全 文 ：* 贵州省科技创新人才团队建设项目［2013 － 4006］
＊＊ 通信作者 杨小生 Tel:(0851)83805459;E－mail:gzcnp@ sina． cn
李齐激 Tel:13639039363;E－mail:leeqiji@ sina． com
第一作者 Tel:18286062242;E－mail:tiankongnzh@ 163． com
HPLC法同时测定民族药芒萁中 5 个成分的含量*
倪再辉1，2，李齐激2＊＊，杨艳2，张明2，曹佩雪2，王道平2，杨小生1，2＊＊
(1．贵阳医学院药学院，贵阳 550004;2．贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵阳 550002)
摘要 目的:建立同时测定民族药芒萁中芦丁、槲皮苷、山柰酚－3－O－α－L －鼠李糖苷、槲皮素和山柰酚的 ＲP－HPLC测定方法。
方法:采用 PntulipsTM BP－C18色谱柱(4. 6 mm ×250 mm，5 μm) ，以乙腈(A)－0. 5%磷酸(B)为流动相，梯度洗脱(0 ～ 10 min，15%
A;10 ～11 min，15%A→25%A;11 ～20 min，25%A→55%A;20 ～ 30 min，55%A→15%A) ，流速 1 mL·min －1，检测波长 360 nm，柱
温 30 ℃。结果:在选定的实验条件下，芦丁、槲皮苷、山柰酚－3－O－α－L －鼠李糖苷、槲皮素和山柰酚得到良好的分离，质量浓度
分别在 77. 2 ～694. 8 μg(r =0. 999 8，n = 6)、43. 6 ～ 392. 4 μg(r = 0. 999 9，n = 6)、288. 0 ～ 2 592. 0 μg(r = 0. 999 9，n = 6)、38. 4 ～
354. 6 μg(r =0. 999 9，n =6)和 43. 8 ～ 394. 2 μg(r = 0. 999 2，n = 6)范围内呈良好线性关系，平均回收率分别为 97. 6%(ＲSD =
1. 94%)、98. 6%(ＲSD =1. 11%)、96. 9%(ＲSD = 1. 22%)、97. 1%(ＲSD = 1. 97%)和 95. 3%(ＲSD = 2. 01%)。4 个不同产地芒萁
的含量测定结果表明，山柰酚－3－O－α－L －鼠李糖苷为芒萁的主要成分，其次为槲皮苷。不同产地的芒萁中 5 种成分的含量差
异变化不大，芦丁、槲皮苷、山柰酚－3－O－α－L －鼠李糖苷、槲皮素和山柰酚的含量分别为 0. 109 ～ 0. 176、0. 584 ～ 0. 686、2. 416 ～
2. 627、0. 088 ～0. 131和 0. 018 ～0. 031 mg·g －1。结论:该方法简单易行，高效快速，可用于民族药芒萁的品质评价及质量控制。
关键词:芒萁;芦丁;槲皮苷;山柰酚 －鼠李糖苷;槲皮素;山柰酚;高效液相色谱;民族药含量测定
中图分类号:Ｒ 917 文献标识码:A 文章编号:0254－1793(2015)12－2111－05
doi:10. 16155 / j. 0254－1793. 2015. 09
Simultaneous determination of 5 constituents in national drug
Dicranopteris pedata by HPLC*
NI Zai－hui1，2，LI Qi－ji2＊＊，YANG Yan2，ZHANG Ming2，CAO Pei－xue2，
WANG Dao－ping2，YANG Xiao－sheng1，2＊＊
(1． Guiyang Medical College of Pharmacy，Guiyang 550004，China;2． The Key Laboratory of Chemistry for
Natural Products of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences，Guiyang 550002，China)
Abstract Objective:To establish an HPLC－DAD method for simultaneous determination of the content of five
main active ingredients－ rutin，quercitrin，kaempferol－ 3 － O－ α－ L－ rhamnoside，quercetin and kaempferol in the
medicine plant of Dicranopteris pedata．Methods:The HPLC separation was performed on a PntulipsTMBP－C18 col-
