全 文 ：文章编号:1000-5277(2005)04-0076-04
海金沙多糖的分离纯化及抗菌活性
苏育才
(福建师范大学化学与材料学院 , 福建 福州　350007)
　　摘要:从海金沙中提取水溶性粗多糖 , 用 Sevag 法脱蛋白后 , 经 DEAE-纤维素 52 柱层析和葡聚糖凝
胶G-200柱层析可得到纯品 , 利用纸片法进行了抑菌实验.结果表明:海金沙多糖显示了不同程度的抗
菌活性 , 对普通变形杆菌和稻瘟病病原菌有相对较强的抑制活性.
关键词:海金沙;多糖;分离;纯化;抗菌活性
中图分类号:Q945　　　文献标识码:A
　收稿日期:2004-11-11
　作者简介:苏育才 (1978—　), 男 , 福建泉州人 , 硕士研究生.
Isolation , Purif ication and Antimicrobial Activities
of the Polysaccharides from Lygodium japonicum
SU Yu-cai
(College of Chemistry and Materials Science , Fujian Normal University , Fuzhou 350007 , China)
Abstract:The crude poly saccharides w ere ext racted f rom Lygodium japonicum by hot w ater.They
w ere deproteinized by Sevag method for several times and purif ied by DEAE-cellulose and Sephadex G-200
chromatography column in turn.They w ere tested fo r the antimicrobial activities using the agar disc dif fu-
sion method.The result showed the polysaccharides f rom Lygodium japonicum had varying amount of ac-
tivi ty against gram positive bacteria and fungi and had strong activi ties against Proteas valgaris Hause and
Piricularia oryzae Cav.
Key words:Lygodium japonicum ;polysaccharide;isolation;purified;antimicrobial activities
蕨类植物是具有维管束的孢子植物 , 全世界现有蕨类植物 12 000种左右 , 多分布于热带 、亚热
带温暖阴湿的森林地带.我国现有 61科 223属 2 600种 , 其中可供药用的大约有 300余种[ 1-2] .药
用蕨类植物分布广泛 , 资源丰富 , 但目前对蕨类植物的研究仅限于临床疗效上 , 且都是采用粗提物
(如水煎剂或醇提制剂), 较少从药效物质基础和生物活性方面去研究其作用机理 , 而药用蕨类在种质
和代谢产物方面均极具多样性 , 采用不同的提取方法和选择不同的受试菌均能产生相异的结果.因
此 , 有必要对药用蕨类植物的有效成分及药理活性进行深入的研究[ 3] .
海金沙 Lygodium japonicum (Thunb.)Sw 是蕨类植物海金沙科 Lygodiaceae 海金沙属 Lygodium
Sw .一年生草质藤本植物 , 别名铁线藤 、左转藤 、 竹园荽 , 分布于我国长江流域及南方各省区 , 多
生于山坡 、林边 、灌木丛 、草地中.全草或者成熟孢子入药 , 味甘淡 , 性寒 , 有清热解毒 , 利水通淋
的功效 , 为治疗尿路感染 、尿路结石 、 湿热肿满 、肾炎水肿 、 肠炎痢疾 、 皮肤湿疹 、咽喉肿痛等症的
常用中药[ 4] ;植株具缠绕习性 , 是垂直绿化的好材料.本文拟从蕨类植物海金沙中提取 、 分离纯化
出多糖成分 , 并对其抗菌活性进行初步研究 , 以期为药用蕨类植物的开发利用提供有用的资料.
1　材料与方法
1.1　材料
第 21 卷　第 4 期 福建师范大学学报 (自然科学版) Vol.21　No.4
2005 年 12 月 Journal of Fujian Normal University (Natural Science Edition) Dec.2005
1.1.1　采集地点
海金沙采自福建师范大学长安山.
1.1.2　实验菌种
受试菌包括 4种细菌和 4种真菌 , 其中革兰氏阳性菌有枯草芽孢杆菌 (Baci llus subt ilis Cohn)、
甘薯薯瘟病原菌 (Fasarium oxyssporam)(植物病原菌)、革兰氏阴性菌有大肠杆菌 (Escherichia coli
Castellani et Chalmers)、 普通变形杆菌 (Proteas valgaris Hauser).真菌有啤酒酵母 (Saccharomyces
carlsbergengensis Hansen)、 中华根霉 (Rhizopus chinensis Saito)、 稻瘟病病原菌 (Piricularia oryzae
Cav)(植物病原菌)、 甘蔗黑穗病病原菌 (Usti lagu sci tam inea Sydow)(植物病原菌).菌种均来自福
建师范大学生物工程学院微生物实验室和福建农林大学植保系 (植物病原菌).细菌用牛肉膏蛋白胨
培养基培养 , 真菌用马铃薯培养基培养.
