全 文 ：半边旗中黄酮成分的分离鉴定与抗氧化活性研究
吕应年 , 　蒋桂香 , 　吴科锋 , 　邓亦峰 , 　梁念慈
(广东医学院广东天然药物研究与开发重点实验室 ,广东湛江 524023)
摘　要:半边旗干燥的全草经粉碎后 ,以 80%乙醇回流萃取得浸膏 ,浸膏再用石油醚 、氯仿和乙酸
乙酯依次抽提 ,将乙酸乙酯抽提物减压蒸干得到半边旗黄酮样品 。样品经薄板层析 、化学显色反应
及紫外光谱分析 ,初步鉴定了其中的黄酮物质成分;样品经液相色谱-质谱联用分析 ,进一步确证了
半边旗黄酮中含有芹菜素 、木犀草素和木犀草素葡萄糖苷 。样品用 Na2S2O3-I2 滴定试验考察发现
其具有良好的抗氧化活性 。
关键词:半边旗;黄酮;分离;鉴定;高效液相色谱-质谱联用;抗氧化
中图分类号:TQ 244.3　　　文献标识码:A
文章编号:0367-6358(2007)04-205-04
Separation and Identification of Flavonoids in Pteris
semipinnata L and their Antioxidation Activity
LU Ying-nian , 　JIANG Gui-xiang , 　WU Ke-feng , 　DENG Yi-feng , 　LIANG Nian-ci
(Guangdong Medical College , Guangdong Key Laboratory for Research and
Development of Natural Drugs , Guangdong Zhanjiang 524023 , China)
Abstract:The whole plant parts of Pteris semipinnata L were dired , powered and extracted with 80% ethanol to get the
poultice , and then the poultice was extracted in turns with the solvents such as petroleum ether , chloroform and acetic
ester.The extract of acetic ester was vaporized to dry under reduced pressure and crude flavonoids were obtained.With
the analytical methods including thin-layer chromatography , color reaction and UV spectrum , the flavonoid components
were preliminarily identified , and further analysis with HPLC-MS confirmed the flavonoid components were apigenin ,
luteolin and luteolin-glucoside in this plant.WithNa2S2O3-I2 titrimetric method , the crude flavonoids were found to have
antioxidation activity.
Key words:Pteris semipinnata L;flavonoids;isolation;identification;HPLC-MS;antioxidation
收稿日期:2006-11-15;修回日期:2007-02-06
