全 文 ：2009, Vol.26 No.5化学与生物工程
Chemistry & Bioengineering72　
基金项目:国家自然科学基金资助项目(3987099), 粤港合作项目(GHP022/06)
收稿日期:2009-02-01
作者简介:吕应年(1975-),男 ,湖北应城人 ,硕士 , 讲师 ,主要从事天然活性成分的研究。 E-mail:ly n7591@hotmail.com。
半边旗抗肿瘤活性成分 5F对照品的制备和鉴定
吕应年1 ,龚先玲1 ,Chen G G 2 ,吴科锋1 ,梁念慈1
(1.广东医学院广东天然药物研究与开发重点实验室 ,广东 湛江 524023;
2.香港中文大学威尔士亲王医院外科系 , 香港 沙田)
　　摘　要:制备并鉴定了半边旗抗肿瘤活性成分 11α-羟基-15-氧-16-烯-对映贝壳杉烷-19-酸(5F)的对照品。采用二氧
化碳超临界萃取 、有机溶剂萃取 、柱层析 、重结晶方法进行分离 、纯化以制备半边旗 5F 化合物单体;采用 T LC 、HPLC-
MS 检测杂质;采用 H PLC 峰面积归一化法测定纯度;采用理化性质 、波谱特征鉴定其化学结构。结果表明 ,从半边旗地
上部分的二氧化碳超临界萃取物中分离得到纯度为 99.2%的 5F 对照品。该对照品可以作为半边旗药材以及主要成分
为 5F的药物制剂含量测定的对照物。
关键词:半边旗;抗肿瘤;11α-羟基-15-氧-16-烯-对映贝壳杉烷-19-酸(5F);纯化;鉴定;对照品
中图分类号:O 657.63　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1672-5425(2009)05-0072-03
　　半边旗(P teris semipinnata L.),又名半边蕨 、半
边莲 、单边旗 ,系凤尾蕨属植物 ,是一种南方常用生药 ,
有止血 、生肌 、解毒 、消肿之功效 ,民间用于治疗吐血 、
外伤出血 、发背 、疔疮 、跌打损伤 、目赤肿痛等[ 1] 。半边
旗的乙醇及水提取物显示良好的体内外抗肿瘤活
性[ 2] ,研究表明 ,其主要活性物质是贝壳杉烷型四环二
萜化合物 11α-羟基-15-氧-16-烯-对映贝壳杉烷-19-酸
(Ent-11α-hydro xy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid , 简
称 5F ,图 1)。
图 1　5F结构式
Fig.1　Structural formula of 5F
药理学研究表明 , 5F 对 SPCA-1 、K562 瘤株有显
著的体外抗肿瘤活性[ 3] ,对荷瘤小鼠肝癌 HepA 、S180
在体内也有抗肿瘤活性 ,有潜力开发成临床用新药[ 4] 。
目前尚无 5F 对照品 ,且文献检索未发现 5F 对照品的
制备研究 ,这给半边旗药材的开发应用以及含 5F 的
抗肿瘤新药制剂研究造成极大的不便 ,作者在此进行
从半边旗中制备 5F 对照品的研究 ,拟为半边旗的开
发应用提供依据。
1　实验
1.1　材料 、试剂和仪器
半边旗植物采收于广东湛江郊区 ,经广东医学院
苟占平博士鉴定为凤尾蕨属植物半边旗。
石油醚 、丙酮 、醋酸 、氯仿等均为分析纯 ,广州华大
试剂公司;甲醇 、乙腈 ,色谱纯 ,天津四友化工试剂厂 。
GF254薄层层析用硅胶板(20 cm ×10 cm)、柱层
析用硅胶(200 ～ 300目),青岛海洋化工厂;D101型大
孔树脂 ,天津南开大学化工厂;ShimadzuUV-1600A 、
LC-MS 8000a型高效液相色谱-质谱联用仪(包括在
