全 文 ：兰州 大李李报 (自然抖李报 )
2 1 (生物学杆刊 )` 7 7一 81 . 10 8`
六月雪蛋白水解酶的研究
1
. 六月雪蛋白水解酶的抑菌和抗癌作用
路英华 吴应文 周桂花
摘 要
从 大戟科植物六 月雪 ( Eupb or b i aMv agin al a Pr u sh )乳汁中 提取的 蛋 白水解酶粗品 及
纯品 , 时革 兰氏 阳性菌有明 显抑制生 长作用 , 衬 小 白鼠 肉瘤细胞 S- 18 0及艾氏腹水 瘾细胞有明 显
杀伤作 用 。
六月雪 ( E u p h o r b i a ,M a r g in al a P盯 s h) 又名银边翠 , 大戟科一年生 草 本 植 物 , 有
毒 , 家畜误食后 , 轻则呕吐 、 痉挛 , 重则死亡 。
上文〔 : 。报导在六月雪植株分泌乳汁中 , 分离提纯得六月雪蛋 白水解酶 。 用此酶 静 脉 注
射小自鼠其半致死量 L . D 。 。为 4 . 2毫克 。
用此酶蛋 白做抑菌试验 , 用浓度为 1 0 微克 /毫升的蛋白酶 , 对革兰 氏阳性金色葡萄球菌有
明显抑制作用 。 此外用细胞培养法 , 用此酶对小白鼠肉瘤细胞 S一 1 80 细胞及艾氏腹 水 癌 细
胞有明显杀伤作用 , 为此 , 可考虑用此蛋白酶做抗癌药试用于 动物和临床试验 , 有关六月雪
蛋白酶的抗癌作用国内外未见文献报导 。
材 料 和 方 法
一 、 材料 : 用六 月雪所分泌的乳汁或提得的纯酶作酶制剂 。 金黄色葡萄球菌及大肠杆菌
菌种购自上海工业微生物研究所 , 小白鼠艾氏腹水癌细胞及肉瘤 s一 1 80 癌细胞 由本 系 动 物
教研组惠赠 。
二 、 方法
1
. 细菌培养: 培养基配方如下 : 蛋白脉 6 克 , 酵母膏 3 克 , 牛肉膏 5 克 , 琼酷 20 克 ,
加蒸馏水到 1 0 0 0毫升 , 煮沸过滤 , 15 磅 /厘米 “ 高压灭菌半小时 。 另取菌种革蓝氏阳性金黄色
葡萄球菌及革兰氏阴性大肠杆菌 , 用上述培养基试管斜面 37 ℃培养 18 小时 , 菌种备用 。
在灭菌培养皿中倒入培养基制成平板 , 加入菌种液后用刮铲将菌液刮平 , 或用稀释法将
菌液 1 毫升置培养皿中然后倒入培养液摇匀 , 然后把小钢管等距离放入平皿中 , 在小钢管中
加入酶液或对照液 , 37 ℃培养2 4小时 , 比较有无抑菌圈及其大小 。
2
. 细胞培养〔幻
l ) 培养液采用含有小牛血清 的 16 4 0溶液 , 其成分为 :
1 6 4 0液 、 80 毫升
本文 1 9 85年 7 月 1 3 日收到
DOI : 10. 13885 /j . i ssn. 0455 -2059. 1985. s1. 013
兰 州 大 一 学 学 报 1白 8 5年 1 2月
小牛血清 2 0毫升
青霉素 1 0单位 /毫升
链霉素 1 0微克 /毫升
最后用 7 . 4 %碳酸氢钠校正 P H到 7 . 4使用。
2 )小白鼠艾氏腹水癌细胞的制备 ;接种艾氏腹水癌细胞数天的小白鼠处死后 , 在无菌
操作下 , 取腹水 1毫升加入 1 : 2 0 0。的肝素溶液混匀 , 离心 ( 1。。o转 /分 ) 5 分钟 , 弃去上清 ,
将沉于 管底细胞用 1 毫升培养液混悬 , 然后将此细胞悬浮液用培养液稀 释 成 6 一 10 万 /毫升