作者简介:吕应年(1975～ ),男 ,湖北应城人 ,硕士 ,主要从事天然活性成分的研究 , Tel:0759-2388405, E-mail:lyn7591@hotmail.com
　　半边旗(Pteris semipinnata L ,简写为 PsL),又名
半边蕨 、半边莲 、单边旗 ,系凤尾蕨科植物 ,是我国南
方的常用中草药 ,始载于《岭南采药录》 ,称半边旗 。
该植物有止血 、生肌 、解毒 、消肿之功效 ,民间用于治
疗吐血 、外伤出血 、发背 、疔疮 、跌打损伤 、目赤肿痛
等[ 1] 。现代研究表明 ,半边旗中含有挥发油 、萜类 、
黄酮 、皂苷等多种物质成分[ 2] 。有关半边旗的药效
成分研究主要集中在萜类化合物的抗肿瘤活性方
面 ,从半边旗全草中已分离出几种有抗肿瘤活性的
贝壳杉烷型二萜化合物[ 3, 4] ,但对于半边旗中黄酮类
物质的研究报道还较少见 ,曾有报道研究半边旗的
总黄酮含量测定[ 5] ,而对于其中黄酮类物质的进一
步分离和鉴定尚未有报道。
黄酮类化合物是中草药中一类重要的药效成
分 ,具有抗肿瘤 、抗病毒 、抗氧化 、降血脂等广泛的生
物活性 ,天然黄酮主要以游离的苷元或与糖结合成
糖苷的形式存在于植物中。本文主要研究了半边旗
中黄酮类物质的提取分离及鉴定 ,采用有机溶剂提
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取 、薄板层析 、化学显色反应 、紫外光谱及液相色谱-
质谱联用的方法 ,确定了半边旗中黄酮的物质成分 ,
并研究了半边旗黄酮的抗氧化活性 ,为半边旗的深
入研究和开发利用提供依据。
1　实验部分
1.1　实验材料 、试剂和仪器
半边旗植物采收于广东湛江郊区 ,经广东医学
院生药教研室苟占平博士鉴定为半边旗(Pteris
semipinnata L)全草;芹菜素和木犀草素标准品购于
天津尖峰天然产物研究开发公司 ,甲醇为色谱纯
(TEDIA Company Inc.USA),石油醚 、氯仿 、乙酸乙酯
均为分析纯(广州大华试剂公司),硅胶薄板(GF254
型 ,青岛海洋化工厂),其他化学试剂均为分析纯。
岛津 LC MS-8000A 型高效液相色谱-质谱联用
仪(含在线脱气机 ,两台 LC-10Avp高压输液泵 ,SCL-
10Avp 控制器 , SPD-10Avp 紫外检测仪 , CTO-10Avp
柱温箱 ,APC源接口 ,四极杆质谱检测计),紫外分光
光度计 (岛 津 UV3101PC), 分析 天平 (Mettler ,
AE240),旋转蒸发仪(上海申越科学仪器公司),四
用紫外分析仪(上海顾村科学器材厂)。
1.2　半边旗黄酮的提取流程
称取半边旗干燥全草 ,经植物粉碎机粉碎 ,加入
约 6倍体积 80%的乙醇 ,回流 2次 ,每次1.5 h ,回收
乙醇得半边旗醇提取物浸膏(Extract of PSL)。以浸
膏为原料依次用石油醚 、氯仿 、乙酸乙酯抽提 ,将乙
酸乙酯抽提物蒸干即得半边旗黄酮粗品 ,具体操作
步骤如图 1。
图 1　半边旗黄酮的有机溶剂萃取分离步骤
1.3　理化鉴定
1.3.1　薄板层析:半边旗黄酮粗品加适量甲醇溶
解 ,点样于硅胶薄板上 ,以氯仿-甲醇(10∶1 , v v)为
展开剂上行展开 ,挥干溶剂 ,在 254 nm 紫外灯下检
视。将样品展开的紫外斑点刮下 ,分别用丙酮浸泡
洗脱 ,取滤液蒸干得鉴定用样品。
1.3.2　显色反应:按文献方法[ 6] 将所得鉴定用样品
做定性显色反应。
1.3.3　紫外光谱:取适量鉴定用样品溶于甲醇 ,溶
液倒入 1 cm石英比色皿 ,以空白甲醇为对照 ,在紫
外光谱仪上扫描得 200 ～ 400 nm 波长的紫外光谱
图 。
1.4　高效液相色谱-质谱联用分析
标准溶液配制:准确称取芹菜素和木犀草素标
准品 ,加甲醇配制成含量分别为 1.25mg/mL和 1.15
