全 文 ：中国农学通报 2016,32(27):109-113
Chinese Agricultural Science Bulletin
高速逆流色谱法分离澳洲薄荷中香叶木苷
刘雪辉 1,2，谢红旗 1,2,3,4，张 思 3,4，丁逸凡 3,4，李 坚 1,2,3，张志旭 1,2,3，刘东波 1,2,3,4
（1湖南省作物种质创新与资源利用重点实验室，长沙 410128；2湖南省植物功能成分利用协同创新中心，长沙 410128；
3国家中医药管理局亚健康干预技术实验室，长沙 410128；4湖南农业大学园艺园林学院，长沙 410128）
摘 要：为研究澳洲薄荷中香叶木苷的高效制备问题，以澳洲薄荷为原料，建立高速逆流色谱仪分离澳
洲薄荷中香叶木苷的方法。澳洲薄荷干燥茎叶用65%乙醇提取，经AB-8型大孔吸附树脂初步纯化后得
到澳洲薄荷总黄酮提取物，然后采用乙酸乙酯-正丁醇-水-乙酸(3:1:3:0.005，V/V)的两相溶剂体系进行香
叶木苷单体的高速逆流分离纯化：上相为固定相，下相为流动相，主机转速 1600 r/min，流动相流速
0.8 mL/min，柱温25℃，检测波长254 nm。分离得到的香叶木苷经液相色谱检测纯度达95.2%。
关键词：澳洲薄荷；香叶木苷；高速逆流；分离；黄酮
中图分类号：TQ464.3 文献标志码：A 论文编号：casb16010044
Separation and Preparation of Diosmin from Mentha×gracilis by
High Speed Counter-current Chromatograph
Liu Xuehui1,2, Xie Hongqi1,2,3,4, Zhang Si3,4, Ding Yifan3,4, Li Jian1,2,3, Zhang Zhixu1,2,3, Liu Dongbo1,2,3,4
(1Hunan Provincial Key Laboratory of Crop Germplasm Innovation and Utilization, Changsha 410128;
2Hunan Co-innovation Center for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128;
3State Key Laboratory of Subhealth Intervention Technology, Changsha 410128;
4College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University, Changsha 410128)
Abstract: To investigate a suitable method for preparation of diosmin from Mentha×gracilis, the stems and
leaves of Mentha× gracilis were extracted with 65% ethanol and purified through AB-8 macroporous resin. A
solvent system of ethyl acetate- n- butanol- water- acetic acid (3:1:3:0.005, V/V) was used for isolation and
preparation by HSCCC (high speed counter- current chromatography). The upper phase was used as the
stationary phase, while the lower one was used as mobile phase. The optimum purification condition was as
follows: the isolation was performed at a flow- rate of 0.8 mL/min under rotator speed of 1600 r/min, the
temperature was 25℃ and the detection wavelength was 254 nm. Fraction II was collected according to HSCCC
chromatogram and then detected by HPLC, which was diosmin with the purity of 95.2%.
Key words: Mentha×gracilis; diosmin; HSCCC; separation; flavonoids
0 引言
澳 洲 薄 荷 (Mentha × gracilis) 为 唇 形 花 科
(Lamiaceae)药食同源的多年生草本植物[1-2]，原产于亚
欧大陆及非洲，味清凉，具有强化细胞膜、降低血管脆
性及改善血管通透性的功效。近年来，随着薄荷在食
药行业的广泛应用[3-4]，学者们对澳洲薄荷中挥发性成