细胞液 , 分装于培养小瓶内 , 每瓶 1 毫升 。
3 ) 小白鼠肉瘤细胞 5 1 80 制备 : 在无菌条件下将传代多年的稳定细胞株用培养 液稀 到
约 1 0万 /毫升细胞悬浮液 , 分装于培养小瓶内 , 每瓶 1 毫升 。
3
. 酶液的制备和操作 。
采六月雪新鲜乳汁 , 冰冻过夜 , 次 日取上清液 , 用 O . I M P H 7 . 4磷酸缓冲液稀释含蛋白
酶 5 0 微克 、 1 0 微克 、 50 微克 , 25 微克 /毫升 , 四种浓度 , 在细胞培养一定时间后 , 倾 去 原
培养液 , 加新鲜培养液 0 . 9毫升 , 加入上述不同浓度酶液 0 . 1毫升 (对照组不加 酶 液 , 加。 . 1
毫升中性亨氏液 ) , 轻轻摇匀 , 每个浓度 3 瓶 , 将瓶倾斜成 5 度 , 37 ℃温箱静置培养48 小时 ,
倾去酶液 , 用 1 , 5毫升亨氏液分三次将瓶壁癌细胞冲下 , 1 0 0 0转 /分离心去上清液 , 管底细胞
用 。 . 4%藻红水溶液染色 , 并立即在血球计数盘内 , 按白细胞计数法计数 。
4
. 抑制百分率及 P值的计算 。 按下式计算每毫升未被藻红染色的活 细胞 数 。 每 组 三
瓶 , 每组计数四次 , 求三瓶平均值 。
每毫升内活细胞数 二 四鱼大立鱼鱼垫蜒丝遨遨 又
4
1 0 0 0 0
抑制百分率 = 对照组每毫升平均活细胞数 一 实验组每毫升平均活细胞数对照组每毫升平均 活细胞数 X 1 0 0
P值 : 按组间比较公式求出各组存活细胞数的平均标准误 , 求得 t值 , 查 t表求机率 P值 。
活细胞与总细胞比率 = 每组活细胞数每组总细胞数
为观察细胞在加酶 液后形态变化 , 取 出培养一定时间后的细胞培养液 , 加 甲醇 固 定 ,
G ie m s a染色 , 二 甲苯中使透明后在中性树胶中封藏 。
实 验 结 果
一 、 六月雪蛋 白酶对细菌的抑制作用 .
用革兰 氏阳性金黄色葡萄球菌及革兰氏阴性大肠杆菌均匀接种于平皿培养基内 , 放小钢
管于凝胶上 , 加入粗酶不同浓度 1 0 微克 /毫升 、 50 微克 /毫升 、 25 微克 /毫升及纯酶 1 36 微克 /
毫升 , 各 0 . 5毫升 , 37 ℃培养 24 小时 , 发现各种浓度酶液对金黄色葡萄球菌有明显抑制 生 长
作用 , 其抑菌程度和酶液浓度成正比 。 对大肠杆菌无抑制作用 。 抑制作用见表一
生物学辑刊 六月雪蛋白水解酶的研究 L、`
表 ~ , 井 六月雪酶液抑制金黄色葡萄球菌生长数据幸牛一拼13 6 ( 纯酶 ) 2 . 20
二 、 六月雪蛋 白酶的抗癌作用 、 ` 「 :
六月雪蛋白酶对小白鼠肉瘤细胞的抑制作用见表二 。 卜 六月雪蛋白酶对艾氏腹水癌细胞作
用见表三 。
实验结果的药效估价标准是 : 酶摧对培养癌钾胞的生长抑制百分率的高低 ( 见表四 )〔 . ’
及生物统计上实验组和对照组的存活细胞数是否有明显差异 。
衰二 , 孚 六月雪蛋白醉对小白鼠肉瘤 S一 18 0细胞生长的抑制作用
细胞均值土标准误 抑制率 机 率 活细胞数 /细胞总数
x 10 `
对 照 组
实验组 DS O微克 /毫升
对 照 组
实验组 DI 0微克 /毫升
对 照 组
实验组 50 微克 /毫升
对 照 组
实验组 25微克 /毫升
14 5
,
3士 10 · 2 6
0
.