umn(4. 6 mm ×250 mm，5 μm) ，using acetonitrile(A)－0. 5% phosphoric acid solution(B)as the mobile phase in
a gradient mode(0 －10 min，15% A;10 －11 min，15% A→25% A;11 － 20 min，25% A→55% A;20 － 30 min，
55%A→15%A)at a flow rate of 1 mL·min －1 ． The detection wavelength was 360 nm，and the column temperature
was 30 ℃ ． Ｒesults:A good separation of five compounds was achieved under the selected experimental conditions，
showing a good linearity relationship separately within the range of 77. 2－694. 8 μg(r = 0. 999 8，n = 6)for rutin，
43. 6－392. 4 μg(r =0. 999 9，n =6)for quercitrin，288. 0－2 592. 0 μg(r =0. 999 9，n =6)for kaempferol－3－O－α－L－
rhamnosides，38. 4－354. 6 μg(r = 0. 999 9，n = 6)for quercetin and 43. 8 － 394. 2 μg(r = 0. 999 2，n = 6)for
kaempferol． The respective average recoveries were 97. 6% (ＲSD = 1. 94%) ，98. 6% (ＲSD = 1. 11%) ，96. 9%
(ＲSD =1. 22%) ，97. 1%(ＲSD = 1. 97%) ，and 95. 3%(ＲSD = 2. 01%)． Determination results of Dicranopteris
—1112—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2015，35(12)
pedata from four different producing areas showed that kaempferol－3－O－α－L－rhamnoside was the main component
of Dicranopteris pedata，followed by quercetin． The content of five kinds of compositions was similar to Dicranopteris
pedata from different producing area． The contents of rutin，quercitrin，kaempferol－3－O－a－L－rhamnoside，querce-
tin and kaempferol ranged in 0. 109－0. 176，0. 584－0. 686，2. 416－2. 627，0. 088－0. 131 and 0. 018－0. 031 mg·g －1，
respectively． Conclusion:The established method is easy and efficient，and can be applied to determine the contents
of five main active ingredients of the national drug Dicranopteris pedata．
Keywords:Dicranopteris pedata;rutin;quercitrin;kaempferol－rhamnosides;quercetin;kaempferol;high performance
liquid chromatography;ethnodrug quantitative analysis
芒萁 Dicranopteris pedata(Houtt．)Nakaike 系里
百科芒萁属药用蕨类植物的全草，又名铁狼萁，主要
分布在我国热带、亚热带地区，即是酸性土壤指示植
物，又是侗族常用药物，具有清热利尿、化瘀止血、解
毒消肿的功效，主要用于治疗崩漏、跌打损伤、热淋
涩痛等病［1 － 2］。目前，植物化学研究先后从该植物
分离到结构新颖的高度氧化酚性衍生物 dichotoma-
ins A、B［3］及 clerodane二萜［4 － 6］、三萜［4］、黄酮［6 － 7］、
多糖［8］等成分;药理活性证实该植物提取物具有较
强的抗氧化活性［5］及抗菌活性［8］，dichotomain B 具
有一定抗 HIV 活性［3］;另外，其还在植物保护领域
