全 文 ：海金沙不同溶剂提取物清除自由基活性的研究
贲永光 ,李康 ,李坤平 ,张伟永　(广东药学院药科学院 ,广东广州 510006)
摘要　[目的 ]比较不同溶剂提取海金沙总黄酮对自由基活性清除能力的大小。 [方法 ]应用 DPPH法、邻苯三酚自氧化法和 Fenton反
应分别研究了浓度 95%乙醇、乙酸乙酯、丙酮 、乙酸、氯仿 、甲醇提取物清除自由基活性的能力。 [结果] 6种溶剂提取得到的海金沙提取
物对DPPH· 、OH·和O2 -·均有一定程度的清除作用 , 不同溶剂所得提取物对自由基的清除作用均有差别 ,其中浓度 95%乙醇提取
得到的海金沙提取物对 3种自由基清除效果均最好。 [结论]海金沙可作为抗氧化物质资源进行开发利用。
关键词　海金沙;黄酮;自由基;清除作用
中图分类号　R284　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)19-08989-03
StudyontheScavengingActivitiesofExtractsfromLygodiumjaponicum(Thunb)Sw.withDifferentSolventstoFreeRadicals
BIYong-guangetal　(ColegeofPharmacy, GuangdongPharmaceuticalUniversity, Guangzhou, Guangdong510006)
Abstract　[ Objective] TheresearchaimedtocomparethescavengingabilitiesoftotalflavonefromLygodiumjaponicumwithdiferentsolvents
tofreeradicalactivity.[ Method] DPPHmethod, pyrogalolmethodandFentonreactionwereusedtostudythescavengingabilityofextracts
with95% ethanol, ethylacetate, acetone, aceticacid, chloroform, methanoltofreeradicalactivity.[ Result] Sixkindsofsolventextracts
fromL.japonicumhadcertainscavengingabilitytoDPPH· , OH· andO2 -· .Thescavengingabilityofextractedwithdiferentsolvents
tofreeradicalswerediference.TheextractsfromL.japonicumwith95%ethanolhadthebestscavengingeffectsonthreekindsoffreeradi-
cals.[Conclusion] L.japonicumcanbeusedasantioxidantsforthedevelopmentandutilizationofresources.
Keywords　Lygodiumjaponicum(Thunb)Sw;Flavone;Freeradicals;Scavenging
基金项目　广东药学院博士启动基金(2007YKX12)。
作者简介　贲永光(1976-),男 ,广西宜州人 , 博士 ,讲师 ,从事天然产
物声化学及制药工程技术研究。
收稿日期　 2009-03-25
　　海金沙为海金沙科植物海金沙 Lygodiumjaponicum
(Thunb)Sw.的干燥成熟孢子。秋季孢子未脱落时采割藤叶 ,
晒干 ,搓揉或打下孢子 ,除去藤叶即得。孢子粉状 ,棕黄色 ,
质轻滑润 ,着火燃烧爆鸣及闪光。显微镜下观察 ,孢子呈四
面体 ,极面观钝三角形 ,极轴长 58 ～ 72 μm,具 3裂缝 ,周壁具
瘤状纹饰。孢子含海金沙素 、棕榈酸 、油酸 、亚油酸 、(十)-8-
羟基十六酸和脂肪油 [ 1] 。性寒 ,味甘。气微 ,味淡。归膀胱 ,
小肠经 ,清利湿热 ,通淋止痛 。其主产于广东 、浙江 、江苏 、江
西 、湖南 、湖北 、广西 、云南 、四川 、贵州 、陕西 、河南等省 [ 2] 。
有资料报道 ,海金沙中含有黄酮 [ 3] 。研究表明 ,黄酮类化合