0士0 . 0 10 D < 0 . 0 1
48
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6 7
0
。
0
14 5
.
3士1 0 . 2 6
6
.
0士 1 , 7 1 < 0 . 0 1
4 8
。
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4 3
14 5
.
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、
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5土0 . 9口 夕6 < 0 . 0 1
4 0
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67
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. … 加. 。士。泣 一 。 : 1 < 0 .刀1
4 6
。
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对 照 组
实验组 (纯酶 ) 13 6微克 /毫升
丫6 . 8土理. 62
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0士0 . 0 回淤 4 6 。 40 ,. 0
说明此酶对小白鼠肉瘤细胞有明显抑彭作用 林
兰 州 大 学 学 报 1 95 8年 1 2月
表三 六月 , 蛋白醉对艾氏腹水店细胞的生长抑制作用
细 胞 均 值
土标准误 ( x DI . )
抑 制 率
动一0<劲和对 照 组
实验组 25微克 /毫升
实验组 5D微克 /毫升
实验组 10 微克 /毫升
实验组 50 微克 /毫升
5
.
8 1士 0 . 29
2
.
10士 0 . 1习
1
.
6 8士 0 . 35
1
.
0 2士 0 . 20
0
.
0 0士 0 . 0 0
8 2
.
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10 0
实验组 (纯酶 )` 36掀乙豪尹 _ } _ 。 .90扑吧_ : _
说明此酶对艾氏腹水癌细胞的生长有明显抑制作用
澎翔{一 有 作 用 作 用 不 肯 定 无 作 用4 8小时 8 1一 1 00 5 1一 80 31一 50 3 0以下
细胞加酶液后的形态变化 , 经显微镜观察 , 酶浓度在 5 0 微克 /毫升时 , 细胞被溶解成碎
片状 。
讨 论
有关六月雪蛋白酶 的抗癌作用 , 迄今未见国内外文献报导 , 因此可作为植物蛋白水解酶
抑菌 、 抗癌的试探药物 , 其作用机制与其他药物有所不同 , 利用癌变细胞膜易被水解酶溶解
的特点 , 使其死亡 。 六月雪对正常细胞的作用 , 除高浓度酶液 5 0 微克 /毫升对正常细胞生长
有 30 一 50 %抑制外 , 其他浓度无抑制作用 , 利用这种差异 , 六月雪蛋白酶可考虑作为抗癌药
物进一步进行动物试验及临床试验 。
〔 1 〕
6 8一 7 6页 。
〔 2 〕
〔 3 〕
参 考 资 料
路英华等 , 六月雪蛋白水解酶的研究 1 . 六月雪蛋白酶的提纯和性质 研究 , 本 刊
全允栩等 , 细胞培养法筛选三尖杉生物碱抗癌作用报告兰大学报 4 , l , ( 19 7了)
朱天 锡等 ; 关子抗肿瘤药物的研究 , 药学通报 1。 , 3 34 ( 1 9 6 3 )
生物学辑刊 六月雪蛋白水解酶的研究1 8
S tu dy o nPr o to el y ti c E nzy m eo f Eu phorb i a
M r agi nal aPus r h
开.T h eI nhib f tio nEf f e e tO nB a e ter i a a nC da ne er
Lu Y 云u g九u aWu i Y nw e nEhou Gu a派hu a
C a刀
T h ePr o teol y ti e e nzy m eis ol a tef dr o m th el a tex o f Eu phorb i aM ar gi a nl a
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. 门
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I n V i t r o C a l l u s In d u e t i o
、
n A n d P l a n t l e t R e g e n e r a t i o n
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e m b r y o i d
.
A b b r a v i a t i o n s
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h y d r o l y s a t e
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