mg/mL的标准品溶液 。
样品溶液配制:半边旗黄酮粗品干燥后准确称
重 ,加甲醇溶解成含量为 1.02 mg/mL的样品溶液。
高效液相色谱(HPLC)条件:色谱柱 Diamonsil
C18(150 mm×4.6 mm ,5 μm);紫外检测波长 283 nm;
流动相为甲醇水溶液 , 0%～ 100%梯度洗脱;流速
0.2 mL/min;柱温35 ℃。
质谱(MS)条件:APCI离子源 ,电极温度400°C ,
电晕(corona)电压-4.0 kV ,离子传输电压+55 V 、
温度250°C ,偏转电压 40 V ,检测器电压 1.6 kV ,氮
气流速 2.5 L/min ,采用选择离子监测(SIM)方式 ,扫
描间隔 1 s ,质荷范围(m z)50 ～ 700。
1.5　体外抗氧化活性试验
采用烘箱储藏法测定油脂抗氧化作用 。将纯猪
油 、添加一定量半边旗黄酮的猪油和添加0.1%维生
素C 的猪油分别置于65°C烘箱 ,按照国家标准GB T
5538-1995 ,每隔一定时间测定并计算其过氧化值
(POV)。即精密称取 2 ～ 3 g 混匀的样品 ,置于 250
mL碘量瓶中 ,加入氯仿-冰醋酸(2∶3)混合液 30 mL ,
使样品完全溶解 。加饱和碘化钾溶液 1 mL ,加塞 、
摇匀 ,在暗处放置 3 min ,加水 50 mL ,摇匀后立即用
0.02 mol L硫代硫酸钠标准溶液滴定至淡黄色时 ,
加 0.50%淀粉指示剂 1 mL ,继续滴定至蓝色消失为
止 。同时以空白试剂滴定为参比 。
POV=(v1-v2)×c×0.1269 m ×100%
式中 v 1 和 v2 分别为样品和空白试剂消耗 Na2S2O3
标准溶液的体积/mL;c 为硫代硫酸钠溶液的浓度
mol·L-1;m 为样品质量 g;0.1269为 1 mg 硫代硫酸
钠相当碘的质量数(g)。
2　结果与讨论
2.1　半边旗中黄酮的提取
植物中的黄酮常可用丙酮 、乙醇 、乙酸乙酯或水
来提取[ 7] ,最常用的是甲醇-水(1∶1),但上述溶剂的
直接提取物中往往包含较多的非黄酮类物质 ,影响
黄酮的分析和鉴定 。在本研究中 ,用体积分数 80%
的乙醇能从 500 g 半边旗全草中提取得到 180.3 g
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浸膏 ,浸膏密度 1.3 ,再依次用石油醚和氯仿除去浸
膏中极性小的脂溶性色素和中等极性的二萜类物
质 ,最后极性较大的黄酮苷及苷元则用乙酸乙酯提
取出来 ,提取物的成分如表 1。本工艺分离半边旗
中的黄酮类物质 ,排除了醇提物中的大量干扰物质 ,
有利于 HPLC-MS的分析鉴定 ,而且乙酸乙酯作为常
用溶剂 ,毒性低 ,适合于植物提取物的药学应用 ,乙
酸乙酯抽提所得的半边旗黄酮占乙醇总提物的
15%。
表 1　半边旗黄酮提取工艺各物质成分的含量
物质名称 性状描述 主要成分 质量 g 百分比 %
乙醇提取物 棕黑粘稠物 总混合物 12 100
石油醚抽提物 绿色油状液 脂溶性色素 0.6 5
氯仿抽提物 棕黄色无定形物 二萜类物质 8.89 74
乙酸乙酯抽提物 深棕色固体 黄酮类物质 1.88 15
图 2　薄板层析结果
1.芹菜素标准品;
2.木犀草素标准品;
3.半边旗黄酮粗品
2.2　半边旗黄酮的理化鉴定
半边旗黄酮粗品在硅胶薄板上展开 ,254 nm 紫
外灯下观察有三个斑点(如图 2),从上到下依次命
名为 1 、2 、3 ,其中 3为条带状 ,表明该物质分离不完
全。样品 1 、2的 Rf值分别和芹菜素 、木犀草素标准
品的 Rf值相同 ,提示这两种成分可能是芹菜素和木
犀草素。
显色反应表明 ,样品 1 、2的盐酸-锌粉反应都呈