线脱气机 ,两台 LC 10AVP 高压输液泵 , SPD-10AVP
紫外检测器 ,柱温箱 , APCI 源接口 ,四极杆质谱检测
器),日本岛津制作所;LC1200型高效液相色谱(包括
四元泵 、DAD检测器 、在线脱气机 、LC1200 中文工作
站),美国安捷伦科技有限公司;175C-3UMA500型红
外光谱仪 ,美国伯乐科技有限公司;Mercury-Plus 300
型核磁共振波谱仪 ,美国瓦里安科技有限公司;A E204
型分析天平 ,瑞士梅特勒-托利多公司;四用紫外分析
仪 ,上海顾村仪器厂;M ILLI-Q型超纯水制备仪 ,美国
密理博科技公司。
吕应年等:半边旗抗肿瘤活性成分 5F对照品的制备和鉴定/2009 年第 5 期 73　
1.2　方法
取半边旗地上部分洗净晾干 ,粉碎成 40目粗粉 ,
按照文献[ 5]方法进行超临界二氧化碳萃取 ,提取液经
石油醚去除非极性脂溶性成分 ,加三氯甲烷萃取 ,萃取
液减压浓缩得到半边旗浸膏 。
称取浸膏 200 g ,加 20 BV无水乙醇溶解 ,加水至
乙醇含量为 70%,按照 1∶1体积比加石油醚萃取 ,萃
余液加水至乙醇含量为 30%,上大孔树脂柱分离 ,依
次用 30%乙醇 、45%乙醇 、55%乙醇洗脱 ,收集 45%乙
醇的洗脱液 ,减压蒸干得到类白色粉末 ,即半边旗 5F
粗粉。
称取 5F 粗粉 2 g ,用石油醚∶丙酮∶冰醋酸(7∶
3∶0.05 ,体积比)混合溶剂 30 mL 溶解 ,上硅胶常压
层析柱 ,用上述混合溶剂作流动相洗脱 ,每 10 mL 收
集一份 ,点样薄板层析 ,分别用 254 nm 紫外灯 、20%
硫酸-乙醇显色。合并显色呈紫红色斑点的组分 ,减
压蒸干得到白色粉末 ,即 5F 精制品 。
称取 5F 精制品溶解于适量丙酮中 ,加水到恰好
出现浑浊 ,充分混匀后静置于室温下结晶 ,收集白色针
状晶体 ,干燥即得 5F 对照品。
1.3　检测分析
1.3.1　T LC 分析
取制备的 5F 对照品适量 ,用甲醇溶解配制成 1
mg ·mL-1的样品溶液 ,用定量毛细管吸取 10 μL 点
样于硅胶板上 ,分别用石油醚∶丙酮∶冰醋酸(7∶3∶
0.05 ,体积比)、氯仿∶甲醇(95∶5)、石油醚∶乙酸乙
酯(8∶2)、二氯甲烷 ∶乙酸乙酯 ∶冰醋酸(6∶4 ∶
0.05)四种展开体系展开 ,取出晾干 ,硅胶板于 254 nm
紫外灯下检视 ,喷洒 20%硫酸-乙醇溶液后放入烘箱
105℃加热 10 min ,显色 。
1.3.2　HPLC-MS杂质检测
取制备的 5F 对照品适量 ,用甲醇溶解配制成 0.2
mg ·mL-1的样品溶液 ,进样 5 μL ,色质联用仪检测 。
色谱条件:色谱柱 Lichro spher C18柱(250 mm ×4.6
mm ,5 μm),流动相 50%甲醇溶液 , 流速 1.0 mL ·
min-1 ,柱温为室温 。质谱条件:A PCI离子源 ,电极温
度 400℃,电晕电压-4.0 kV ,离子传输电压+55 V ,
温度 250℃,偏转电压 40 V ,检测器电压 1.6 kV ,喷雾
氮气流速 2.5 L ·min-1 ,采用总离子流监测(TIC)方
式 ,扫描进样物质的总离子流 ,扫描范围(m/z)为 50 ～
700 ,扫描间隔 1 s。
1.3.3　HPLC归一法纯度测定
取制备的 5F 对照品适量 ,用甲醇溶解配制成
1.04 mg ·mL-1的样品溶液 ,进样 20 μL ,按如下色谱
条件检测:色谱柱 Hypsel C18柱(250 mm×4.6 mm , 5
μm),流动相甲醇-1%醋酸溶液(55∶45 ,体积比),流
