全 文 ：收稿日期:2005-05-09;　修订日期:2005-07-29
作者简介:吕应年(1975-),男(汉族),湖北应城人, 现为广东医学院讲师 ,
硕士学位,主要从事天然活性成分的研究工作.
半边旗中黄酮的提取工艺研究
吕应年 , 邓亦峰 , 梁念慈
(广东医学院广东天然药物研究与开发重点实验室 ,广东湛江　524023)
摘要:目的 确定提取半边旗总黄酮的最佳工艺条件 ,并精制以提高黄酮的含量。方法 采用正交实验法 ,考察溶剂用量、乙
醇浓度 、提取时间以及提取次数对半边旗中总黄酮溶出量的影响 , 确定最佳提取条件 ,然后对半边旗总黄酮进行精制 , 用高
效液相色谱测定已知黄酮的含量。结果 在所考察的因素中, 对半边旗总黄酮提取影响程度为乙醇浓度 >提取次数 >溶剂
用量 >提取时间 ,半边旗总黄酮最佳提取条件为 12倍用量 80%乙醇回流提取 2次、每次回流 2h, 精制后半边旗黄酮含量达
到 84.3%以上。结论 该工艺设计合理 , 操作简单 ,生产成本低廉 ,有较高的工业生产应用价值。
关键词:半边旗;　黄酮;　正交实验;　精制
中图分类号:R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2008)06-1443-02
StudyontheExtractionTechnologyofFlavonoidsinPterissemipinnataL.
L Ying-nian,DENGYi-feng,LIANGNian-ci
(GuangdongMedicalColege, GuangdongKeyLaboratoryforResearchandDevelopmentofNaturalDrugs, Zhan-
jiang524023, China)
Abstract:ObjectiveTooptimizetheextractionconditionsforflavonoidsfromPterissemipinnataL., andrefinetheflavonoidsto
improvethepurity.MethodsOptimizedconditionsincludingethanolquantity, ethanolconcentration, refluxdurationandextraction
timesweredeterminedbytheorthogonaltest.Theflavonoidswererefinedwithdifferentsolutionsandthepuritywasdeterminedby
HPLC.ResultsTheorderoffactorstoafecttheflavonoidextractionwasethanolconcentration>extractiontimes>ethanolquan-
tity>refluxduration.Thebestextractiontechnologywasthat12-foldand80% ethanol, refluxingfor2 houratwaterbathand2
timesofextraction.Thepurityofrefinedflavonoidswasupto84.3%.ConclusionThistechnologyissimple, reasonableandthe
costislower, whichissuitableforindustralization.
Keywords:PterissemipinnataL.;　Flavonoids;　Orthogonaltest;　Refine
　　半边旗 PterissemipinnataL.,又名半边蕨 、半边莲、单边旗 , 系
凤尾蕨科植物 , 是一种南方常用草药 , 始载于《岭南采药录》,称半
边旗。该植物有止血 、生肌 、解毒 、消肿之功效 , 民间用于治疗吐
血 、外伤出血 、发背 、疔疮 、跌打损伤 、目赤肿痛等 [ 1] 。现代研究表
明 ,半边旗中含有挥发油 、萜类 、黄酮 、皂苷等多种物质 [ 2] 。有关半
边旗的药效成分研究主要集中在萜类化合物 [ 3, 4] , 半边旗中黄酮
类物质的研究报道较少。
黄酮类化合物是中草药中一类重要的药效成分 ,具有抗肿瘤 、
抗病毒 、抗氧化 、降血脂等广泛的生物活性 , 天然黄酮主要以游离
的苷元或与糖结合成糖苷的形式存在于植物中。本研究采用正交
实验法考察溶剂用量 、乙醇浓度、提取次数 、提取时间对半边旗总
黄酮溶出量的影响 ,以确定最佳提取条件 ,并研究了半边旗黄酮的
精制方法 ,为合理开发利用半边旗资源提供依据。
1　器材