表现出明显的化感效应［9］。针对该民族药材质量
控制方法的空白，本文建立了 HPLC 同时测定 5 个
主要活性成分含量的方法，为民族药芒萁的质量控
制提供参考。
1 仪器与试药
Agilent 1100 高效液相色谱仪(柱温箱，可见紫
外检测仪，四元泵，在线脱气机，自动进样器) ;电子
天平(Mettler Toledo，26115102－0) ;ZK－82A 型真空
干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司) ;粉碎机(浙
江温岭市机械有限公司)。
对照品芦丁(批号 100080－201408)、槲皮素(批
号 100081－200907)、槲皮苷(批号 111538－200504)均
购自中国食品药品检定研究院;山柰酚－3－O－α－L－
鼠李糖苷、山柰酚均为自制，结构经 UV、MS、1H－NMＲ
和13C－NMＲ等确证，纯度经高相液相色谱按面积归
一化法测定均大于 98%。甲醇、乙腈为色谱纯(天津
科密欧化学试剂有限公司) ，水为超纯水，其余试剂为
分析纯，芒萁于 2013 年 10 月采自贵州贵阳市市郊，
经贵阳中医学院赵俊华教授鉴定为里百科植物芒萁
Dicranopteris pedata(Houtt．)Nakaike的全草。
2 方法与结果
2. 1 溶液的制备
2. 1. 1 混合对照品溶液 精密称取对照品芦丁
9. 66 mg、槲皮苷 5. 44 mg、山柰酚－3－O－α－L－鼠李
糖苷 3. 60 mg、槲皮素 4. 80 mg、山柰酚 5. 48 mg，分
别用适量甲醇溶解并定容至 25 mL 量瓶中，得各单
一对照品溶液。分别精密量取上述各单一对照品溶
液适量，以甲醇配制成每 1 mL 中分别含芦丁
38. 6 μg、槲皮苷 21. 8 μg、山柰酚－3－O－α－L－鼠李
糖苷 144. 0 μg、槲皮素 19. 2 μg 和山柰酚 21. 9 μg
的混合溶液，即得。
2. 1. 2 供试品溶液 精密称取芒萁药材粗粉(过
20 目筛)2. 0 g，置 250 mL 圆底烧瓶中，精密加入
80%乙醇 80 mL，回流提取 2 h，滤过，重复提取 1
次，合并滤液，蒸干，残渣加适量甲醇使溶解，转移至
25 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤
液，即得。
2. 2 色谱条件
色谱柱:PntulipsTM BP－C18(4. 6 mm × 250 mm，
5 μm) ;流动相:乙腈(A)－0. 5%磷酸(B) ，梯度洗
脱(0 ～ 10 min，15% A;10 ～ 11 min，15% A→25% A;
11 ～ 20 min，25% A→55% A;20 ～ 30 min，55% A→
15%A) ;流速:1 mL·min －1;检测波长:360 nm;柱
温:30 ℃;进样量:10 μL。
2. 3 系统适用性试验
分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各
10 μL，按“2. 2”项下色谱条件测定，芦丁、槲皮苷、
山柰酚－3－O－α－L－鼠李糖苷、槲皮素、山柰酚色谱
峰的保留时间依次为 15. 9、17. 2、18. 2、20. 1、
22. 2 min，5 个物质色谱峰与相邻峰间分离度均 ＞
1. 5，理论塔板数均 ＞ 130 000。色谱图见图 1。
2. 4 方法学考察
2. 4. 1 线性关系考察 取适量“2. 1. 1”项下的混
合对照品溶液，以 0. 45 μm微孔滤膜过滤，按“2. 2”
项下条件分别进样 2、4、6、10、14、18 μL，记录峰面
积，以峰面积(Y)为纵坐标，进样质量(X)为横坐
标，得回归方程和线性范围，同时以仪器的信噪比
S /N为 3 时测定最低检出限(LOD) ，S /N为 10 时测
定最低定量限(LOQ) ，结果见表 1。
—2112— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2015，35(12)
图 1 对照品(A)、样品(B)色谱图
Fig． 1 HPLC chromatograms of reference substance(A)and sample(B)
1．芦丁(rutin) 2．槲皮苷(quercitrin) 3．山柰酚－3－O－α－L－鼠李糖苷(kaempferol－3－O－α－L－rhamnoside) 4．槲皮素(quercetin) 5．山柰酚(kaempferol)
表 1 线性关系
Tab． 1 Linear relations
成分
(compound)
标准曲线
(standard curve)
Ｒ2
线性范围
(line range)/μg
检出限(LOD)/ng 定量限(LOQ)/ng
芦丁(rutin) Y =62. 106X +12. 010 0. 999 8 77. 2 ～ 694. 8 1. 54 5. 14
