07
24.0 40.7±0.6 39.3±0.4 0.87 58.6±0.9 1.04 84.4±1.0 1.14
48.1 56.6±0.7 54.8±0.5 0.92 70.5±0.7 1.03 89.2±1.1 1.10
96.2 74.5±0.3 69.7±0.8 0.91 82.4±0.8 1.01 92.8±0.4 1.05
CDDP
1.00 32.4±0.8 41.4±0.8 1.12 56.6±0.7 1.13 85.0±0.8 1.22
2.00 64.5±0.9 64.8±1.2 0.97 72.4±0.4 0.98 90.7±1.8 1.08
4.00 81.6±0.2 79.3±0.9 0.96 81.8±1.2 0.95 94.6±0.8 1.03
VCR
0.06 25.7±0.8 35.6±0.5 1.15 47.3±0.9 1.04 72.8±1.1 1.09
0.12 42.2±0.2 49.0±0.6 1.06 60.4±0.9 1.05 81.4±1.2 1.09
0.24 60.8±0.8 62.3±1.4 0.98 76.1±0.7 1.07 88.6±0.2 1.07
0.48 78.2±0.6 77.4±0.5 0.97 85.5±0.8 1.03 92.8±1.6 1.03
·805·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2003 Jul;19(7)
Tab 3 Combined effect of 5F with other antitumor agents on the growth of K562 cel l l ines
Treatment
/μmol·L-1
No 5F
IR/ %
6.02μmol·L-1
5F I R/ % q
12.1μmol·L -1
5F IR/ % q
24.1μmol·L -1
5F IR/ % q
0 - 8.2±0.2 - 23.6±0.5 - 48.6±0.8 -
5-Fu
12.0 10.2±0.2 16.4±0.2 0.94 32.5±0.9 1.03 44.6±0.4 0.83
24.0 18.7±1.0 22.8±0.9 0.90 36.4±0.5 0.96 58.2±0.2 1.00
48.1 36.5±0.5 38.5±0.8 0.92 48.0±0.6 0.95 68.1±0.4 1.01
96.2 56.6±0.2 58.5±0.1 0.92 62.7±0.4 0.92 76.3±0.9 0.97
CDDP
1.00 27.2±1.0 40.5±0.8 1.22 61.4±0.3 1.38 68.5±0.4 1.07
2.00 48.0±0.6 52.7±0.1 1.01 69.7±0.4 1.16 74.4±0.3 1.02
4.00 63.3±0.4 70.5±0.8 1.06 72.4±1.5 1.01 85.6±0.4 1.06
VCR
0.06 20.2±1.5 35.0±0.4 1.31 44.5±0.8 1.14 60.4±0.6 1.02
0.12 38.6±0.7 47.2±0.7 1.08 57.2±2.4 1.08 75.3±0.2 1.10
0.24 54.7±1.2 59.7±0.7 1.02 68.0±0.8 1.04 84.9±1.7 1.11
0.48 71.3±0.2 75.3±0.4 1.02 79.8±0.9 1.02 89.1±1.4 1.04
的5F 有 π电子 ,而 4F 则没有 。因此 Ag+与 5F 中
的π电子结合 ,就使得硅胶柱对不饱和的 5F 的吸
附性增强 ,从而提高了柱的选择性 。利用这种 Ag+
与π电子的相互作用达到分离 5F 与 4F 的目的[ 5] 。
本工作从分离纯化的角度进行探索和尝试 ,并拿到
了迄今为止纯度最高的 5F 产品 ,这对于深入进行
半边旗有效成分提取工艺的改进研究提供了一个指
导的方向 ,也从药物分析的角度提供了标准参考物
质。
本工作还将经过纯化的 5F 与其它几种常用的
抗肿瘤药物 5-Fu 、CDDP 、VCR联合应用 , 观察对
HL-60 、K562细胞生长的抑制作用 ,发现联合用药
的效果比各药单独使用的效果明显提高 ,可产生协
同作用(包括相加和增强作用)。这可能和各药物作
用的靶点以及各时相细胞的敏感性不同有关 。根据
以往的报道[ 6 ,7] ,5F 阻断HL-60细胞在 S期 ,对G2/
M 期也有轻度阻断作用 , 5-Fu为抗代谢药 ,阻断细
胞于G1 期 ,对 S期敏感 , CDDP 可与 DNA 交联 ,引
起 DNA复制障碍 ,阻断细胞于G2/M 期 ,对晚G1期
细胞敏感;VCR 的作用靶点是微管 , 阻断细胞于
G2/M 期 ,对 S 期细胞敏感 。因此 , 5F 与此三种药
物合用时可提高其抑制作用 ,这有可能是 5F 体外
增效作用的原因之一。
参考文献
1 张 晓 ,崔 燎 ,田中信寿 et al.半边旗有效成分及抗肿瘤活性
研究.药物化学杂志 , 1997;32(1):37～ 9
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比较及构效关系分析.药学学报 , 1998;33(9):641～ 4
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技术文献出版社 , 1981:245～ 7
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7 Dethlef sen LA.Cell cycle ef fects of drugs.New York:Pergamon
Press, 1986:44～ 9
Purification of 5F from Pteris semipinnata and
its enhanced cytotoxicity in vitro
LAN Liu-Bo , LIANG Nian-Ci , MO Li-Er , DENG Yi-Feng
(Institute of Biochemistry &Molecular Biology , Guangdong Medical College , Zhanjiang 524023)
ABSTRACT AIM To find a new method fo r puri-
fying the active compound 5F isolated f rom Pteris
sem ipinnata L .(PsL)and observe i ts enhanced cy to-
toxicity w hen combined with o ther antitumor agents.