岛津 LC-10A高效液相色谱仪 (LC-10ATVP泵 , SCL-
10AVP控制器 , SPD-10AVP紫外检测器 , CTO-10AVP柱温箱);
紫外分光光度计(岛津 UV3101PC);分析天平(Metler, AE240);旋
转蒸发仪(上海申越科学仪器公司);四用紫外分析仪(上海顾村
科学器材厂)。芹菜素和木犀草素标准品购于天津尖峰植物提取
物公司 ,甲醇为色谱纯(TEDIACompanyInc.USA),提取及精制用
乙醇 、氯仿 、醋酸乙酯均为分析纯(广州大华试剂公司),其他化学
试剂均为分析纯。半边旗植物采收于广东湛江郊区 , 经广东海洋
大学杨燕君副教授鉴定为半边旗。
2　方法与结果
2.1　半边旗总黄酮的测定
2.1.1　标准曲线绘制 参照文献 [ 5] , 采用紫外分光光度计法并适
当调整。精密称定干燥至恒重的芦丁对照品 2 mg,加适量甲醇溶
解 , 定容到 10ml即得对照品储备液。精密吸取 0.5, 1.0, 2.0, 3.0,
4.0, 5.0 ml对照品储备液于 50ml容量瓶中 ,加甲醇至 20ml,加入
5%亚硝酸钠溶液 2 ml,摇匀, 放置 5 min, 加入 10%硝酸铝溶液 2
ml,摇匀 ,放置 6 min,加入新配制的 5%氢氧化钠溶液 20ml, 用甲
醇定容至 50ml, 用分光光度计于 500 nm处测定吸光度。以浓度
(C)与相应的吸光度(A)进行回归分析 ,得回归方程 A=0.163 2C
+0.056 4, r=0.997 6。
2.1.2　样品总黄酮的测定 称取干燥半边旗粗粉 10 g,加入含溶
剂的圆底烧瓶中 , 按表 1的实验设计进行回流提取 , 过滤 ,取滤液
挥干溶剂 ,残留物用甲醇溶解 ,定容到 50 ml, 即得样品溶液 , 用分
光光度计测定 500nm处的吸光度值 ,由标准曲线计算样品总黄酮
溶出量。
2.2　半边旗总黄酮的提取工艺考察
2.2.1　筛选因素水平 半边旗总黄酮采用醇提法。经预试验研
究 , 提取过程中可能的影响因素包括溶剂用量(A)、乙醇浓度(B)、
提取次数(C)以及提取时间(D)。以半边旗总黄酮溶出量为考核
指标 ,按 4因素 3水平进行正交实验 ,因素水平见表 1。
表 1　因素水平表
水平 A溶剂用量 /倍
B
乙醇浓度(%)
C
提取次数
D
提取时间t/h
1 6 60 1 1.0
2 9 80 2 1.5
3 12 95 3 2.0
2.2.2　正交实验设计及结果 按 L9(43)正交表对半边旗进行提
取并测定总黄酮量。结果见表 2 ～ 3。
·1443·
LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2008VOL.19NO.6 时珍国医国药 2008年第 19卷第 6期
表 2　正交实验结果及分析
实验
号 A B C D
总黄酮含量
/mg· g-1
1 1 1 1 1 0.68
2 1 2 2 2 1.37
3 1 3 3 3 1.16
4 2 1 2 3 1.01
5 2 2 3 1 1.10
6 2 3 1 2 0.92
7 3 1 3 2 1.01
8 3 2 1 3 1.26
9 3 3 2 1 1.45
Ⅰ 3.21 2.7 2.86 3.23
Ⅰ 3.21 2.7 2.86 3.23
Ⅲ 3.72 3.53 3.27 3.43
R 0.69 1.03 0.97 0.2
　　F0.05(2, 2)=19.0, F0.01(2, 2)=99.0, F0.005(2, 2)=199.0
由表 2和表 3分析结果可知 ,在半边旗总黄酮的提取工艺中 ,
各因素对提取效果的影响程度依次为 B>C>A>D,且因素 B(乙
醇浓度)和 C(提取次数)的影响具有统计意义 ,因此应选 B2 和C2 ,确定最优水平组合为 A3B2C2D3 ,即溶剂为 12倍量的 80% 乙
醇回流提取 2次 、2h/次。
2.2.3　放大的提取工艺验证实验 称取 3份半边旗干燥粗粉各
500 g,采用 A
3
B
2
C
2
D
3
最佳工艺条件提取 ,按 “ 2.1.2”方法测定提
取液总黄酮含量平均为 1.68 mg/g生药。提取液减压蒸去溶剂 ,
所得浸膏 60℃真空干燥 72 h, 称重得 22.9 g棕黑色固体, 计算得
此提取物中总黄酮质量分数为 11%。
表 3　最佳工艺验证实验
实验
批号
总黄酮含量
C/mg· g-1
平均含量
C/mg· g-1
RSD
(%)
20061002 1.66
20061003 1.67 1.68 1.22
20061004 1.71
2.3　半边旗黄酮的精制 半边旗黄酮的精制采用溶剂抽提法。称
取上述粗黄酮适量 ,按重量比 3∶2混入硅藻土 ,依次用石油醚 、氯