槲皮苷(quercitrin) Y =94. 091X－6. 581 4 0. 999 9 43. 6 ～ 392. 4 0. 72 2. 39
山柰酚－3－O－α－L－鼠李糖
苷(kaempferol－3－O－α－
L－rhamnoside)
Y =67. 773X－6. 641 8 0. 999 9 288. 0 ～ 2 592. 0 14. 21 47. 37
槲皮素(quercetin) Y =140. 97X－21. 351 0. 999 9 38. 4 ～ 354. 6 0. 51 1. 68
山柰酚(kaempferol) Y =57. 738X－43. 685 0. 999 2 43. 8 ～ 394. 2 0. 89 2. 96
2. 4. 2 精密度试验 分别取同一批次的供试品溶
液，按照“2. 2”项下色谱条件连续进样 6 次，测得芦
丁、槲皮苷、山柰酚－3－O－α－ L－鼠李糖苷、槲皮素
和山柰酚峰面积的 ＲSD(n = 6)分别为 1. 56%、
0. 51%、1. 48%、0. 39%和 0. 41%，表明仪器精密度
良好。
2. 4. 3 稳定性试验 精密称取同一批芒萁药材粉
末(过 20 目) ，按“2. 1. 2”项下方法制备供试品溶
液。按“2. 2”项下色谱条件分别于 0、1、2、4、8、12、
24 h进样10 μL，测得24 h内芦丁、槲皮苷、山柰酚－3－
O－α－L－鼠李糖苷、槲皮素和山柰酚峰面积的 ＲSD
(n = 6)分别为 1. 33%、0. 25%、0. 26%、0. 11% 和
0. 45%，表明供试品溶液在 24 h内稳定性良好。
2. 4. 4 重复性试验 取同一批的芒萁药材粉末 6
份，按“2. 1. 2”项下方法制备供试品溶液，按
“2. 2”项色谱条件分别进样 10 μL，测得芦丁、槲
皮苷、山柰酚－3－O－α－ L－鼠李糖苷、槲皮素和山
柰酚的平均含量分别为 0. 258、0. 783、2. 871、
—3112—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2015，35(12)
0. 150 和 0. 020 mg·g － 1，ＲSD 分别为 1. 39%、
0. 41%、0. 53%、0. 25%和0. 40%，表明本方法重复性
良好。
2. 4. 5 加样回收试验 精密称取已知含量的芒萁
药材粉末(20 目)约 1 g，共 9 份，置于圆底烧瓶中，
分别以 80%、100%和 120% 3 个水平精密加入芦
丁、槲皮苷、山柰酚－3－O－α－ L－鼠李糖苷、槲皮素
和山柰酚的对照品溶液，按照“2. 1. 2”项下方法制
备供试溶液，在“2. 2”项色谱条件下分别进样 10 μL
进行测定，计算回收率，结果见表 2。芦丁、槲皮苷、
山柰酚－3－O－α－L－鼠李糖苷、槲皮素和山柰酚的
平均回收率(n = 9)为 97. 6%、98. 6%、96. 9%、
97. 1%、95. 3%，说明该方法准确度较高。
表 2 回收率试验结果
Tab． 2 Ｒesults of recovery tests
成分
(component)
样品含量
(sample content)/mg
加入量
(added)/mg
测得量
(detected)/mg
回收率
(recovery)/%(n =3)
ＲSD
/%
平均回收率
(average recovery)/%(n =9)
芦丁(rutin) 0. 258 0. 306 0. 550 95. 4 2. 25
0. 258 0. 254 0. 510 99. 2 1. 23
0. 258 0. 204 0. 458 98. 1 2. 34
97. 6
槲皮苷(quercitrin) 0. 783 0. 931 1. 700 98. 5 1. 15
0. 783 0. 776 1. 550 98. 8 1. 11
0. 783 0. 621 1. 395 98. 5 1. 06
98. 6
山柰酚－3－O－α－L－
鼠 李 糖 苷
(kaempferol－3－O－
α－L－rhamnoside)
2. 871 3. 451 6. 230 97. 3 0. 97
2. 871 2. 875 5. 650 96. 6 1. 53
2. 871 2. 302 5. 101 96. 9 1. 16
96. 9
槲皮素(quercetin) 0. 150 0. 187 0. 330 96. 3 2. 06
0. 150 0. 155 0. 302 98. 1 1. 68
0. 150 0. 125 0. 271 96. 8 2. 17
97. 1
山柰酚(kaempferol) 0. 020 0. 027 0. 046 96. 3 2. 08
0. 020 0. 021 0. 040 95. 2 1. 39
0. 020 0. 018 0. 037 94. 4 2. 56
