全 文 ：·实验研究·
半边旗二萜类化合物 5F 对人病理性瘢痕
成纤维细胞胶原合成的影响
作者单位:1.广州市红十字会医院(暨南大学第四附属医院)整形
科 ,广东　广州　510220;2.第一军医大学附属珠江医院 普外科;
3.广东医学院 整形研究所
作者简介:张云松(1970-),女 ,湖南人 ,主治医师 ,硕士研究生.
张云松1 , 　何井华2 , 　罗少军3　李叶扬1 , 　梁　岷1
摘要:目的　研究 5F 对人病理性瘢痕成纤维细胞合成胶原的影响。方法　将 5F作用于体外培养的病理性瘢痕
成纤维细胞 ,通过3H-脯氨酸掺入法 、检测细胞上清液羟脯氨酸含量及人 PCⅢ放免试剂盒测定成纤维细胞胶原合成
含量。结果　5F 可减少成纤维细胞3H-脯氨酸掺入量 、细胞上清液胶原蛋白总量及Ⅲ型前胶原的含量。结论　5F
在体外能明显抑制病理性瘢痕成纤维细胞胶原的合成。
关键词:半边旗;成纤维细胞;胶原合成
中图分类号:R619.6　　　文献标识码:A　　　文章编号:1004-6526(2003)03-0166-03
Effects of 5F extracted from peris semipinnate L on collagen synthesis of human scar fibroblasts
ZHANG Y un -song , HE J ing-hua , LUO S hao-jun , et al.(Department of Plastic Surgery , Guangzhou Red
Cross Hospital , Guangzhou 510220 , China)
Abstract:Objective　To investigate the inhibitory effect of 5F on the synthesis of collagen of the fibroblasts derived
from human pathological scar.Methods　By culturing fibrobeasts , we investigated collagen synthesis by 3H- Proline incor-
poration study with hydro xyproline and procollagen type Ⅲ content measurements.Results　5F could decrease 3H-HPro-
line incorporation rate and the to tal content of collag en , the content of Ⅲ precollagen w as kept at a low level(P<0.01).
Conclusion　5F could inhibit the synthesis of collagen of fibroblasts.
Key words:Peris semipinnata L ;Fibroblasts;Collagen synthesis
　　以成纤维细胞瘤样增殖分泌大量胶原并过度沉
积为特征的病理性瘢痕 ,由于发病机理不明尚缺少
有效疗法 ,近年来 ,中药治疗病理性瘢痕 ,备受关注 ,
疗效比较肯定。半边旗是我国传统中草药 ,性味苦 、
辛 、凉 ,具有疏解风寒 、化湿消肿 、清热解毒之功效 ,
民间用于治疗菌痢 、肝炎 、肠炎 、毒蛇咬伤等[ 1] 。现
已证实 ,从中提取的二萜类化合物 5F(11α-羟基-
15-氧-16-烯-对映贝壳杉烷-19酸 ,以下简称
5F)具有高效低毒的多种体内外抗肿瘤活性[ 2] 。笔
者通过实验 ,首次证明 5F 能抑制人病理性瘢痕成纤
维细胞的增殖 ,且促进其凋亡 ,为进一步深入研究
5F 对成纤维细胞的作用机制 ,本课题以体外培养的
人病理性瘢痕成纤维细胞为实验对象 ,观察 5F 对成
纤维细胞合成分泌胶原的影响 。
1　材料与方法　
1.1　药品与试剂　半边旗二萜类化合物 5F(广东
医学院天然药物开发中心惠赠)、DMEM(美国 GIB-
CO公司出品)、新生小牛血清(杭州四季青生物工程
