全 文 ：半边旗二萜类化合物 5F 对人翼状胬肉
成纤维细胞增殖周期和 Ki-67表达的影响
陈毓东 ,王映芬
(广东医学院附属医院眼科 , 广东 湛江 524001)
摘　要:目的:观察中药半边旗二萜类化合物 5F对体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞(HPF)增殖周期和 Ki-67 表达的影
响。方法:用流式细胞仪(FCM)分析不同浓度 5F对 HPF 周期分布 、免疫细胞化学法(ICH)检测 5F 对增殖指数 Ki-67 抗原的
影响。结果:用药后 HPF 停滞于 G1 期 , S 、G2/M 期细胞减少;Ki-67 阳性表达率对照组为(26.16±1.26)%, 5F 浓度 8 μg/ml
时下降 ,在 128 μg/ ml时降至(4.10±0.63)%。各用药组与对照组比较均有显著性差异(P <0.01)。各用药组间两两比较有
显著性差异(P<0.01)。结论:5F 对 HPF 增殖的抑制作用与细胞周期 、Ki-67 阳性表达降低有关。
　　关键词:成纤维细胞;半边旗;细胞周期;翼状胬肉/免疫学
中图分类号:R777.33　　文献标识码:A　　文章编号:1004-4469(2002)05-0305-03
The ef fect of diterpenoid compound 5F of Peris semipinnata L on the changes of the cell cycle and expressions of Ki-67 in
fibroblasts of human pterygium in vitro/CHEN Yu-dong … ∥Ophthalmol CHN.-2002 , 11(5)-305 ～ 307(Depar tment of
Ophthalmology , Affiliated Hospital of Guangdong Medical College , Zhanjiang Guangdong 524001)
Abstract:Objective:To observe the effect of diterpenoid compound 5F of Peris semipinnata L on the proliferative cell cycle and
expressions of Ki-67 in cultured human pterygium fibroblasts(HPF).Methods:The changes of the cell cycles of HPFs were evaluated
w ith flow cytometry(FCM)and the expression of K i-67 w as determined with SP method.Results:5F ar rested most of cells at the
end of G1 stage , and the cells in S and G2/M phases w ere gradually diminished.Immunocy tochemical stain showed that the expression
of K i-67 in HPFs w as(26.16±1.26)% in control g roups , decreased at the concentration of 8μg/ml of 5F , and diminished to(4.10
±0.63)% at 128μg/ml.The differences were significant between these groups(P <0.01).Conclusion:The inhibitory effect of 5F
on HPFs may due to the arrest in cell cy cle and the decreased expression o f K i-67.
　　Key words:fibroblasts;Peris semipinnata L;cell cy cle;pterygium/ immunology
收稿日期:2001-12-26;修订日期:2002-02-20