阳性 ,Molish反应都呈阴性 ,提示该物质可能是游离
的黄酮苷元 ,样品 3的盐酸-锌粉反应呈阳性 ,Molish
反应呈阳性 ,经水解后 TLC试验检测到木犀草素和
葡萄糖 ,提示该物质可能是木犀草素和木犀草素葡
萄糖的黄酮苷。
紫外光谱研究表明 ,样品 1在甲醇溶液中有两
个吸收峰分别为 267.6 nm和 334.8 nm ,样品 2在甲
醇溶液中有两个吸收峰分别为 254.4 nm 和 349.4
nm ,结果如图 3 ,这和文献报道芹菜素和木犀草素的
紫外吸收峰分别相同[ 8] 。
图 3　半边旗黄酮成分的 UV光谱
　　综合 TLC试验 、显色反应及紫外光谱分析结果
表明 ,半边旗黄酮中可能含有芹菜素 、木犀草素以及
木犀草素葡萄糖苷 。
2.3　半边旗黄酮的液-质联用分析
黄酮类化合物的分析方法有分光光度法 、毛细
管电泳法[ 9] 以及高效液相色谱法。分光光度法仪器
便宜 、方法简便 ,但主要用于植物提取物总黄酮的含
量测定 ,不适合于对黄酮类物质单体的分析;毛细管
电泳影响因素复杂。高效液相色谱法具有操作方
便 、分析准确 、样品用量少的优点 。文献报道称木犀
草素的 HPLC 分析采用含磷酸的流动相能抑制解
离[ 10] ,减少拖尾 ,但是由于磷酸盐难以挥发 ,对联用
的质谱检测器会造成损伤。
本实验采用甲醇和水梯度洗脱的HPLC 分析方
法 ,流动相中不含磷酸 ,避免对质谱分析的干扰 ,梯
度洗脱能充分分离半边旗黄酮各单体物质。图 4b
为半边旗黄酮甲醇溶液经高效液相色谱在紫外检测
器 283 nm波长下的分离图谱 。采用质谱信息对半
边旗提取物的黄酮成分进行鉴定 ,确认其中 1号峰
为芹菜素 ,2号峰为木犀草素 , 3 ,4 , 5为木犀草素葡
萄糖苷的同分异构体 。图 4c为相同色谱条件下质
谱检测器的总离子图及选择性离子监测结果。
HPLC-MS 分析结果表述如下:
1号峰芹菜素的确认:将 1 号峰的保留时间与
芹菜素标准品对照 ,两者相同;此外 1号峰的质谱分
析和芹菜素标准品质谱也完全一致 ,在负离子扫描
条件下准分子离子峰(M-H)-均为 269。结合 TLC
试验的 Rf值以及紫外光谱分析表明半边旗黄酮中
含有芹菜素黄酮苷元 ,因此确认 1号峰为芹菜素 。
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图4　a.芹菜素和木犀草素标准品混合物的 HPLC 图(峰 1
为芹菜紊 ,峰 2 为木犀草素);b.半边旗黄酮的HPLC 图;c.半
边旗黄酮液质联用的总离子图
　　2号峰木犀草素的确认:将 2号峰的保留时间
与木犀草素标准品对照 ,两者相同:此外 2号峰的质
谱分析和木犀草素标准品的质谱也完全一致 ,在负
离子扫描条件下准分子离子峰(M-H)-均为 285。
结合 TLC 试验的 Rf值以及紫外光谱分析表明半边
旗黄酮中也含有木犀草素黄酮苷元 ,因此确认 2号
峰为木犀草素。
3 、4 、5号峰:在负离子扫描条件下准分子离子
峰(M-H)-均为 609 ,由于 TLC 及定性反应结果显示
半边旗黄酮中含有木犀草素葡萄糖苷 ,从而推测该
物质为1分子木犀草素和 2分子葡萄糖结合形成的
黄酮二糖苷。葡萄糖分子能够与木犀草素分子结合
形成糖苷键 ,在 C—或 O—不同部位结合成异构体
分子 ,这些异构体虽然相对分子质量相同 ,但由于糖
苷键位置不同使得分子极性不同 ,因此 HPLC 分离
出保留时间有差别的三个峰。至于糖苷键的具体结
合位置以及化合物分子的精细结构 ,有待进一步的
研究确证 。
2.4　半边旗黄酮体外抗氧化活性测定
以纯猪油为空白对照品 、以添加0.1%维生素 C
的猪油为阳性对照品 、以添加 0.1%、0.2%、0.3%半