材料公司出品)、3H-脯氨酸(北京原子能研究所出
品)、羟脯氨酸检测试剂盒(南京建成生工研究所出
品)、PC Ⅲ放免试剂盒(重庆肿瘤研究所出品)。
1.2　方法　
1.2.1　人成纤维细胞培养　手术中取年龄 2 ～ 45
岁患者的病理性瘢痕组织 ,在无菌条件下 ,经漂洗 、
剪碎 ,培养于含 20%新生小牛血清的 DMEM 培养
液中 ,置 37 ℃, CO2 孵箱中培养 ,待长成致密单层
后 ,用 2.5 g/L 胰蛋白酶消化 ,以 1∶3传代。实验所
用的细胞 ,为第 4 ～ 9代细胞。实验分成 DMEM 培
养液对照组 、5F 系列浓度梯度组(图 1 ～ 8)。
1.2.2　细胞内胶原含量测定　用3H-脯氨酸(3H-
Pro)掺入法 ,细胞消化接种同上 ,48 h后吸弃上清液 ,
PBS洗2遍 ,加入培养液 ,孵箱内培养24h后 ,吸弃上清
100μl ,加入3H-脯氨酸 、Vit-C及 β-氨基丙腈混合液
(终浓度分别为 10 、50 、100μg/ml)100μl继续培养10 h ,
吸弃上清 ,加入 0.25%胰蛋白酶200μl消化细胞 ,多头
细胞收集器收集细胞于玻璃纤维纸上 ,液闪测定仪测
定细胞3H-脯氨酸掺入量(cpm)。
1.2.3　细胞上清液羟脯氨酸含量测定　取对数生
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图 1　原代培养的成纤维细胞(×100) 图 2　对照组 48 h的成纤维细胞(×100)
图 3　5F 5μg/ml组 48 h 的成纤维细胞(×100) 图 4　5F 10μg/ ml组 48 h 的成纤维细胞(×100)
图 5　5F 20μg/ml组 48 h 的成纤维细胞(×100) 图 6　5F 40μg/ ml组 48 h 的成纤维细胞(×100)
图 7　5F 80μg/ml组 48 h 的成纤维细胞(×100) 图 8　5F 120μg/ml组 48 h 的成纤维细胞(×100)
长期成纤维细胞以 5×104/L 密度 ,接种于 24 孔培
养板中 ,每孔 1 ml , 37 ℃、5%CO2 孵箱中培养 48 h ,
更换 10%FBS DMEM 培养基并加入不同浓度 5F ,
每一浓度重复 4孔 ,每组重复 6次。加药后 48 h ,从
每孔中各吸取 0.5 ml培养基 ,按羟脯氨酸(HPr)检
测试剂盒说明方法 ,测定培养基中 HPr 含量 。用
M550型酶标仪 ,检测各组细胞的 A540值 ,通过以
下公式 ,计算样品中 HPR及胶原含量 。样品中羟脯
氨酸浓度(μg/ml培养基)=测定管A值×标准浓度/
标准管 A值;样品中胶原的浓度(μg/ml培养基)=
样品羟脯氨酸浓度×7.46×稀释倍数(7.46是从羟
脯氨酸换算为胶原时的计算常数)。
1.2.4　细胞上清液中 Ⅲ型前胶原含量测定　细胞
消化接种 ,调整细胞浓度为 5×104个/ml ,用 6孔培
养板培养 ,每孔 1×104 个细胞。24 h 后吸弃上清 ,
PBS洗两遍 ,加入条件培养液 ,孵箱内培养 96 h后 ,
尽数收集上清液 ,应用 PC Ⅲ放免试剂盒 ,测定上清
液中 PC Ⅲ的含量 。
1.2.5　统计学处理　所得数据以均数±标准差(-x
±s)表示 ,两组数据比较 ,采用 t 检验 , P <0.05 差
异 ,有显著意义。
表 1　5F 对成纤维细胞3H-Pro 掺入量的影响　(-x ±s)
5F 浓度(μg/ ml) cpm 细胞(min)
0(对照) 1 068±110.43
5 1 049±126.58
　　　10 　998±100.46
　　　20 867±94.36＊
　　　40 652±70.19＊
　　　80 394±40.65＊
　　　120 125±16.23＊
　　n=6 , 与对照组相比 , ＊P <0.01
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2　结果　
2.1　5F对成纤维细胞3H-Pro 掺入量的影响　随
着5F 浓度的增加 ,成纤维细胞3H 标记的脯氨酸掺
