全 文 ：临床要求 ,但准确性存在不可比性 ,需要采取整改措施
进行纠正。临床标本比对有偏倚仍可采取校正因子
(给定斜率和截距)等办法纠正 ,但需重做线性试验等。
参考文献
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6　冯仁丰 ,主编.临床检验管理技术基础.上海:上海科学文献出版
社 , 2003.106～ 136
(收稿日期:2005-01-26　编辑:张素文)
　＊教育部科学技术研究重点项目(编号:205114);广东省自然科学
基金资助项目(编号:036736);广东省中医药局科研课题资助项目
(编号:103074);湛江市 2003年科技招标资助项目
半边旗 5F对瘢痕成纤维细胞增殖和
凋亡的影响＊
张培华　罗少军　汤少明　肖佐环　左　强　李　瑾
广东医学院附属医院整形外科(广东湛江 524001)
　　【摘要】　目的　通过对天然药物半边旗 5F对瘢痕成纤维细胞凋亡作用的研究 , 以期探寻新的治疗病理性瘢
痕的有效药物。方法　以四甲基偶氮唑(MTT)法 、流式细胞术和原位末端标记技术检测半边旗 5F对成纤维细胞
增殖和凋亡的影响。结果　半边旗 5F对成纤维细胞的增殖具有显著的抑制作用 , 且呈现浓度和时间依赖性。采
用流式细胞术和 TUNEL法检测凋亡指数 , 均呈剂量依赖性增高(P<0.05)。结论　半边旗 5F 对瘢痕成纤维细胞
的增殖具有显著的抑制作用 ,并且能够诱导其发生凋亡 ,为寻找有效治疗增生性瘢痕的药物进行了新的尝试。
【关键词】　半边旗　成纤维细胞　凋亡
Effect of 5F from Pteris semipinnata L.on proliferation and apoptosis of scar fibroblasts　Zhang Peihua , Luo Shaojun ,
Tang Shaoming , et al.Department of PlasticSurgery , First Affiliated Hospital , Guangdong Medical College , Zhanjiang 524001
【Abstract】　Objective　To study the effect of herbal medicine Pteris semipinnata L on proliferation and apoptosis of scar
-derived fibroblasts and search for drugs for human pathological scar.Methods　Fibroblasts were cultured as an experimental
model and the effect of Pteris semipinnata L was examined.Cell proliferation was determined by MTT assay , and apoptosis of fi-
broblasts induced by Pteris semipinnata L was analyzed by flow cytometry and TUNEL.Results　Pteris semipinnata L significant-
ly inhibited the proliferation of fibroblasts , and elicited apoptosis of cultured fibroblasts(P<0.05).Conclusion　Pteris semipin-
nata L can significantly inhibit proliferation and induce apoptosis of cultured fibroblasts , suggesting its potential role as a new drug
for the treatment of pathological scar.
【Key words】　Pteris semipinnata L　Fibroblasts　Apoptosis
　　病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩 ,是以成
纤维细胞异常增殖 、胶原大量合成 、细胞外基质过度沉
积为组织学特点的皮肤纤维增生性疾病。其发病率较
高 ,是影响烧伤和创伤患者康复的一大难题。成纤维
细胞(FB)是参与瘢痕形成的主要细胞。最近研究表
明 ,细胞程序性死亡或细胞凋亡与病理性瘢痕的形成 、
消退过程密切相关[ 1 , 2] 。通过调控成纤维细胞(FB)凋
亡有望为有效防治病理性瘢痕开辟新道路。本实验选
用从天然药物半边旗中提取的一种活性成分———二萜
类化合物 5F作用于 FB ,探讨 5F抑制瘢痕增生的可能
机制 ,以期为病理性瘢痕的防治提供实验依据。
1　材料与方法
1.1　药物试剂　半边旗 5F由广东医学院天然药物研
究与开发重点实验室提供 ,为白色针状结晶 ,使用前制
成钠盐。DMEM 培养基(Gibco公司);四甲基偶氮唑盐
(MTT , Sigma 公司);TDT(Santa Cruz U.S.A);DIG -
dUTP(Santa Cruz U.S .A);Anti-DIG-Biotin(Santa Cruz
U.S.A);SABC(武汉 Boster公司);蛋白酶 K(Sigma U.S .