速 1.0 mL·min-1 ,柱温 35℃,检测波长 254 nm 。按
峰面积归一化法计算该物质纯度 。
2　结果与讨论
2.1　HPLC-MS检测结果(图 2)
图 2　5F的 HPLC-MS图
Fig.2　HPLC-MS spectrum of 5F
由图 2可知 ,样品经高效液相色谱柱分离 ,仅产生
一个显著的离子峰 ,该离子峰经选择性离子监测发现
其离子主要为质荷比 331 的化合物 ,可能存在的杂质
物质 333和 345的含量几乎和噪声信号相当 ,表明在
纯化过程中几乎完全去除了与对照品结构相似的杂质
成分。
2.2　纯度测定结果(图 3)
图 3　5F的 HPLC图
Fig.3　HPLC spectrum of 5F
由图 3可知 ,样品经 HPLC分离只有一个主要吸
收峰 ,保留时间为 7.62 m in ,用二极管阵列检测器的
3D图谱显示该峰的纯度 ,表明该峰是单一成分 ,纯度
为 99.2%。
2.3　结构鉴定
2.3.1　理化性质
本品为白色针状结晶 ,熔点 254 ～ 258℃, TLC 喷
洒 20%硫酸-乙醇溶液 ,在 105℃加热10 min ,显色为
单一紫红色。
吕应年等:半边旗抗肿瘤活性成分 5F对照品的制备和鉴定/ 2009 年第 5 期74　
2.3.2　波谱分析(图 4)
图 4　5F的 APCI-MS图
Fig.4　APCI-MS image of 5F
ACPI-MS 分析发现质荷比[ M-H] -为 331 ,表明
该化合物分子量为 332。 UV λnm(CH 3OH):248;IR
(KBr ), ν, cm-1 :3479 、 2939 、 2875 、 1713 、
1646;1HNMR(Aceton , 300 MHz):5.846(H-17 ,
cis),5.243(H-17 , trans), 4.038(H-11), 3.048(H-
13),1.454(H-18), 1.018(H-20);13 CNMR(Aceton ,
300 MHz):15.6(C-20), 19.2(C-2), 20.4(C-6),
28.8(C-18), 34.5(C-14), 37.1(C-3), 37.5(C-13),
38.1(C-7), 39.1(C-10), 39.9(C-1), 41.0(C-12),
43.5(C-4), 49.1(C-8), 50.6(C-5), 56.3(C , 9),
65.2(C-11),110.9(C-17), 151.3(C-16), 178.8(C-
19),208.7(C-15)。经与文献[ 6] 对照 ,该物质被鉴
定为贝壳杉烷型四环二萜化合物 5F。
2.4　讨论
半边旗植物经二氧化碳超临界萃取 ,萃取液呈
墨绿色 ,主要是弱极性的叶绿素和中等极性的萜类
物质被提取出来;经有机溶剂分级萃取后 ,所得棕黄
色浸膏主要为总二萜酸类成分;再经大孔树脂分离 ,
浓缩 、干燥得到白色粉末 ,即为 5F 粗品 ,主要成分是
5F ,还含有少量其它二萜类杂质;5F 粗品经反复硅
胶柱层析分离和重结晶 ,结构相似的杂质二萜类成
分被进一步除去 , 5F 的纯度不断提高 ,达到对照品的
要求 。
文献报道[ 7] 在半边旗二萜的分离纯化过程中 ,有
抗癌活性的化合物 5F 中通常伴随有非活性成分 4F ,
两者结构相似 ,都具有贝壳杉烷型四环二萜基本结构 ,
分子量分别为332和334 ,仅相差两个氢原子 ,这给5F
对照品的纯化制备以及检测带来困难 。5F 和 4F 的结
构不同之处在于 5F 的 C-16和 C-17为双键连接 ,能够
和 C-15的羰基形成 α-、β-不饱和环戊酮结构 ,具有共