物在动植物体内具有清除自由基 、抗衰老 、抗菌 、抗病毒 、防
癌等多种生物活性 ,其作用机理在于它阻止了自由基在体内
导致的链反应 。为了探讨海金沙黄酮类化合物的抗氧化性
质 ,笔者采用浓度 95%乙醇 、乙酸乙酯 、丙酮 、乙酸 、氯仿 、甲
醇 6种有机溶剂进行超声强化提取 ,分别得到了 6种有机溶
剂的提取物 ,并对这 6种提取物进行抗自由基活性的研究 ,
比较它们的自由基清除能力 ,旨在为其在食品和药品领域的
有效应用提供理论参考。
1　材料与方法
1.1　材料　海金沙(广州清平药材批发市场 ,经广州市药品
检验所中药室鉴定);HH-6恒温水浴锅(江苏金坛市宏华仪
器厂);RE-52CS旋转蒸发器(巩义市英峪予华仪器厂);予华
牌循环水真空泵(河南省巩义市英峪予华仪器厂);UV1101
紫外 /可见分光光度仪(上海天美科学仪器有限公司);
JA2003电子天平 (上海恒平科学仪器有限公司);KH-
400KDB型高功率数控超声清洗器(昆山禾创超声仪器有限
公司);摇摆式高速中药粉碎机(大德中药机械有限公司)。
芦丁标准品(中国药品生物制品检定所 ,批号:008029705);
二苯代苦味酰自由基(DPPH·)(Sigma公司);Tris-HCl缓
冲液;邻苯三酚;硫酸亚铁;水杨酸;双氧水等 。均为分析纯。
1.2　方法
1.2.1　黄酮标准曲线制作 [ 4] 。称取干燥至恒重的芦丁标准
品 11.2mg,定容于 10 ml容量瓶中。分别吸取 0、0.1、0.2、
0.3、0.4、0.5 mg于 10 ml容量瓶中 ,用浓度 60%乙醇溶液补
充至 5.00ml,分别加入浓度为 5%的亚硝酸钠溶液 0.3 ml,
摇匀 ,静置 6 min后 ,加入浓度 5%的硝酸铝溶液 0.3 ml,摇
匀 ,放置 6min后 ,再加入浓度为 4%的氢氧化钠溶液 4.0ml,
摇匀 ,放置 12min后于波长 510 nm处测定吸光度 。以芦丁
标准品的浓度 C为横坐标 ,吸光度 A为纵坐标 ,绘制标准曲
线。用最小二乘法进行线性回归 ,得回归方程 A=0.010 9C
-0.001 3,并求得相关系数 r=0.999 8。
1.2.2　海金沙总黄酮提取物的制备。称取海金沙粉末 1.0
g,加浓度 95%乙醇 20ml,在 25 ℃下经超声提取 30 min减压
抽滤 ,用浓度 95%乙醇洗涤 3次(总用量为 20ml),用旋转蒸
发器浓缩到 2 ml左右 ,用浓度 95%乙醇定容至 25 ml。作为
供试液 。分别用乙酸乙酯 、丙酮 、乙酸 、氯仿 、甲醇作提取剂 ,
按上述方法提取制得 6种不同溶剂的提取液。
1.2.3　黄酮提取物对 DPPH·清除作用的测定。 DPPH·溶
液的配制 [ 5] :准确称取 0.025 0g(25mg)DPPH,用浓度 95%
乙醇溶解并定容于 100 ml容量瓶中 ,摇匀 ,得到浓度为 250
mg/L的 DPPH·母液 ,避光保存(0 ～ 4 ℃)。准确移取 10.0
ml的上述 DPPH·母液于 100ml的容量瓶中 ,用浓度 95%的
乙醇定容 ,摇匀 ,得到 25.0 mg/LDPPH·标准溶液。
将海金沙总黄酮提取液稀释 10倍后取 0.1 ml与 3.0 ml
浓度 25.0mg/LDPPH·溶液加入同一试管中 ,摇匀 ,在黑暗
中放置 30 min,以浓度 95%乙醇为空白在 517 nm测定其吸
光度 A,并以下式计算其清除率:
清除率 =[(Ac-Ai)/Ac] ×100%
式中 , Ac为 0.1 ml无水乙醇加 3.0 mlDPPH·溶液的吸光
度;Ai为 0.1 ml待测液加 3.0mlDPPH·溶液的吸光度。
安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2009, 37(19):8989-8991 责任编辑　张杨林　责任校对　况玲玲
DOI :10.13989/j.cnki.0517-6611.2009.19.138
按照上面公式计算清除率 ,清除率越大 ,表明抗氧化能
力越强。
(1)不同浓度海金沙总黄酮提取液对 DPPH·的清除作
用比较。取海金沙总黄酮提取液 6份 ,分别为 0.1、0.2、0.3、
0.4、0.5、0.6 ml,用浓度 95%乙醇代替样品做空白 ,依法测
定 ,并计算其清除率 。