边旗黄酮的猪油为供试样品 1 、2 、3 ,分别置于65°C
烘箱 ,每隔一天取样测定其过氧化值(POV)。结果
如表 2。可见 ,从半边旗中提取的黄酮成分对猪油
的氧化具有明显的抑制作用 ,且随着质量分数的增
大其抗氧化能力增强 ,0.2%半边旗黄酮的抗氧化活
性和对照品0.1%维生素 C相当 。
表 2　半边旗黄酮对猪油的抗氧化作用
时间
d
POV %
空白对照 阳性对照 供试品 1 供试品 2 供试品 3
1 0.102 0.0851 0.0912 0.0864 0.0825
3 0.117 0.0802 0.0984 0.0812 0.0783
5 0.171 0.0873 0.136 0.0932 0.0832
7 0.614 0.124 0.197 0.158 0.926
9 1.401 0.516 0.879 0.556 0.372
3　结论
　　半边旗全草经乙醇回流提取所得浸膏 ,依次用
石油醚 、氯仿 、乙酸乙酯抽提得到黄酮类物质 ,提取
结果表明半边旗黄酮占总提物的 15%。半边旗黄
酮经薄板层析 、显色反应及紫外光谱分析 ,初步确定
其中含有芹菜素 、木犀草素和木犀草素葡萄糖苷;经
HPLC-MS 联用分析 ,样品分离峰的保留时间及相对
分子质量分别和相应标准品的保留时间及相对分子
质量一致 ,进一步确证了半边旗黄酮的物质成分有
芹菜素 、木犀草素和木犀草素葡萄糖苷:半边旗黄酮
中含有木犀草素 、芹菜素等物质分子具有多酚结构 ,
这类物质分子能够提供活泼的氢质子 ,与油脂氧化
产生的自由基结合成较稳定的产物 ,从而阻断油脂
的自动氧化过程 ,因此是一类具有应用前景的天然
抗氧化剂。
植物化学成分的鉴定除常用的理化鉴定手段
外 ,HPLC-MS也常常被应用于植物活性成分的分离
分析[ 11] 。HPLC-MS不仅能分离结构相近的物质 ,而
且可以根据质谱信息鉴定被分离物质 。黄酮类化合
物是中草药中一类重要的药效成分 ,具有抗肿瘤 、抗
病毒 、抗氧化 、降血脂等广泛的生物活性。木犀草素
和芹菜素是两种具有代表性的天然黄酮苷元 ,能与
葡萄糖 、乳糖等结合形成糖苷存在于植物体 。半边
旗中黄酮的含量及物质成分和该草药的药效有一定
关系 ,本文的研究为半边旗草药资源的开发和应用
提供了依据 。
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(下转第 220页)
·208· 　　化　　学　　世　　界 2007年
70℃时水溶液表观粘度明显下降。对含 PEGMA 的
共聚物样品而言 ,在温度升高时表观粘度也有所下
降 ,但下降幅度不如 PEGMA含量为零的样品明显 。
这表明存在于PEGMA侧链间的分子缔合作用 ,使样
品在温度升高时仍能保持较高的表观粘度。
3　结　论
3.1　由于 PEGMA 侧链的分子间缔合作用 ,三
元共聚物水溶液中聚集体的粒径随 PEGMA 含量的
增大而增大。PEGMA含量增大时共聚物水溶液的
表观粘度增大明显 ,且PEGMA含量越高则水溶液剪
切变稀行为越明显 ,这是因为PEGMA有助于大分子
的相互缔合 ,而剪切作用导致PEGMA分子间缔合作
用被破坏所致。
3.2　含PEGMA的共聚物表观粘度对浓度的变
化更为敏感 ,且共聚物浓度越高 ,剪切变稀越明显。
三元共聚物水溶液在温度升高时仍能保持较高的表
观粘度 ,这也归因于PEGMA侧链的分子间缔合作用。
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(上接第 195 页)
　　3.3　加入有机助剂 ,进一步增强了钌与活性炭
载体表面的相互作用 ,促进了催化活性的提高 。
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