轭双键 ,有强烈的紫外吸收 ,而 4F 的 C-16和 C-17 为
单键连接 ,没有共轭双键 ,无紫外吸收 。
在 TLC 鉴别实验中 ,供试品可能含有无紫外吸收
的 4F ,因此仅用紫外灯检视还不能判断供试品是否为
5F 单一成分 ,需用显色反应作进一步的判断 。4F 和
5F 在喷洒 20%硫酸-乙醇为显色剂的硅胶板上加
热 ,分别显示粉红色和紫红色。本实验中 ,半边旗浸膏
经展开后紫外检视有多个斑点 ,表明其中含有多种成
分;5F 粗品展开后紫外检视只有一个斑点 ,但显色剂
显色后产生 R f 值不同的两个斑点 ,分别呈粉红色和
紫红色 ,表明是 4F 和 5F 的混合物;制备所得的 5F 对
照品分别用四种展开剂展开 ,在紫外灯下检视均只有
单一斑点 ,用显色剂显色 ,也只有单一斑点 ,表明实验
物质为单一成分的化合物。
在 HPLC 分析中 ,单独用紫外检测器 ,可以检测
出 5F 以及其它具有紫外吸收的杂质 ,但是 4F 没有紫
外吸收 ,在紫外检测器中不能产生色谱峰 ,因此要确定
制备的 5F 中是否含有 4F ,还需用质谱检测器确认 。
本实验中 ,质谱总离子流仅有一个离子峰 ,离子质荷比
为 331(5F),质荷比 333(4F)的离子峰几乎和噪声信
号相当 ,表明样品为单一的 5F 成分 。
3　结论
所制备的 5F 对照品经 TLC 和 HPLC-MS 确认
为单一化合物 , 采用峰面积归一化法计算纯度为
99.2%,达到了对照品的要求 ,可用于半边旗中 5F 的
含量测定 ,这对于半边旗药材及以 5F 为主要成分的
药物制剂的开发应用提供了可靠依据 。
(致谢:本文 NMR图谱由中国科学院广州化学所
潘文龙老师指导测试 ,红外图谱由广东医学院粤西高
校分析中心东野广智老师测定 ,特此致谢。)
参考文献:
[ 1] 　秦仁昌 ,邢公侠.中国植物志· 凤尾蕨科-PT ERIDACEAE(第三
卷第一分册)[ M] .北京:科学出版社 , 1990:46.
[ 2] 　李金华 ,梁念慈 ,莫丽儿 ,等.半边旗 5 种成分体外细胞毒活性比
较及构效关系分析[ J] .药学学报 , 1998 , 33(9):641-644.
[ 3] 　戴滨 ,崔燎 ,吴铁 ,等.半边旗有效成分 5F 注射液体内外抗肿瘤药
理作用研究[ J] .中国药理学通报 , 2003 , 19(5):508-511.
[ 4] 　吕应年 , Chen G G ,龚先玲 ,等.半边旗 5F 注射液的质量标准研究
[ J] .中国中药杂志 , 2008 , 33(20):2343-2346.
[ 5] 　邓亦峰 ,梁念慈.半边旗中二萜类化合物的二氧化碳超临界萃取
及 LC-M S分析[ J] .中草药 , 2004 , 35(2):145-147.
[ 6] 　Aoyam a K , Tanaka N , Suzuki N , et al.Chemical and chem otaxo-
nomic studies on the genus Pteri s and related gen era(Pter id ace-
ae).ⅩⅥ .New pterosin derivat ives f rom Pteri s wa l lichiana
Agard h.and P.semipinnata L.[ J] .Chem Pharm Bu ll , 1977 , 25
(9):2461-2464.
[ 7] 　吕应年 ,李彩虹 ,梁念慈 ,等.常压硅胶柱层析法分离制备高纯贝
壳杉烷型二萜[ J] .化学与生物工程 , 2006 , 23(9):60-62.