A)。
1.2　FB的来源　取自本科室患者手术切除的病理性
瘢痕组织 ,年龄 5～ 40岁 ,瘢痕生长时间为 3个月至 32
年 ,取材部位为颜面 、前胸 、四肢等。
1.3　实验方法
1.3.1　FB的培养 　在无菌条件下 ,将术中取下的瘢
·773·广东医学　2005年 6月 第 26卷第 6期
DOI :10.13820/j.cnki.gdyx.2005.06.029
痕组织剪除结缔组织及表皮 ,剪成约 0.5 ～ 1 mm3 的组
织块 ,接种于 50 ml培养瓶 ,具体参考 Lu等[ 3]的方法进
行 FB原代及传代培养 ,实验选用第 3 ～ 8代细胞。
1.3.2　半边旗 5F对 FB增殖的影响　采用改良MTT
比色法[ 4]测定 ,将 FB接种于 96孔培养板 ,每孔 1×104
个细胞 ,加入 100 ml培养基。24 h 后更换培养基并加
入不同 5F ,同种药物浓度共做 8 个平行孔 ,以不加药组
为对照。于加药后 24 , 48 , 72 h ,用酶标仪检测 A值 ,检
测波长 570 nm ,参考波长 630 nm 。抑制率(IR)=(1-
用药组A 值/对照组A 值)×100%。
1.3.3　FCM检测细胞周期 　分别收集不同药物浓度
(0 , 20 , 40 , 80 μg/ml)作用 24 h的 FB ,调整其个数达 1×
106/ml 。加冷 PBS 洗涤离心 2次 , 70%冰乙醇 4 ℃固
定保存。PBS洗涤离心 2次去除乙醇 ,加入 PI染液(含
PI50 μg/ml、Rnase 100 μg/ml 、Triton-X100 0.1%、柠檬
酸钠 1 mg/ml 、0.9%NS), 4 ℃避光染 30 min , 200 目尼
龙网过滤 ,上机作 FCM检测。采用 488 nm激发波长检
测细胞核中 PI荧光强度 ,打印 DNA 含量分布组方图 ,
自动拟合细胞周期各时相比例。
1.3.4　TUNEL法检测凋亡细胞 　参考文献[ 5] 方法 ,
主要步骤:①实验分组:将 FB以 1×109/L密度接种于
200 ml培养瓶中 ,培养 48 h 后。更换培养基 ,加入不同
浓度半边旗 5F共同培养 24 h。 ②样本处理:收集 FB ,
离心后计数达 106。0.1%多聚赖氨酸处理玻片后 ,细
胞涂片。细胞涂片干燥 ,用 4%多聚甲醛 10.1 MPBS
(pH 7.2)室温下固定 30 min。依次 PBS 、三蒸水洗涤 、
干燥备用。 ③0.3%H2O2甲醇液处理后加复合消化液。
④加含有 TdT和 DIG-dUTP的标记缓冲液。 ⑤加 Anti
-DIG-Biotin。 ⑥加 SABC后 ,用 DAB-HCL显色。光
镜下观察正常及凋亡阳性细胞并拍照 ,同前计算凋亡
指数。
1.4　统计学方法　使用 SPSS 11.0 软件 ,采用单因素
方差分析后 ,多个实验组和对照组比较用最小显著差
法(LSD)法检验。
2　结果
2.1　半边旗 5F对 FB增殖的影响　半边旗 5F对体外
培养 FB生长增殖具有明显的抑制作用 ,随药物浓度增
高和作用时间延长 ,抑制作用增强 ,见表 1。
表 1　半边旗 5F 对瘢痕成纤维细胞增殖的影响
( x ±s)%
浓度(μg/ml) 抑制率
24 h 48 h 72 h
　0(对照) 34.32±0.11 58.22±0.09 70.22±0.16
20 53.56±0.12 77.52±0.12 85.12±0.15
40 64.23±0.13 84.17±0.16 89.47±0.12
80 71.02±0.19 94.26±0.22 97.79±0.20
　与对照组比较 P<0.05