分的研究也不断深入[5-6]，但对其黄酮、多酚等非挥发性
组分的研究尚且匮乏，极大制约了澳洲薄荷资源的全
面综合利用。
澳洲薄荷黄酮具有较强的抗菌能力[7-8]、抗病毒能
基金项目：国家国际科技合作专项项目“澳大利亚特色植物引进与利用关键技术合作研究”(2013DFA31790)。
第一作者简介：刘雪辉，女，1990年出生，湖南娄底人，硕士研究生，主要从事植物功能成分提取分离与利用研究。通信地址：410128湖南省长沙市芙
蓉区湖南农业大学生命科学楼二楼217，E-mail：liuliuxuehui@163.com。
通信作者：刘东波，男，1970年出生，湖南长沙人，教授，主要从事功能产品开发与评价研究。通信地址：410128湖南省长沙市芙蓉区湖南农业大学生
命科学楼二楼221，E-mail：chinasaga@163.com。
收稿日期：2016-01-11，修回日期：2016-03-23。
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力[9]及抗氧化能力[10]。香叶木苷作为其主要的黄酮成
分之一，具有抗辐射[11]、抗血栓[12]、抗凝血[13]等功能。目
前，对香叶木苷的分离多采用薄层色谱、柱层析色谱等
方法[14]，存在分离效率低、操作繁杂、回收率低等缺点。
高速逆流色谱法是一种新型高效的液液分配色谱[15-19]，
它以2个相互不相溶的混合溶剂分别作为固定相和流
动相，利用被分离组分在两相溶剂体系中分配系数的
差异实现分离，具备快速、高效、样品无损耗等优点。
研究以澳洲薄荷的干燥茎叶为原料，通过大孔吸附树
脂进行初步纯化后，利用高速逆流色谱进行单体分离，
以期为开发利用澳洲薄荷资源提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
澳洲薄荷干燥茎叶；香叶木苷标准品（上海源叶生
物科技有限公司）；AB-8型树脂（沧州宝恩吸附材料有
限公司）；乙醇、乙酸、乙酸乙酯、正丁醇均为分析纯（国
药集团化学试剂有限公司）；色谱纯乙腈、色谱纯甲醇
（国药集团化学试剂有限公司）。
1.2 仪器与设备
Agilent- 1260 Infinity 高效液相色谱，色谱柱
Agilent ZORBAX SB- C18(4.6 mm × 150 mm 5-
Micron)；TBE-20A高速逆流色谱仪（上海同田生物科
技有限公司）；Mettler Toledo XS205型电子分析天平
（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；旋转蒸发仪（上
海雅荣生化仪器设备有限公司）。
1.3 试验方法
1.3.1 澳洲薄荷粗提物制备 称取已粉碎的澳洲薄荷干
燥茎叶1000 g，料液比为1:10，65%乙醇80℃回流提取
1.5 h，提取2次，合并提取液，旋转蒸发浓缩至500 mL，
加水分散至质量浓度为 1 g/mL，过 500 mL AB-8大孔
吸附树脂柱，上样流速1.5 BV/h，先用水洗至流出液澄
清透明，再用40%的乙醇进行洗脱，洗脱液旋转蒸发浓
缩后冷冻干燥得到澳洲薄荷粗提物干粉，为高速逆流
制备原料。
1.3.2 HPLC检测方法的建立 采用Agilent ZORBAX
SB-C18色谱柱，分别考察了甲醇-水、甲醇-0.5%乙酸
水、乙腈-0.5%乙酸水作为流动相[20-22]，将澳洲薄荷粗提
物以相应的初始流动相配比溶解进样，进样量10 μL，
采用梯度洗脱模式，流速 1 mL/min，柱温 25℃，波长
254 nm。根据分离度及峰形图确定HPLC检测方法。
1.3.3 HSCCC溶剂体系的筛选 分别将各溶剂体系按
比例配制，摇匀后静置分层过夜，将上下相分离，取适
量澳洲薄荷粗提物用下相溶解，进HPLC检测得目标
峰面积A萃前，再取等体积的上相进行萃取，取萃后下相
进HPLC检测得目标峰面积A 萃后，按式(1)计算分配系
数K值，根据K值选择合适的HSCCC溶剂体系。
K =
A萃前 - A萃后
A萃后
……………………………… (1)
1.3.4 HSCCC分离 称取 1.2.1所制备样品 20 mg，用
1 mL下相超声溶解，以上相为固定相，下相为流动相，
按上述合适K值的溶剂体系进行HSCCC分离[23-26]，以
5 mL/min的流速将色谱柱内充满固定相，开启主机以
1600 r/min的速度正转，以 0.8 mL/min的流速泵入流
动相。待体系达到动态平衡后进样，进样量 100 µL，
柱温25℃，检测波长254 nm。根据色谱流出图手动接
收各组分，并进行HPLC检测分析。
2 结果与分析
2.1 HPLC方法的优化
通过对不同流动相组成及梯度洗脱模式的考察发
现，在水相中加入 0.5%乙酸后，使得香叶木苷在溶液
中的电离平衡变化，其存在形式由分子状态和离子状
态 2种形态最大程度的趋向分子化，有效缓解色谱峰
拖尾，使得峰形更加对称并增加分离度；有机相为甲醇
时，基线漂移较大，而有机相为乙腈时，基线相对平稳
（图1）。因此，分别选择A相：0.5%乙酸水，B相：乙腈