入量逐渐减少(表 1),与对照组相比 ,有显著性差异
(P<0.01)。
2.2　细胞上清液羟脯氨酸(HPr)含量　用 5F 处理
成纤维细胞后 ,HPr含量明显下降(P <0.01),由公
式计算出的胶原蛋白含量随之下降(表 2),与对照
组相比 ,有显著性差异(P <0.01)。
表 2　5F对细胞上清液中 HPr含量的影响　(-x ±s)
5F浓度(μg/ml) Hpr(μg/ ml) 胶原蛋白(μg/ml)
0(对照) 2.946±0.40 22.79±2.93
20 2.513±0.31＊ 18.75±2.43＊
40 1.832±0.29＊ 13.58±1.84＊
80 1.218±0.18＊ 8.96±1.22＊
　　n=6 ,与对照组相比 , ＊P<0.01
2.3　细胞上清液中 PCⅢ检测结果 　见表 3 ,随着
5F 浓度增加 ,PC Ⅲ值逐渐下降 ,与对照组相比 ,有显
著性差异(P <0.01)。
表 3　5F 对细胞上清液中 PCⅢ含量的影响(-x ±s)
5F 浓度(μg/ ml) PCⅢ(μg/ L)
0 465.69±50.15
20 426.81±42.68＊
40 382.16±36.45＊
80 325.43±30.37＊
　　n=6 ,与对照组相比 , ＊P<0.01
3　讨论　
3.1　5F对成纤维细胞3H-脯氨酸掺入量的影响　
成纤维细胞是产生胶原的主要细胞[ 3] ,在增生活跃的
病理性瘢痕中 ,成纤维细胞胶原合成功能 ,处于高度
活化状态 ,胶原合成增加是病理性瘢痕中胶原过度沉
积的重要原因[ 4] 。脯氨酸是成纤维细胞合成胶原的
重要底物。测定3H-脯氨酸掺入量 ,可灵敏地反映成
纤维细胞胶原合成的能力[ 5] 。本实验结果显示 ,5F
浓度在 10μg/ml时 , 3H -脯氨酸掺入量有较明显下
降 ,5F 浓度在 20μg/ml时 ,其下降与对照组相比 ,有
显著性差异(P<0.01), 3H-脯氨酸掺入量由对照组
的1 068个/min ,下降到 120μg/ml组的 125个/min ,
结果表明 ,5F 对病理性瘢痕成纤维细胞胶原合成 ,有
明显的抑制作用 ,并具明显的剂量依赖性。
3.2　5F对细胞上清液 Hpr 含量的影响　羟脯氨酸
主要存在于胶原中 ,是胶原蛋白多肽链中特异的氨
基酸成分 ,是影响胶原纤维形成的决定因素之一 。
因为羟脯氨酸在胶原蛋白中 ,含量较恒定 ,占胶原中
总氨基酸的 13.4%,而一般蛋白质 ,含量极微 。所
以 ,测定胶原蛋白总量 ,常采用测定胶原中羟脯氨酸
的量来表示 ,用以间接反映胶原的合成情况[ 6] 。实
验结果显示 ,在本实验条件下 ,5F 可使细胞上清液
中羟脯氨酸含量 ,显著降低(P <0.01),据此计算出
的胶原蛋白含量 ,与对照组相比呈显著性降低(P <
0.01),这间接反映出 5F 对病理性瘢痕成纤维细胞
胶原合成 ,有抑制作用 ,并具显著的剂量 效应关
系 ,与3H-脯氨酸掺入法检测结果一致。
3.3　5F对细胞上清液中 PCⅢ含量的影响　胶原
蛋白是细胞外基质中最活跃的成分之一 ,是创面愈
合和瘢痕形成的关键因素[ 7] 。胶原蛋白的异常合成
与沉积 ,是病理性瘢痕的病理学基础 ,其中以 Ⅰ 、Ⅲ
型胶原沉积为主[ 8] 。本实验用不同浓度 5F 作用于
成纤维细胞后 ,其上清液中 PC Ⅲ含量 , 随剂量增
加 ,明显减少 ,与对照组相比 ,有显著性差异(P <
0.01)。可见 , 5F 对病理性瘢痕成纤维细胞合成胶
原蛋白 ,有良好的抑制作用 。
本研究采用不同方法 ,从不同侧面验证 5F 能显
著抑制病理性瘢痕成纤维细胞胶原合成与分泌能
力 ,该结果为深入研究 5F 治疗病理性瘢痕提供了理
论依据 。本研究有待于从复制和转录水平 ,进一步
证实 5F 对病理性瘢痕成纤维细胞胶原合成与分泌
的影响 。
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收稿日期:2003-02-19　　
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