1.1.3　试剂和药品
DEAE-纤维素 52为Whatman公司进口分装产品 , SephadexG-200为 Sigma公司产品 , 其余试
剂均为国产分析纯.
1.1.4　实验仪器
BS-160A 自动部分收集器 (上海沪西分析仪器厂), 752紫外分光光度计 (上海第三分析仪器
厂), TG L-16G 台式高速冷冻离心机 (上海安亭科学仪器厂), PHS-22 型精密酸度计 (上海精密
科学仪器有限公司), 200型精密电子天平 (美国双杰兄弟有限公司).
1.2　方法
1.2.1　海金沙多糖的提取[ 5]
海金沙新鲜样品洗净 , 晾干并经 60℃烘干 , 粉碎 , 称取干粉按 1∶20 加水在 100℃水浴中浸泡 3
h , 离心 , 去滤渣 , 取上清液 , 浓缩后加 3倍体积的无水乙醇 , 离心取沉淀物 , 配成 1%溶液 , 用 Se-
vag 法 V (氯仿)∶V (正丁醇)=4∶1脱蛋白后 , 冷冻干燥得多糖粗品.
1.2.2　海金沙多糖的分离
海金沙多糖粗品复溶透析后 , 透析内液浓缩上DEAE-纤维素52柱层析 (1.6×30 cm), 流速30
mL/h , 每管收集 6 mL , 苯酚-硫酸法检测糖含量 , 用 0.5 mol/ L 氯化钠溶液洗脱 , 获得 1个组分
F 1 , 透析除盐并冷冻干燥.
1.2.3　简单理化性质分析
糖含量测定[ 6] :采用苯酚-硫酸法 , 以葡萄糖为标准物 , 721分光光度计作比色分析.
蛋白质含量测定:采用考马氏亮蓝染色法 , 按文献 [ 7] 的方法操作 , 以牛血清白蛋白为对照 ,
制作标准曲线.
SO4
2+含量测定[ 6] :以氯化钡-明胶比色法测定.
pH值测定:将粗多糖配成 1%溶液 , 以 pHS酸度计室温测定.
1.2.4　多糖纯度的鉴定
纸层析法:取新华滤纸 (3 cm×20 cm), 距端点 1 cm处的中部以水溶液点样 , 展开剂为 V (正
丁醇)∶V (浓氨水)∶V (水)=40∶50∶5饱和 2 h以上 , 室温展开 6 h , 取出后烘干 , 用 0.5%甲苯
胺蓝液染色 , 立即用无水乙醇漂洗至背景褪色.
紫外检测:收集分离多糖 F 1组分的最高峰 , 配成 0.1%水溶液 , 在 200 ～ 400 nm 波长间进行扫
描.
葡聚糖凝胶 G-200色谱法:选用 (1.6 cm ×30 cm)柱型 , 用蒸馏水平衡 , 上样质量浓度为 5
mg/mL , 每管 15 min分部收集 , 苯酚-硫酸法检测 , 以管号为横坐标 , 光密度为纵坐标 , 绘制洗脱
曲线.
1.2.5　抗菌实验
采用圆形纸片法[ 8] :分别刮取供试菌 (8种)菌苔于 5 mL 无菌水中 , 振荡摇匀得菌悬液 , 倒入
溶化并冷却至 40 ～ 45℃的相应培养基中 , 摇匀后 , 迅速分装于培养皿中 , 待凝固后 , 取已消毒过的
77第 4 期 苏育才:海金沙多糖的分离纯化及抗菌活性
圆形滤纸 ( 6 mm)分别用移液枪注入多糖提取液 20 μL , 略干后贴于培养基平板上 , 同时作一溶
剂空白对照.置恒温培养箱中培养 (细菌36 ～ 37℃, 18 ～ 24 h;真菌28 ～ 30℃, 48 ～ 72 h)后分别观
察结果 , 测量抑菌圈宽度的大小.以上步骤均按无菌条件操作 , 每个样品设 2个平行样 , 结果取平均
值.
2　结果与分析
2.1　多糖的提取与分离
100 g海金沙干粉水提除蛋白后可得到 4.4 g 粗多糖 , 得率为 4.4%, 经 DEAE-纤维素 52柱层
析分离可得到 1种酸性糖组分 F 1 (图 1).
2.2　简单理化性质
海金沙粗多糖为棕黄色粉末状固体 , 易溶于水 , 不溶于高浓度乙醇 、 乙酸乙酯 、 丙酮等有机试
剂 , 常温放置易吸潮.测得其粗多糖水溶液 pH 值为 6.48 , 糖含量为 22.5%, 硫酸根含量为 12.5%,
蛋白质含量为 8.15%.
2.3　纯度鉴定
纸层析法测定:在紫外灯下观察 , F1 只有一个斑点.
紫外检测:经紫外扫描在 260 nm 和 280 nm波长处均未见核酸和蛋白质紫外吸收峰 , 这说明 F 1
不含有蛋白质和核酸等杂质.