　　眼部过度增殖的成纤维细胞(f ibrablasts ,FB)和
沉积的胶原致局部瘢痕形成是决定增生性眼病生物
学行为的重要因素之一 ,增殖活性的测定可反映甚
至预测病变发展趋势 ,如增殖速度 、程度或收缩 、牵
拉 、瘢痕化等。导致病理性 FB 过度增殖的原因可
能是增殖-凋亡调控失衡[ 1] 。本实验用流式细胞技
术(FCM)、免疫细胞化学法(ICH),检测中药半边旗
二萜类化合物 5F 对体外培养人翼状胬肉成纤维细
胞(HPF)增殖周期和时相分布的变化 、药物对其增
殖指标 Ki-67表达的影响 ,初步探讨病理增殖细胞
生物学机制 、5F 对 HPF 细胞动力学改变 。
1　材料和方法
1.1　仪器 、试剂
流式细胞仪(COWTER CO.USA),荧光/光学
显微镜 ,鼠抗人Ki-67单克隆抗体 1∶50(福州迈新生
物公司)鼠SP Kit:链霉素抗生物素蛋白-过氧化物
酶免疫组化染色试剂盒 。
1.2　方法
对我科 2001 年 3月手术切除新鲜翼状胬肉标
本(无局部特殊用药史)于培养板进行体外孵育 、贴
壁 ,传 3 ～ 6代。光镜形态学鉴定为成纤维细胞 。用
药为4 、16 、64μg/ml浓度梯度5F 分别处理HPF ,设
空白对照组(不加药),每组各 3瓶 ,作用 48h 收集细
胞 。实验重复 2次 。
1.2.1　FCM检测 　收集药物作用 HPF ,洗涤 、固
定 、消化 、染色 、过滤 ,上机 FCM 测试。激发波长
630 nm ,检测 DNA 含量分布。
1.2.2　ICH法检测 Ki-67的表达　收集 5F 为 8 、
32 、128 μg/ml作用 HPF ,洗涤 、涂片 、固定 , PBS 代
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替一抗 ,常规 Ki-67 染色 、显色 、复染 、脱水 、封片 。
每一玻片任取 5个视野视察。以直肠癌细胞为阳性
对照(染色阳性细胞更明显 、易观察),核着色 ,核浆
棕黄 。
1.3　统计学
用SPSS 8.0作统计描述。多个样本均数用单
因素方差分析 ,实验组与对照组均数两两比较 ,用
Homogeneity方差齐次检验 ,最小显著差法(LSD)。
2　结果
2.1　5F作用 HPF周期动力学
根据 FCM 检测 5F 浓度为 4 、16 、64 μg/ml作用
HPF后 DNA含量分布 ,分析 HPF 各时相细胞影响
结果如下(表 1 、图 1)。
表 1　5F作用于 HPF 周期各时相细胞百分率( x±s , n=6)
组别 G1(%) S(%) G2/M(%) PI(%)
A 71.87±1.38 8.60±1.25 19.70±1.97 28
B 82.00±1.83a 7.10±0.61a 10.90±2.43a 18
C 86.10±1.15a 5.20±1.05a 8.67±2.21a 14
D 88.63±0.68a 3.20±1.73a 8.13±1.32a 11
　　＊注 A:对照组;B 、C 、D:用药组 ,浓度分别为 4 、16 、64μg/ml。
aP<0.01。
5F 各浓度梯度作用HPF 均影响细胞周期各时
相分布 ,用药浓度加大 , G1期细胞百分率增多 , S 、
G2期细胞含量渐减少 ,增殖指数 PI=(S+G2/M)/
(G1+S+G2/M)随用药浓度增大而下降。
单因素方差分析用药组与对照组比较有显著性
差异(P <0.01)。
2.2　5F作用 HPF中 Ki-67表达(表 2 、图 2)
表 2　不同浓度 5F作用于 HPF Ki-67 的表达( x±s , n=6)
分　　组 5F浓度(μg/ml) 阳性表达率(%)
A 空白 26.16±1.26
B 　8 17.69±0.60
C 32 7.66±0.62
D 128 4.10±0.63
　　＊注:A:对照组;B、C 、D:用药组 , ICH 检测
　　各用药组 Ki-67表达率与对照组比较均有显著
差异(P<0.01),不同浓度组组间两两比较亦有显
著性差异(P<0.01)。提示不同浓度 5F 作用 HPF
能使 Ki-67表达下调 ,随药物浓度增加 Ki-67 阳性
率明显降低(图 3 ～ 7 ,400×)。
3　讨论