METHODS Silica gel combined w ith AgNO3 was
made to purify 5F.Cy totoxicity w as detected w ith
t rypan blue dye exclusion assay.RESULTS After
purification , the concentration of compound 5F in pu-
rif ied products w as higher than 99%.The inhibi tory
rates of 5F combined w ith 5-Fu or CDDP o r VCR
·806· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2003 Jul;19(7)
were higher than that of these drugs used alone.
CONCLUSIONS Compound 5F could be purif ied ef-
fectively using silica gel combined wi th AgNO3.5F
could enhance the cy totoxici ty on HL-60 and K562
cells of the drugs mentioned above.The different ef-
fect of these agents on the various phases of cell cy cle
kinet ics may explain the enhanced ef fect of 5F .
KEY WORDS Pteris semipinnata L ;purification;
cy totoxici ty
α1受体对不同状态心肌细胞的作用
方 宏 冯义柏 王兴祥 周利龙
(华中科技大学同济医学院附属协和医院心导管室 , 武汉 430022)
中国图书分类号 R 332;R 322.11;R 329.25;R 392.11;
R 542.2;R 654.2
文献标识码 A 文章编号 1001-1978(2003)07-0807-05
摘要 目的 通过激活和阻断不同状态心肌的α1 受体 , 探
讨α1受体的活化状态与不同状态心肌的关系。方法 采用
Langedorff灌流技术复制动物模型。第 1 个实验检验不同浓
度的α1受体激动剂 phenylephrine 和阻断剂 prazosin(0.01 、
0.1 、1 、10、100μmol·L-1)在缺血前 10 min 、缺血期和再灌注
时的效应。第2 个实验研究 phenylephrine和 prazosin 的时间
依赖性。每组实验的末期 , 测量磷酸肌酸激酶 、细胞凋亡和
坏死情况。结果 0.1、1 μmol·L-1的 pheny lephrine可发挥
最大效益 , 但 prazosin 浓度超过 10 μmol·L -1可产生有害作
用。缺血前激活 、缺血期间阻断α1 受体可保护心肌。 再灌
注时激活α1受体效应不明确 , 但阻断α1 受体有害。结论
激动或阻断α1受体所产生的效应与心肌的状态有关。
关键词 α1 受体;缺血/再灌注;细胞学机制
α1 受体介导缺血预适应保护心肌抗缺血性损
伤的作用已被公认 ,然而临床工作中很难准确把握
时机。α1 受体的活化状态与不同状态心肌的关系
以及由此产生的生物学效应 ,目前尚不清楚。因此
我们通过激活和阻断不同状态心肌的α1 受体 ,了解
α1 受体在其中所发挥的生物学效应。
1 材料与方法
1.1 材料 ♂Wistar 大鼠 132只 ,同济医学院动
物实验中心提供 ,清洁级 ,体重 200 ～ 280 g 。调控
2002 12 05收稿 , 2003 01 30修回
作者简介:方 宏 ,男 , 36岁 , 博士生 , 主治医师。研究方向:起搏电
生理。 Tel:027-85779486 , E-mail:de 61@163.com;
冯义柏 ,男 , 50岁 ,教授, 博士生导师。 E-mail:yibaifeng@
hotmail.com
α1受体活化状态的工具药 pheny lephrine , prazosin ,
上海市九福药业公司惠赠 。TUNEL 试剂盒 ,购自
中山生物科技公司 。
1.2 方法 采用 Langedo rf f逆行衡压灌流技术 ,模
拟心肌缺血和再灌注。大鼠戊巴比妥钠麻醉后 ,固
定并行气管切开 ,插管正压呼吸。然后开胸摘取心
脏 ,行 Langedorff 灌流。正常灌流液(mmol·L-1):
95% O2 +5% CO2 , NaCl 125 , KCl 4.0 , MgSO4
(7H2O)3.4 , KH2PO4 1.18 , EDTA(2H2O)0.03 ,
NaHCO3 16.9 , D-Glucose 11.0 ,CaCl2 1.85;缺血灌
流液:95%N2+5%CO2 ,2-Deoxyglucose 10.0 mmol
·L 替换 95%O2+5%CO2 , D-Glucose ,余与正常灌
流配制相同 ,以模拟缺血的无糖无氧状态 。
1.3 分组 大鼠心脏预灌流 30 min后随机分 2大
组 ,22 小组。正常对照组 , 正常灌流液灌注 250
min。量效分析组 ,用缺血灌流液灌注 60 min后 ,改
用正常灌流液灌注 180 min , 其间 phenylephrine ,
prazosin分别按 0 、0.01 、0.1 、1.0 、10 、100 μmol·L-1
的浓度加用(n =6)。病程分析组 , phenylephrine ,
prazosin分别按 0.1 、10 μmol·L-1用药 ,给药时间是
缺血前 5 ～ 10 min 、缺血期 、缺血 60 min后再灌注期
及全程 ,另置全程无药组(n=6)。
1.4 观察指标
1.4.1 肌酸磷酸激酶(CK) 留取灌注液的时间
是:正常对照组 ,正常灌流液灌注 250 min;量效分
析组 ,预灌 5 min正常灌流液灌注 5 min 后缺血 60
min再灌注 180 min;病程分析组 ,预灌 5 min正常
灌流液灌注 5 min 后缺血 60 min ,再灌注 180 min;
全程有或无药组在预灌 5 min 正常灌流液灌注 5
min后缺血 60 min再灌注 180 min。均于实验末取
10 μl灌注液 ,用自动生化仪测定 CK的活性 。
·807·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2003 Jul;19(7):807 ～ 11