作为流动相，洗脱梯度：0 min 5%B→30 min 40% B，
流速 1 mL/min，进样量 10 µL，柱温 25℃，检测波长
254 nm。
2.2 溶剂体系的筛选
选取合适的溶剂体系是HSCCC分离的关键，根
据目标组分的极性，分别选择了正己烷-乙酸乙酯-甲
醇-水(2:3:2:3)、氯仿-甲醇-正丁醇-水(4:3:0.5:2)、正己
烷-乙酸乙酯-正丁醇-冰醋酸-水(2:4:2:1.5:6)、乙酸乙
酯-正丁醇-水-冰醋酸(3:1:3:0.005)、石油醚-乙酸乙酯-
甲醇-水(2:4:3:3)、氯仿-甲醇-水(4:3:2)等 6个不同溶剂
体系进行K值的测定，得出各体系的K值如表 1所
示。根据色谱理论，K值的最适范围为0.5~2。因此选
择体系3和体系4进行HSCCC分离试验。
2.3 HSCCC分离条件优化及结果
选择上述合适K值的溶剂体系 3、4进行HSCCC
分离，分别按比例配置好溶剂体系，震荡混匀后静置过
夜，待两相达到分配平衡后将上、下相分离，超声脱气
30 min，将恒温水浴锅温度设置为 25℃，检测波长
254 nm，以 5 mL/min的流速泵入上相，使得固定相充
满整个管道后，开启主机以1600 r/min的速度正转，将
下相（流动相）以 0.8 mL/min的流速泵入管道，待流出
液为下相时，体系内部达到动力平衡。计算溶剂体系
3、4的固定相保留率分别为 40.6%和 53.2%。待基线
·· 110
刘雪辉等：高速逆流色谱法分离澳洲薄荷中香叶木苷
平稳后，准确称取 20 mg样品以 1 mL下相溶解进样，
根据色谱流出图手动收集各组分进行HPLC检测，图
2、3分别为溶剂体系3、4的HSCCC分离图。由于样品
的极性较大，在体系 3固定相中的保留时间短而分离
度差，体系4上相的极性相对较大，对目标组分的分离
效果好，且固定性保留率较高，能获得更好的分离度以
及分离效率，在该方法下，峰 II能够获得高纯度的香叶
木苷，经HPLC检测纯度为95.2%（图4）。
3 结论
本研究应用高速逆流色谱法对澳洲薄荷中香叶木
苷进行了分离纯化。通过AB-8型大孔吸附树脂对澳
洲薄荷提取液进行了初步纯化并获得澳洲薄荷黄酮粗
提物，以乙酸乙酯-正丁醇-水-冰醋酸(3:1:3:0.005)为两
相溶剂体系，进行澳洲薄荷中黄酮单体的制备，并分
离纯化出纯度高于95%的香叶木苷，与常规柱层析色
谱法相比，具有快速、简便、高效的特点。目前对澳洲
薄荷的研究大部分是针对薄荷脑、薄荷醇等挥发性成
分，而对其黄酮类等非挥发性成分研究较少，这严重
制约了澳洲薄荷的精细化开发及经济价值的提高，造
成了澳洲薄荷中非挥发活性成分的资源浪费。本试
验为充分研究澳洲薄荷活性成分及其药用功效提供
了物质基础，为澳洲薄荷资源的综合开发利用提供了
理论依据。
序号
1
2
3
4
5
6
溶剂体系
正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水
氯仿-甲醇-正丁醇-水
正己烷-乙酸乙酯-正丁醇-冰醋酸-水
乙酸乙酯-正丁醇-水-冰醋酸
石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水
氯仿-甲醇-水
比例
2:3:2:3
4:3:0.5:2
2:4:2:1.5:6
3:1:3:0.005
2:4:3:3
4:3:2
K
0.05
0.01
0.63
0.78
0.01
0.02
c.乙腈-0.5%乙酸水
图1 澳洲薄荷提取物HPLC检测图谱
a.甲醇-超纯水 b.甲醇-0.5%乙酸水
表1 香叶木苷在不同溶剂体系中的K值
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4 讨论
高速逆流分离技术的关键在于溶剂体系的筛选。
香叶木苷极性相对较大，常规黄酮苷类化合物的分离
溶剂体系如氯仿-甲醇-正丁醇-水(4:3:0.5:2)、氯仿-甲
醇-水(4:3:2)等上相极性相对较小，用作香叶木苷的分
离体系，K值偏低，不适合香叶木苷的分离。根据香叶
木苷在正丁醇中具有较好的溶解性，考察了正丁醇比
例较高的体系 3和体系 4。结果显示香叶木苷在上下
两相中的分配系数分别为 0.63和 0.78，理论上符合
HSCCC分离的条件。在后续进行HSCCC分离试验
时，体系 3由于正己烷的存在，上相极性仍然较低，对
香叶木苷的分离效果不理想。而体系4的上相极性相
对较大，根据相似相溶原理，对香叶木苷的吸附能力更
强，获得了良好的分离效果，而且相对体系 3而言，其
上相保留率更高，能更大地提高分离效率。本试验以
分离香叶木苷为主要目标。结合柱层析色谱与高速逆
流色谱等现代分离技术的优点，与传统的溶剂提取法
及薄层色谱法相比[27-28]，具有分离纯度高、时间短、效率
高等优点，是一种快捷、高效制备香叶木苷单体的
方法。
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图4 分离组分 II与香叶木苷标准品的 HPLC图
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