95. 3
2. 5 样品含量测定
精密称取不同芒萁药材样品，按照“2. 1. 2”项
下方法制备供试品溶液，按“2. 2”项下色谱条件分
别进样 10 μL进行测定，计算样品中各成分的含量，
结果见表 3。
表 3 样品含量测定(mg·g －1，n =3)
Tab． 3 Ｒesults of content determination of samples
样品
(sample)
芦丁
(rutin)
槲皮苷
(quercitrin)
山柰酚－3－O－α－L－鼠李糖苷
(kaempferol－3－O－α－L－rhamnoside)
槲皮素
(quercetin)
山柰酚
(kaempferol)
贵阳花溪(Guiyang Huaxi) 0. 173 0. 673 2. 623 0. 088 0. 031
贵阳小河(Guiyang Xiaohe) 0. 109 0. 584 2. 416 0. 131 0. 018
贵阳云岩(Guiyang Yunyan) 0. 151 0. 647 2. 613 0. 107 0. 025
贵阳南明(Guiyang Nanming) 0. 176 0. 686 2. 627 0. 112 0. 019
3 讨论
3. 1 检测波长的确定
文献报道［10 － 11］本文所选芦丁、槲皮苷、山柰
酚－3－O－α－L－鼠李糖苷、槲皮素和山柰酚 5 种物
质检测波长多采用 260 nm，但在本实验中由于样
品其他成分干扰峰较大，检测不灵敏。通过对 5
种物质进行紫外全波长扫描，发现其在 215、254
和 360 nm处均有最大吸收，综合比较 3 个波长下
检测效果，最终选择干扰峰少、分离度高、检测灵
敏的 360 nm进行检测。
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3. 2 流动相的选择
参考文献［12－13］报道的色谱条件，比较了甲
醇－水、乙腈－水和乙腈－0. 5%磷酸等度洗脱与梯
度洗脱效果，结果表明在使用乙腈－0. 5%磷酸进行
梯度洗脱时，样品各检测物质峰得到完全分离，且峰
形良好。
3. 3 提取条件的选择
芒萁药材中黄酮类物质的提取工艺研究较
多［14－16］，而本试验所选对照物质均系黄酮类物质，
参考文献提取方法，综合比较了甲醇、80% 乙醇、
70%乙醇回流提取和超声提取法，结果发现 80%乙
醇回流提取 2 次，每次 2 h，所得检测物质可提取完
全，因此本实验采用 80%乙醇进行回流提取。
3. 4 样品含量测定结果分析
含量测定结果表明采自贵阳市郊不同区域的样
品中 5 种成分的含量均存在不同程度的变化，其中
山柰酚－3－O－α－L－鼠李糖的含量最高，槲皮素与
山柰酚含量最低，其变化可能受土壤条件、气候差
异、城市污染等影响而产生不同程度的升高或降低。
参考文献
［1］ PAN LT(潘炉台)． Medicinal Pteridophytes in Guizhou(贵州药
用蕨类植物) ［M］． Guiyang(贵阳) :Guizhou Science and Tech-
nology Press(贵州科技出版社) ，2012:76
［2］ LU KM(陆科敏)． Dong Nationality Medicine(侗族医学) ［M］．
Guiyang(贵阳) :Guizhou Science and Technology Press(贵州科
技出版社) ，1992:366
［3］ LI XL，CHENG X，YANG LM，et al． Dichotomains A and B:two
new highly oxygenated phenolic derivatives from Dicranopteris
dichotoma［J］． Org Lett，2006，8(9) :1937
［4］ TADASHI A，TADASHI O． Biologically active clerodane － type
diterpene glycosides from the root－ stalks of Dicranopteris pedata
［J］． Phytochemistry，1997，46(5) :839
［5］ HAMID LS，KIYOTAKA M，TAKAYUKI S． Biologically active
clerodane－type diterpene alcohol and its glycosides form the root－
stalksof ferns［J］． J Chem Soc Perkin Trans，1992(1) :781
［6］ ＲAJA DP，MANICKAM VS，de BＲITTO AJ，et al． Chemical and
chemotaxonomical studies on Dicranopteris species［J］． Chem
Pharm Bull，1995，43(10) :1800