　　细胞周期为研究其生长行为提供信息 ,直观反
应群体的增殖状况 。其中决定周期长短主要是 G1
间期 ,存在决定细胞生长的控制点及药物等因素作
用的敏感点 。与 DNA合成有关的多种蛋白成分参
与调控有丝分裂 ,统称为“U 蛋白” ,它使 DNA聚合
酶活性急剧上升[ 2] ;S 期(分裂期)合成 DNA 、RNA
聚合酶 ,G2/M 期为 RNA 合成及染色体螺旋化过
程 ,许多 FB均有这一特点[ 3] 。HPFs属增殖旺盛的
细胞 ,G1期持续短 ,S 、G2/M 增殖期细胞比例高 ,合
成 DNA活跃[ 4] 。
本研究采用的中药半边旗乙醇抽提的二萜类化
合物 5F(C20H28O4)为白色针状结晶 ,化学名:11α-羟
基-15-氧-16-烯-对映贝壳杉烷-19-酸 ,简称 5F ,在多
项实验中发现具广泛抗肿瘤生物学功能 , 对正常淋
巴细胞无毒作用[ 5] 。现选择细胞周期为观测指标 ,
分析 5F 对 HPFs增殖影响机制。FCM 对每个细胞
DNA记录分析 ,结果二倍体 G1峰细胞数随 5F 浓
度 4 ,16 ,64 μg/ml增加而增多 ,四倍体G2峰及 S期
细胞则相应减少 ,与对照组比较均显著差异(P <
0.01)。同时 ,随 5F 浓度增高 ,细胞群体增殖受抑
制者百分率明显增高 ,提示 5F 在体外作用 HPF 表
现出一定敏感性 。S 期减少示 DNA 受损 , 可能与
FB增殖有关基因的转录与表达受抑制有关 ,如周期
素依赖性蛋白激酶 、GTP 结合蛋白的活性降低等 ,
从而使更多细胞停滞在 G1期。
某些化学抑制剂如阿非迪霉素[ 6] 、布美他尼[ 7]
可逆性抑制 FB于G1期末 ,致G1期细胞比例升高。
本结果发现用药后 ,时相分布的改变呈周期阻滞 ,与
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上述化学抑制结果相似。可能用 5F 后细胞生长缓
慢 、周期延长 ,使停滞 G1的细胞增多 ,影响其 G1向
S 、G2/M 进程 ,随用药浓度增加变化愈明显。同时 ,
大剂量 5F 致细胞坏死 ,产生细胞碎片。提示 5F 作
用HPF 增殖期 ,可能影响DNA合成及细胞分裂 ,直
接抑制增殖 ,将增殖表型的 FB 转化为合成表型 。
这种改变在一定浓度下呈剂量依赖性。本组结果与
李金华[ 8]等研究半边旗有效成分作用肿瘤细胞 G2/
M 期略有差别 ,可能因不同细胞株对该药的效应不
同 ,或因存在其它机制 ,仍有待深入研究 。
Ki-67是细胞周期调控因子 。作为与增生相关
核抗原和反映增殖动力学直接指标 ,是应用广泛的
增殖标记物之一。它于胞核 、静止细胞内不表达 。
除G0及 G1早期 ,整个有丝分裂期都能测到 ,尤以
M 期最高[ 9] 。有人用 ICH 发现牙周韧带 FB 、肾纤
维化组织 、淋巴细胞 、增殖的视网膜色素上皮 、培养
人 FB及许多增生旺盛的疾病中均有表达 ,其表达
与增殖程度及细胞分化有关 ,与年龄 、性别 、部位无
关[ 10-13] 。本实验对照组 HPF Ki-67 表达率为
26.16%,具一定增殖活性 ,当 5F 用药为 8 、32 、128
μg/ml时 ,阳性率相继下降 ,说明 HPF 增殖力随药
物浓度加大明显受抑 ,这与 FCM 法检测结果一致 ,
从不同角度反映了 5F 对 HPF 增殖具明显抑制作
用。Chiquet曾用质子束照射葡萄膜黑色素瘤时 ,
Ki-67标记明显降低 ,无照射组则增高 ,故认为 Ki-
67阳性表达率明显影响疾病的发展 、预后[ 14] ,对眼
部增生性疾病的防治研究提供了新的信息。
本组 FCM 检测中药 5F 对 HPF 增殖抑制过程
细胞周期的变化 , ICH检测增殖活性 ,结果提示该药
在体外具直接或间接抑制 FB 生长 、增殖的作用 ,为
该药的动物实验与临床实践提供初步实验依据 ,具
一定参考价值。随着研究不断深入 ,该药有望成为
眼部增生性病变的治疗开辟新途径 。
(本文图 3～ 7 见插页 8)
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(本文编辑:邬文兰)
307眼科 2002年第 11卷第 5期　Ophthalmol CHN , 2002 ,Vol 11 ,No.5