(2)不同溶剂提取的海金沙总黄酮样品对 DPPH·的清
除作用比较。取不同溶剂提取的海金沙总黄酮提取液样品
各 0.1 ml,用浓度 95%乙醇代替样品做空白 ,依法测定 ,并计
算其清除率。
1.2.4　黄酮提取物对羟自由基(OH· )的清除作用的测定 。
利用 Fenton反应可检测各种自由基清除剂对 OH·的清除作
用 。清除 OH·的测定方法 [ 6] :利用 H2O2 与 Fe2+混合产生
OH· ,具有很高的反应活性 ,存活时间短 ,但在体系内加入
水杨酸能有效捕捉 OH·并产生有色物质 ,该物质在 510 nm
下有最大吸收 。若加入具有清除 OH·功能的被测物 ,就会
与水杨酸竞争 OH· ,从而使有色产物的生成量减少。采用
固定反应时间法 ,在 510 nm处测量被测物反应液的吸光度 ,
并与空白液比较 ,便能测定被测物对 OH·的清除能力。
反应体系中含浓度 9.8 mmol/LH2O2 2 ml, 9 mmol/L
FeSO4 2ml, 9mmol/L水杨酸 -乙醇 2ml,不同浓度的海金沙
总黄酮溶液 2ml。最后加 H2 O2启动反应 , 37℃反应 30min,
8 000 r/min离心 3 min,以超纯水为参比 ,在 510 nm下测量
各浓度的吸光度。考虑到总黄酮本身的吸光值 ,以浓度 9
mmol/LFeSO4 2 ml,浓度 9mmol/L水杨酸 -乙醇 2 ml,不同
浓度的总黄酮溶液 2ml和 2ml超纯水作为总黄酮的本底吸收。
清除率计算公式为:
清除率(%)=[(A0 -(Ax-Ax0))/A0 ] ×100
式中 , A0为空白对照液的吸光度;Ax为加入总黄酮溶液后的
吸光度;Ax0为不加显色剂 H2O2总黄酮溶液本底的吸光度 。
1.2.5　黄酮提取物对超氧阴离子自由基(O-2 ·)的清除试
验 。采用邻苯三酚自氧化法进行测定 [ 7-9] 。具体方法如下:
取浓度 0.05 mol/LpH值为 8.2的 Tris-HCl缓冲液 4.5 ml,
于干燥的具塞小试管中 ,置 25℃水浴中预热 20 min,分别加
入不同浓度的待测品 0.1 ml后 ,均加入浓度 2.5 mmol/L邻
苯三酚(由浓度 10 mmol/LHCl配制)0.4 ml。混匀后 25 ℃
水浴中准确反应 4 min,立即加入浓度 8 mol/LHCl2滴终止
反应 ,蒸馏水调零 ,在 320 nm处测定吸光度 A。
清除率(%)=[ 1-(A样品 -A样品空白)/A空白 ] ×100
式中 , A空白为加邻苯三酚但不加药物;A样品为加药物和邻苯三
酚;A样品空白为加药物不加邻苯三酚。
2　结果与分析
2.1　海金沙总黄酮对 DPPH·的清除作用
2.1.1　不同浓度海金沙总黄酮提取液对 DPPH·的清除作
用 。由图 1可知 ,海金沙总黄酮对 DPPH·的清除能力比较
明显 ,而且清除率与其浓度在一定范围内正相关。清除率随
样品浓度的增大而增加 ,在浓度为 0.15 mg/ml时清除率开
始趋于平稳 ,不再发生大的变化 ,这时的清除率都已达到
90%以上 。清除率是 50%的点样品浓度在 0.06～0.08mg/ml。
2.1.2　不同溶剂提取的海金沙总黄酮样品对 DPPH·的清
图 1　不同浓度的海金沙总黄酮 DPPH·的清除曲线
Fig.1　Thescavengingcurveofdiferentconcentrationoftotal
flavonefromLygodiumjaponicumtoDPPH·
除作用 。试验结果表明 , 6种溶剂提取得到的海金沙提取物
对 DPPH·均有一定的清除作用 ,浓度 95%乙醇 、乙酸乙酯 、
丙酮 、乙酸 、氯仿 、甲醇提取的海金沙 0.02 mg/ml对 DPPH·
的清除率分别为 53.3%、8.4%、21.7%、16.6%、3.3%、
46.6%,强弱顺序为:浓度 95%乙醇提取物 >甲醇提取物 >
丙酮提取物 >乙酸提取物 >乙酸乙酯提取物 >氯仿提取物 ,
用浓度 95%乙醇提取得到的提取物抗氧化效果最好 。
2.2　海金沙总黄酮对 OH·的清除作用　由海金沙总黄酮
清除 OH·能力的分析结果来看 ,海金沙总黄酮对 OH·有一
定的清除能力 ,清除效果与总黄酮浓度的关系在一定浓度范
围内成正相关。但是样品浓度较高时 ,清除率都不能超过