仿 、醋酸乙酯进行索氏抽提 ,分别抽提至无色 ,取醋酸乙酯溶液 , 减
压蒸干得棕黄色固体即为精制的半边旗黄酮。
2.4　半边旗精制黄酮的测定 采用峰面积归一化法。以木犀草素
和芹菜素混合溶液为对照品 , 以半边旗精制黄酮为供试品 , 分别进
样高效液相色谱。以供试品中木犀草素与芹菜素的面积和与供试
品出峰总面积的比值确定供试品中的黄酮含量。
色谱条件:色谱柱 DiamonsilC18(150mm×4.6mm, 5 μm);紫
外检测波长 283 nm;流动相为甲醇 -水溶液 , 按照甲醇含量 0 ～
100%梯度洗脱;流速 0.2 ml/min;柱温为 35℃。
对照品溶液的配制:精密称取木犀草素和芹菜素对照品各
1mg,置 10ml容量瓶中 ,加甲醇超声溶解 ,定容至刻度 ,即为对照品
溶液。
供试品溶液制备:称取精制的半边旗黄酮约 2 mg, 置 10ml容
量瓶中 ,加甲醇超声溶解 ,定容至刻度 , 即为供试品溶液。
吸取上述溶液 5μl,分别进样高效液相色谱。色谱图见图 1 ～
2。经峰面积归一化法计算供试品中木犀草素与芹菜素的面积和
与供试品出峰总面积的比值 , 计算得供试品中已知黄酮含量占
84.3%。
3　讨论
以总黄酮溶出量为考核指标 , 半边旗用乙醇提取有利于黄酮
类化合物的溶出 ,提高溶剂乙醇的浓度 ,可加快半边旗中总黄酮的
溶出速度 ,从而使溶出量增加。但溶剂乙醇浓度过高时 , 黄酮物质
的溶出量下降, 这可能是溶剂乙醇浓度增加, 反而使植物细胞脱
水 、皱缩 ,不易于溶胀破裂及总黄酮的溶出。
1.芹菜素　2.木犀草素
图 1　芹菜素和木犀草素标准品混合物的 HPLC图
1.芹菜素　2.木犀草素
图 2　半边旗精制黄酮的 HPLC图
结合正交设计得出优选的最佳因素水平为 12倍用量的 80%
乙醇溶剂回流提取 2次 , 2 h/次。正交统计结果表明 , 提取时间因
素的水平对总黄酮含量影响最小, 从节能 、经济考虑 , 样品的提取
工艺最终采用每次提取 1.5h为佳。
采用最佳工艺条件放大提取半边旗 ,所得提取物中总黄酮溶
出量达 1.68 mg/g生药, 总黄酮的质量分数占 11%。进一步的研
究表明该提取物中还含有脂溶性色素及萜类物质 , 其质量分数分
别占 5%和 78%。
半边旗黄酮物质主要是木犀草素 、芹菜素及其结合的糖
苷 [ 6] ,精制后的半边旗黄酮成分含量占 84.3%, 达到新药开发
的要求。有关药理及临床实验的结果表明木犀草素在体内具
有抗菌 、抗病毒及降低血脂和胆固醇的作用 [ 7] , 芹菜素具有抗
炎 、降血压 、抗动脉硬化和血栓症 、抗菌 、抗病毒以及抗氧化作
用等多方面的生物学活性 [ 8] 。因此开展半边旗黄酮的研究 , 为
从该植物中开发新型中药提供了依据 , 有利于天然植物资源的
综合利用。
参考文献:
[ 1 ] 　谢宗万.全国中草药名鉴 [ M].北京:人民卫生出版社 , 1996:53.
[ 2 ] 　MaurakamiT, TanakaN.Occurence, structureandtaxonomicappli-
cationsoffermconstituents[J] .ProgChemOrganicNatProd, 1988,
54:1.
[ 3 ] 　张　晓 , 崔　燎 ,田中信寿 ,等.半边旗有效成分及抗肿瘤活性研
究 [ J] .中国药学杂志 , 1997, 32(1):37.
[ 4 ] 　LiJH, CuiL.EfectsofantitumorcompoundsisisolatedfromPteris
semipinnataLonDNAtopoisomerasesandcelcycleofHL-60cels
[ J] .ActaPhamacolSin, 1999, 20(6):541.
[ 5 ] 　傅玉萍 ,苟占平 ,胡菊英 , 等.分光光度法测定不同时期半边旗总
黄酮含量 [ J] .时珍国医国药 , 2001, 12(12):1080.
[ 6 ] 　吕应年 ,吴科锋 ,梁念慈 , 等.高效液相色谱法测定半边旗中木犀
草素的含量 [ J] .时珍国医国药 , 2007, 18(1):102.
[ 7 ] 　汪丽燕 ,韩传环 , 王　萍.木犀草素对冠脉血流动力的实验研究
[ J] .中国药理学报 , 1992, 8(5):388.
[ 8 ] 　孙　斌.芹菜素的药理作用研究进展 [ J] .中药材 , 2004, 27
(7):531.
·1444·
时珍国医国药 2008年第 19卷第 6期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2008VOL.19NO.6