2.2　对 FB细胞周期的调节　FCM 检测分析显示 ,随
着用药浓度增大 ,G1期细胞百分数增多(P<0.05),而
S ,G2期的细胞含量逐渐减少(P<0.05)。计算增殖指
数 PI=(S +G2)/(G1 +S+G2),可见随着用药浓度增
大时 FB增殖指数呈下降趋势(P<0.05),见表 2。
表 2　半边旗 5F作用于 FB周期各时相细胞百分率
( x±s)%
浓度(μg/ml) G1 S G2/M PI
0(对照) 71.22±3.56 11.60±3.75 18.63±1.85 29.07±1.20
20 81.30±1.41 9.56±0.92 10.50±1.25 19.57±1.43
40 85.20±1.66 4.19±0.45 10.20±1.31 14.30±2.12
80 88.23±1.68 1.73±0.23 9.03±0.22 11.83±0.93
　与对照比较 P<0.05
2.3　TUNEL法检测 FB凋亡　正常 FB呈紫蓝色 ,形态
规则。用药组 FB可见棕黄色典型凋亡小体 ,形态各
异 ,呈新月型 、花环状 、放射状等。细胞皱缩 ,胞核明显
固缩 、断裂。随着用药剂量的增加 ,出现凋亡小体的细
胞明显增多 ,凋亡指数呈剂量依赖性见表 3。
表 3　TUNREL检测FB凋亡指数(n=24)( x±s)%
浓度(μg/ml) AI
0(对照) 4.65±1.03
20 12.06±1.23
40 25.12±1.32
80 43.86±1.28
　与对照组比较 P<0.05
3　讨论
半边旗(Pteris semipinnata L)是真蕨目凤尾蕨科植
物 ,其提取物二萜类化合物 5F具有显著的体内外抗肿
瘤活性 ,且毒副作用小[ 6] ,有关其在瘢痕治疗的研究报
道迄今尚少见。近年来研究认为:成纤维细胞是瘢痕
形成 、增生 、挛缩的功能性细胞 ,其增殖 、活化 、分化 、凋
亡的调控异常直接导致病理性瘢痕的形成。因此 ,如
何有效地调节控制成纤维细胞的增殖 、凋亡和功能活
性 ,成为瘢痕研究领域的一大热点。含α,β-亚甲基环
戊酮结构的化合物可经 Michael加成反应与含巯基的
酶结合 ,导致该酶失活 ,从而显示这类化合物的细胞毒
作用 ,半边旗 5F含有α,β-亚甲基环戊酮结构 ,结合实
验中形态学观察及MTT 结果提示 5F 能够诱导 FB凋
亡 ,抑制其生长增殖。由此推测半边旗 5F抑制 FB增
殖并诱导其凋亡的作用可能与该化学结构有关。
近来研究发现瘢痕 FB增殖和凋亡平衡受损 ,提示
细胞凋亡与增生性瘢痕形成的密切关系。细胞周期的
分布可以直观地反映细胞群体的增殖状况 ,应用流式
细胞仪定量分析细胞周期的分布是近年来一项新的细
胞学技术 ,能快速 、准确地研究任何类型细胞的周期分
布规律。本研究结果表明 ,半边旗 5F可剂量依赖性降
·774· Guangdong Medical Journal　Jun.2005 , Vol.26 , No.6
低FB增殖指数并诱导 FB发生凋亡。分别用 0(对
照), 20 ,40 ,80 μg/ml 半边旗 5F处理 FB 24 h ,随着用药
剂量增加 ,G1 期细胞数量增多 , S 和 G2 期细胞含量逐
渐减少 ,说明半边旗 5F能阻断 FB从 G1进入 S 期 ,使
细胞停滞在 G1期 ,从而抑制细胞的增殖过程。由此可
见 ,半边旗 5F通过调节细胞周期并诱导细胞凋亡从而
抑制瘢痕 FB的生长增殖。该方法检测凋亡特异性极
高。TUNEL技术是基于对细胞凋亡分子机制的认识 ,
用 TdT将生物素化的 dUTP 标记至 3′-末端。该方法