(下转第 78页)
付友珍等:近红外光谱法测定银杏叶提取液中总黄酮含量/ 2009 年第 5 期78　
Determination of Total Flavonoids Content in Ginkgo Biloba L.Extract
by Near Infrared Spectroscopy
FU You-zhen ,WANG Bing ,YANGTian-ming ,SUN Li-ying
(College of Pharmacy , South-Central Univ ersity f or Nationali ties ,Wuhan 430074 ,China)
Abstract:A rapid determination method for total f lav onoids in Ginkgo biloba L.ex t ract w as established
w ith near inf rared spectro scopy(NIR).A ccording to the relationship betw een the principal component and pre-
dictive residual erro r sum of square(PRESS)w ith total f lavonoids content obtained by high perfo rmance liquid
chromatog raphy(HPLC)as the reference standard for the modeling , PRESS w as the least w hen principal com-
ponent score w as 2.The reg ression coefficient w as 0.98206 by partial least squares(PLS)reg ression analy sis
and the reg ression coeff icient w as 0.96322 by cross-validation.The results indicated that the prediction model
had good stability .There w as a good linear relationship be tw een the de termination of total flavonoids in Ginkgo
bi loba L.ex t ract by HPLC method and the predict ive value by this method.Acco rding to t-test results , the tw o
methods that measured to tal flavonoids had no significant dif ference.The method w as rapid , simple and could
predict to tal flavonoids content in Ginkgo bi loba L.ext ract accurately .
Keywords:Ginkgo bi loba L.;total f lavonoids;partial least squares(PLS);reg ression analy sis;near inf rared
spectro scopy(NIR)
(上接第 71页)
Determination of Saponin in D.Zingiberensis Wright
by Fourier Transform Infrared Spectrometry
YUE Xia-li , LI Xue-gang
(Collegeo f B asic S ciences , Huazhong Agricultural Universi ty , Wuhan 430070 ,China)
Abstract:Saponin in D.Zing iberensis wright is determined by Fourier t ransfo rm inf rared spect rometry .
The re sults show that choo sing 1647 cm
-1
apex as analy tic apex , the IR absorbing intensity is rectilinear to sap-
onin content in the content range of 0.5%～ 5.0%.The co rrelat ion coef ficient is 0.9690.The average recovery
rate of saponin is 99.12%and RSD is 0.22%.This method can analyze saponin wi thout separation and abst rac-
tion.Lossless analy sis of saponin has been realized by pressing D.Zingiberensis wright direct ly.The resul t
de terminated by FTIR is similar to that by g ravimetric method.
Keywords:D.Zingiberensis wright;saponin;Fourier transfo rm inf rared spectrometry;quantitative analysis
(上接第 74页)
Preparation and Identification of An Antitumor Activted Compound 5F from
Pteris Semipinnata L.for Reference Substance
LU
··
Ying-nian1 , GONG Xian-ling1 , CHEN G G2 , WU Ke-feng1 , LIANG Nian-ci1
(1.Guangdong K ey Lab f or Research and Development of N atural Drugs , Guangdong Medical College ,
Zhanj iang 524023 , China;2.Department o f S urgery , Prince of Wales Hospital , Chinese
Universty o f Hongkong , Hongkong ,China)
Abstract:A chemical reference substance fo r the dete rmination of an antitumor actived compound 5F (ent-
11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid)in P teris semipinnata L.was prepared.The compound 5F w as iso-
lated and purified f rom the aerial part of Pteris semipinnata L.by supercri tial carbon diox ide ex t ract ion , org anic
solvent extact ion , column chromatog raphy and recry stalli zation.The purity of 5F w as detected by HPLC and
the stucture w as ident ified on the basis of phy sicochemical and spect rometric characteristics.The puri ty of 5F
w as 99.2%.The prepared 5F can be used as a chemical reference substance fo r the quality cont rol of P teris
sem ipinnata L.and the medicines w ith 5F as main component.
Keywords:Pteris sem ip innata L.;antitumor;ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid(5F);purifi-
cat ion;identif icat ion;refe rence substance