葡聚糖凝胶 G-200 色谱法:F1 在 SephadexG-200柱上洗脱曲线呈单一峰 (图 2), 由此可说
明 , 海金沙多糖分离获得的组分 F1 为均一组分.
图 1　海金沙多糖在 DEAE-纤维
素 52柱的洗脱曲线
图 2　F1 在 SephadexG-200
柱上的洗脱曲线
2.4　海金沙多糖抗细菌抗真菌活性
海金沙多糖对供试的 4种细菌及 3种真菌都有不同程度的抑制作用 , 具有一定的广谱性.其中 ,
海金沙多糖对变形杆菌抑制作用最大 , 抑菌圈宽度达 9 mm , 其次为稻瘟病病原菌 , 抑菌圈宽度为 8
mm , 对甘蔗黑穗病病原菌没有抑制作用 (表 1).以上结果还表明 , 海金沙多糖对细菌的抑制作用大
于对真菌的抑制作用 , 对革兰氏阳性菌的抑制作用比对革兰氏阴性菌抑制作用更强.
表 1　海金沙多糖抗菌活性
质量浓度
(10mg·mL-1)
抑菌圈/ mm
细菌 真菌
B.s F.o E.c P.v S.c R.c P.o U.s
6.5 4.5 6.5 9.0 6.0 2.0 8.0 0
　　　注:B.s:枯草芽孢杆菌 (Baci llus subt i lis Cohn), F.o:甘薯薯瘟病原菌 (Fasar ium oxyssporam), E.c:大肠杆
菌 (Escherichia coli Castellani et Chalmers), P.v :普通变形杆菌 (Proteas valgaris Hauser), S.c:啤酒酵母
(Saccharomyces carlsbergengensis Hansen), R.c:中华根霉 (Rh izopus chinensis Sai to), P.o:稻瘟病菌 (Pir-
i cular ia oryzae Cav), U.s:甘蔗黑穗病病原菌 (Usti lagu sci tam inea Sydow)
78 福 建 师 范 大 学 学 报(自 然 科 学 版) 第 21 卷
3　讨论
多糖广泛存在于植物 、动物 、 微生物 (细菌和真菌)中 , 来源广泛 , 其中研究较早的是从细菌中
得到的各种荚膜多糖 , 它在医药上主要用于疫苗生产.近几十年来 , 人们发现从植物中 , 特别是具有
中国特色的中草药中提取的多糖具有非常重要与特殊的生理活性 , 这些多糖参与了细胞的各种活动 ,
具有多种多样的生物学功能 , 如参与生物体的免疫调节功能 、 降血糖 、降血脂 、抗炎抗疲劳 、抗衰老
等[ 9] .但对于蕨类多糖提取 、分离纯化及生物活性的研究 , 国内目前较少报道.
用水提法提取 , Sevag 法除蛋白后 , 海金沙粗多糖提取率可达 4.4%, 其硫酸根含量为 12.5%,
而硫酸基对于多糖的理化性质及生物活性都有重要的影响.多种硫酸酯多糖具有独特的医药保健功
能 , 如治疗肿瘤 、肝炎 、 降血脂 、 降血糖 、 促进蛋白质和核酸的生化合成等.1958年 Gerber 首次报
道了硫酸酯多糖具有抗病毒活性 , 它对具有包膜的病毒能产生强大的抑制作用.因此 , 硫酸酯多糖抗
艾滋病毒作用日益受到各国药理学家的重视 , 并在临床上取得了一定的疗效[ 5] .郭凌等[ 10]报道:琼
枝麒麟菜和异枝麒麟菜多糖的抗菌活性与其硫酸基含量相关 , 未水解的琼枝麒麟菜和异枝麒麟菜多糖
无抑菌活性.海金沙硫酸多糖潜在的药用功能值得进一步研究.
庄惠如等[ 3]的研究表明 , 多种蕨类植物具有不同程度的抗菌活性 , 其中不乏优良抗菌药物待选
者 , 而蕨类醇提物的抗真菌活性不如抗细菌活性 , 这与本实验中海金沙多糖抗菌活性相同.药用蕨类
植物成分较复杂 , 含有多种疗效成分 , 因此有必要进行系统地筛选 、提取 、分离纯化有效成分 , 从而
更充分更合理地挖掘其药用价值.
参考文献:
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科学版), 2000 , 16 (3):83-86.
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[ 9] 谭周进 , 谢达平.多糖的研究进展 [ J] .食品科技 , 2002 (3):10-12.
[ 10] 郭凌 , 包惠燕 , 叶绍明.琼枝麒麟菜和异枝麒麟菜硫酸多糖及其水解产物的抑菌作用 [ J] .暨南大学学报 (自
然科学版), 2002 , 23 (3):79-83.
(责任编辑:余　望)
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