50%,而是在清除率 45%左右趋于平稳(图 2)。试验结果表
明 , 6种溶剂提取得到的海金沙提取物对 OH·均有一定的
清除作用 ,浓度 95%乙醇 、乙酸乙酯 、丙酮 、乙酸 、氯仿 、甲醇
提取的海金沙总黄酮 0.02 mg/ml对 OH·的清除率分别为
44.8%、38.8%、40.0%、10.6%、35.5%、27.9%,其强弱顺序
为:浓度 95%乙醇提取物 >丙酮提取物 >乙酸乙酯提取物 >
氯仿提取物 >甲醇提取物 >乙酸提取物 ,用浓度 95%乙醇提
取得到的提取物抗氧化效果最好。
图 2　不同浓度的海金沙总黄酮对 OH·的清除曲线
Fig.2　Thescavengingcurveofdiferentconcentrationoftotal
flavonefromL.japonicumtoOH·
2.3　海金沙总黄酮对 O2 -·的清除作用　由图 3可知 ,随
着黄酮提取液浓度的提高 ,其对 O-2 ·的抑制率也逐渐提高
并呈正相关。 O-2 · 、OH·和 H2 O2是生物体内主要的活性
氧自由基 ,由它们引发的体内脂质过氧化是机体衰老 、心血
管疾病及肿瘤发生的重要原因。该试验证明 ,海金沙总黄酮
对 O-2 ·有清除作用 ,从而能清除体内产生的过多氧自由基 ,
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阻断体内氧自由基链反应的作用。试验结果表明 , 6种溶剂
提取得到的海金沙提取物对 O-2 ·均有一定的清除作用 ,浓
度 95%乙醇 、乙酸乙酯 、丙酮 、乙酸 、氯仿 、甲醇溶剂提取的海
金沙总黄酮 0.02 mg/ml对 O-2 ·的清除率分别为 98.5%、
97.6%、96.8%、94.6%、97.3%、94.0%,其强弱顺序为:浓度
95%乙醇提取物 >乙酸乙酯提取物 >氯仿提取物 >丙酮提
取物 >乙酸提取物 >甲醇提取物 ,用浓度 95%乙醇提取得到
的提取物抗氧化效果最好 。
图 3　不同浓度的海金沙总黄酮对 O-2 ·的清除曲线
Fig.3　Thescavengingcurveofdiferentconcentrationoftotalflavone
fromL.japonicumtoO-2 ·
3　结论
(1)6种溶剂提取得到的海金沙提取物对 DPPH· 、
OH·和 O-2 ·均有一定程度的清除作用 ,不同溶剂所得提取
物对自由基的清除作用有差别 ,对 DPPH·清除强弱顺序为:
浓度 95%乙醇提取物 >甲醇提取物 >丙酮提取物 >乙酸提
取物 >乙酸乙酯提取物 >氯仿提取物 ,用浓度 95%乙醇提取
得到的提取物抗氧化效果最好 ,清除率达 53.3%;对 OH·清
除强弱顺序为:浓度 95%乙醇提取物 >丙酮提取物 >乙酸乙
酯提取物 >氯仿提取物 >甲醇提取物 >乙酸提取物 ,用浓度
95%乙醇提取得到的提取物抗氧化效果最好 ,清除率达
44.8%;对 O-2 ·清除强弱顺序为:浓度 95%乙醇提取物 >乙
酸乙酯提取物 >氯仿提取物 >丙酮提取物 >乙酸提取物 >
甲醇提取物 ,用浓度 95%乙醇提取得到的提取物抗氧化效果
最好 ,清除率达 98.5%。
(2)海金沙提取物有一定的抗氧化性 ,尤其是对自由基
的清除效果较好 ,稳定性好 ,可作为抗氧化物质资源开发
利用。
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(上接第 8988页)
　　(3)单因素提取试验结果证明 ,在确定提取方法和使用
试剂后 ,料液比 、提取温度 、试剂浓度 、提取时间等因素对能
否充分从绞股蓝材料中提取出黄酮影响很大;复合因子多水
平正交试验结果证明 ,使用料液比 、提取温度 、试剂浓度 、提
取时间的优化参数提取原料 ,检测得到的含量与不使用优化
参数的含量差异极显著。因此 ,对不同材料和提取不同成
分 ,在检测前 ,尽管有经典的提取方法 ,仍有必要做优化提取
参数工作。
(4)恩五叶蜜 、恩七叶甜含人参皂苷 5.50%,比绞股蓝
原变种高 33.30%,该研究证明二者还含较高的黄酮 ,且恩七
叶甜比恩五叶蜜。因此 ,开发无苦味绞股蓝黄酮产品时可以
优先考虑从恩七叶甜材料中提取。
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