结合了组织化学的方法 ,定位准确 ,可早期发现凋亡 ,
具有较高的灵敏性。本实验结果表明 ,半边旗 5F可剂
量依赖性提高凋亡指数 ,镜下可见棕黄色典型凋亡小
体 ,从 40 μg/ml 浓度开始凋亡细胞显著增多。有关半
边旗 5F 通过何种机制诱导 FB发生凋亡 ,有待进一步
研究。
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(收稿日期:2005-03-25　编辑:庄晓文)
　＊教育部留学回国人员科研启动基金资助项目(编号:教外司留
[ 2004] 527)
肺叶切除作为一种肺减容术方法的可行性＊
郑顺利1　孙上云1　马小红2　梁　红1
暨南大学附属第一医院 1胸心外科 , 2动物实验室(广州 510630)
　　【摘要】　目的　探讨肺叶切除作为一种肺减容术方法的可行性。方法　20 只狗分为两组 , 分别用木瓜蛋白
酶建立一种以广泛肺气肿改变为特征的动物模型(均质型)和一种以右上叶肺气肿改变为主的动物模型(异质
型), 模型建立成功后均行右上肺叶切除 , 通过检测基础值 、肺气肿后和术后 12 周的肺功能 , 比较两种模型在肺气
肿后和术后 12周的肺功能改变。结果　肺气肿后的肺总量(TLC)两组均为基础值的 120%～ 125%, 两组术后 12
周的肺总量均较肺气肿后明显下降(P<0.05),术后 12 周两组间的差异有显著性(P <0.05);两组肺气肿后的功
能残气量(FRC)明显高于基础值和术后 12周(P <0.05);两种类型的 3个时期的残气量(RV)差异有显著性(P <
0.05), 术后 12周的 RV虽比肺气肿后有回落 , 但仍未能恢复到基础值水平;术后12周第 1 秒用力呼气量占用力肺
活量的百分比(FEV1%)异质型优于均质型(P<0.05);两种类型的压力容量(P-V)曲线均显示肺气肿后曲线较基
础值曲线向左上方移位 ,术后 12 周又重回基础值曲线附近 , 其差异有显著性(P<0.05)。均质型组的围术期病死率
为9.1%,异质型组为0。结论　异质型肺气肿术后的肺功能改善优于均质型 ,且病死率较低 , 因此 ,如肺气肿病变或
其他病变(如肺癌)集中于1 个肺叶 , 使该肺叶失去大部分肺功能时, 可考虑肺叶切除作为一种肺减容术方法。
【关键词】　肺减容术　肺气肿模型　肺叶切除术　肺功能
　　本文通过制作相对均质性改变的和以右上叶肺气
肿改变为主的两种狗肺气肿模型 ,比较两组模型在行
右上肺叶切除后的肺功能改变 ,探讨肺叶切除作为一
种肺减容术方法的可行性。
1　材料与方法
1.1　实验动物　20 只狗 ,随机分为两组 ,每组 10只 ,
用木瓜蛋白酶制作肺气肿模型 ,一组为相对均质性改
变的肺气肿(均质型),另一组为以右上肺叶改变为主的
肺气肿(异质型);模型制作成功后 ,均行右上肺叶切除 ,
并检测未治疗前 、肺气肿后以及术后 12周的肺功能。
1.2　肺功能的检测　20只狗被麻醉后 ,被置于仰卧
位 ,气管插管 ,连上呼吸机。用留置食管球囊的方法检
测胸膜腔压力(Ppl),气道压力(Paw)通过气管插管的
侧孔连于换能器获得;气道与胸膜腔压差(Ptp)为 Ptp
=Paw-Ppl。肺总量(TLC)、功能残气量(FRC)和残气
量(RV)的检测采用改良Mink等[ 1]的方法 ,应用压力补
偿容量转换体积扫描仪获得 TLC ,FRC和 RV 。
　　压力容量曲线的制作由示波器上获得 ,第 1 秒用
力呼气量(FEV1)以相对于用力肺活量(FVC)的比值
(FEV1%)表示。
1.3　肺气肿模型的制作 　①均质型肺气肿模型的制
·775·广东医学　2005年 6月 第 26卷第 6期