［7］ YOSHIKI K，MASAFUMI M． Tannins and related compounds iso-
lation and characterization of proanthocyanidins with an intramo-
lecularly doubly－ linked unit from the ferm，Dicranopteris pedata
Houtt［J］． Chem Pharm Bull，1990，38(4) :856
［8］ SU YC(苏育才)． Extraction of Dicranopteris dichotoma polysac-
charides and its antibiotic activities(芒萁多糖提取及抗菌活性
初步研究) ［J］． Subtrop Plant Sci(亚热带植物科学) ，2005，34
(2) :43
［9］ YUAN YＲ(袁宜如) ，YANG F(杨芳) ，LI XY(李晓云)． The
progress of Dicranopteris allelopathy(芒萁化感作用研究进展)
［J］． Mod Agric Sci Technol(现代农业科技) ，2009(3) :18
［10］ TIAN ZK(田振坤) ，GU YY(顾媛媛) ，SONG CG(宋成贵) ，et
al． Determination of content of eldrin，quertetin and kaempferol in
Impatiens balsamina by HPLC(HPLC 测定凤仙透骨草中的芦
丁、槲皮素和山奈酚的含量) ［J］． Chin J Exp Tradit Med Form
(中国实验方剂学) ，2012，18(18) :105
［11］ ZHAO Y(赵亚) ，JIIN HX(金弘昕) ，HUANG S(黄松) ，et al．
Simultaneous determination of four flavonoid glycosides in extracts
of Folium Lithocarpi Polystachyi by HPLC(HPLC法同时测定多
穗柯提取物中 4 种黄酮苷类成分的含量) ［J］． Tradit Chin
Drug Ｒes Clin Pharmacol(中药新药与临床药理) ，2013，24
(1) :88
［12］ ZHANG X(张欣) ，ZHANG CF(张春风) ，QI DL(祁东利) ，et
al． Simultaneous determination of seven compounds in Eucommiae
Folium by HPLC(HPLC同时测定杜仲叶中 7 种成分的含量)
［J］． J China Pharm Univ(中国药科大学学报) ，2012，43(5) :
435
［13］ XUYL，DONG Q，HU FZ． Simultaneous quantitative determination
of eight active components in Polygonum multiflorum Thunb． by
ＲP－HPLC［J］． J Chin Pharm Sci，2009，18(4) :358
［14］ LIU ZB(刘志标)． The orthogonal experiment method optimiza-
tion extraction technology of total flavonoids in Kaempferia
galanga L．(正交实验法优选山奈中总黄酮的提取工艺)
［J］． Asia－Pacific Tradit Med(亚太传统医药) ，2013，9(2) :25
［15］ YIN L(尹丽) ，GUO XH(郭小慧)． Optimization of flavonoid
extraction technology of orthogonal from Ginkgo Folium and its
antioxidation ability(银杏叶总黄酮正交提取工艺优化及其抗
氧化能力抑制亚硝化反应研究) ［J］． Chin J Exp Tradit Med
Form(中国实验方剂学杂志) ，2013，19(18) :260
［16］ BI ＲL(毕荣璐) ，LIU XY(刘祥义)． Ｒeflux extraction of
flavonoids from the Melaleuca ahemifolia(澳洲茶树黄酮提取研
究) ［J］． J Anhui Agric Sci(安徽农业科学) ，2014，42(7) :2126
(本文于 2015 年 1 月 22 日收到)
—5112—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2015，35(12)