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溪黄草不同提取方法抗菌活性比较研究



全 文 :第 20卷 第 5期
Vol.20 No.5
2014年 5月
May.2014Guiding Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy
溪黄草不同提取方法抗菌活性比较研究*
张洪利,莫小路,汪小根(通讯作者)
(广东食品药品职业学院,广东 广州 510520)
[摘要] 目的:比较溪黄草不同提取方法的抗菌活性。方法:采用超临界CO2流体+乙醇作为夹带剂的提取方法获得了溪
黄草超临界提取物,与乙醇提取物、水提物抗菌活性进行了比较。结果:体外和体内抗菌方法研究均显示溪黄草超临界提取
物对金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的抑菌效果均高于EE和WE。结论:溪黄草应用超临界CO2萃取的SFE具有更好的抗菌活性,
可能部分与其较高含量的二萜化合物和脂肪酸有关。
[关键词] 溪黄草;超临界流体;抗菌
[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1672-951X(2014)05-0078-02
Comparative Antibacterial Qctivity of Rabdosin serra (Maxim) Hara Extracted by
Conventional and Supercritical Methods
ZHANG Hong-li, MO Xiao-lu, WANG Xiao-gen (Corresponding Author)
(Guangdong Food and Drug Vocational College, Guangzhou Guangdong 510520)
[Abstract] Objective: To compare antibacterial activity of Rabdosin serra (Maxim) Hara extracted by conventional and su-
percritical methods. Methods: Supercritical carbon dioxide modified with ethanol was used to obtain the extract of Rabdosin
serra(Maxim) Hara, namely SFE. The antibacterial activity of SFE was analyzed and compared with ethanol extract (EE) and
water extract (WE). Results: The results indicated that SFE showed better antibacterial activity than those obtained by ethanol
and water extraction. Conclusion: The higher total diterpenes and lipid acids may be related to its higher antibacterial effects.
[Key words] Rabdosin serra (Maxim) Hara;Supercritical fluid; Antibacterial effect
溪黄草rabdosin serra (Maxim) Hara是一种在民间被广
泛用于急性黄疸性肝炎、急性胆囊炎、痢疾和肠炎的草药。化
学成分研究表明其含有萜类化合物[1]和黄酮类成分[2],溪黄草
的提取物和一些有效成分被证明具有抗菌[3]、抗脂质过氧化[4]
和保肝活性等[5]。根据其较强的抗菌活性,能够抑制一些致腐
微生物的活性,在食品工业上可用于水果的保鲜 [6]。超临界
CO2流体萃取技术是一种常用的提取分离技术,其具有化学
惰性、无毒、无味、廉价、易去除等特点,主要用于药用植物非
极性成分的提取。并在食品领域得到广泛应用,主要用于天
然色素、香料、多不饱和脂肪酸的提取等。为提取极性成分,
经常加入极性有机化合物作为夹带剂增大极性。有研究表
明,某些药材的超临界提取物具有比传统提取方法提取物更
高的生物活性[7-9]。然而,溪黄草体不同提取方法抗菌活性比
较研究,特别是超临界提取物的生物活性研究还未见报道。
本文中对溪黄草超临界提取物、乙醇提取物和水提物对金黄
色葡萄球菌、绿脓杆菌活性的最低抑菌进行了比较,并比较
了3种提取物的体外和体内抗菌效果,研究了溪黄草不同工
艺提取物的抗菌活性,为溪黄草更安全、有效的应用于食品
工业提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与设备 溪黄草为唇形科香茶菜属植物溪黄草
Rabdosin serra (Maxim) Hara的全草。CO2为广州市科名气体配
套设备有限公司产品,无水乙醇为分析醇,ICR小鼠,18-22 g,
购自南方医科大学实验动物中心,12 h光照,(20±2)℃,(50%
±5%)湿度条件下饲养。金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus au-
reus)和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株来自广东食
品药品职业学院微生物教研室,菌种于营养琼脂培养基上
保存,于营养肉汤培养基上复苏。HL-(5+1)L/50MPa-ⅡB型超
临界流体(CO2)萃取装置(杭州华黎泵业有限公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 提取物的制备 超临界提取物(SFE):将100 g溪黄草
粉末加入到1L萃取釜内筒中,0.5×10-6m孔径的滤纸置于萃取
釜内筒两端以防止CO2将粉末带出萃取釜,萃取过程中萃取
压力和温度保持在30 MPa和60 ℃,加入100%生药量的乙醇
作为夹带剂,提取物常压下挥干CO2,60 ℃水浴条件下挥干乙
醇后即得。乙醇提取物(EE):50 g溪黄草粉末采用索氏提取
*基金项目:广东省科技厅粤港关键领域重点突破项目
(2009A030901011)
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1
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1
1
方药研究
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DOI:10.13862/j.cnki.cn43-1446/r.2014.05.030
Guiding Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy
第20卷 第5期
Vol.20 No. 5
2014年 5月
May.2014
(下转第85页)
菌种 革兰氏+/-
样品 浓度(mg/mL)
10 0 7 0.0 0 7 0.0
10 9 1.3 90.0 9 1.7 90.0
10 - - - 1 6.5 10.0
10 0 7 0.0 - - -
10 3 5.3 30.0 5 4.2 50.0
10 5 4.1 50.0 6 3.2 60.0
10 5 3.9 50.0 7 2.8 70.0
剂量
(g/kg)
样品 例数
器以10倍体积的95%乙醇为溶剂提取两次,每次30 min,合并
提取液后采用旋转蒸发仪挥去乙醇即得。水提物(WE):100 g
的溪黄草粉末用蒸馏水浸泡30min,然后煎煮两次,每次30min,
60℃水浴挥干水份后即得。
1.2.2 最低抑菌浓度(MIC)的测定 采用连续稀释法[10]以上
3种提取物,采用蒸馏水溶解到5 mg/mL初始浓度,采用过滤
除菌后即可用于抗菌实验。100 μL细菌培养液加入到含各浓
度药液的试管中,加棉塞盖住,37 ℃培养过夜,以未见生长的
药物最高稀释浓度为MIC。
1.2.3 体外抗菌实验 采用滤纸片扩散法[11]筛选抗菌活性,
10 mm直径滤纸片浸入到40 mg/mL的样品25 mL,放到事先接
种被试菌的营养琼脂培养基上,培养板在4℃条件下培养16 h,
待充分扩散后于37℃培养18 h,测量抑菌圈直径。
1.2.4 体内抑菌实验 参考玄参体内抑菌实验[12]略有改动,
金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌培养18 h后,采用5%酵母液稀释
到能够使80%-100%感染的小鼠致死的浓度。与空白对照组
比较,模型对照组死亡率90%,表明3.9×107 CFU/mL金黄色葡
萄球菌的干酵母悬液能引起小鼠明显死亡,作为正式实验的
感染菌液浓度。同样,与空白对照组比较,模型对照组死亡率
90%,表明8.7×107 CFU/mL绿脓杆菌的干酵母悬液能引起小鼠
明显死亡,作为正式实验的感染菌液浓度。金黄色葡萄球菌
使用头孢拉定作为阳性药物0.7 g/kg(折合临床给药3 g/60kg);
绿脓杆菌使用盐酸左氧氟沙星作为阳性药物0.14 g/kg(折合
临床给药0.6 g/60 kg)。选取小鼠120只,体重18-22 g,雌雄各
半,随机分为12组。6组小鼠用于金黄色葡萄球菌感染实验,分
别为:空白对照组、模型对照组、头孢拉定阳性对照组、SFE
组、EE组、WE组;6组小鼠用于绿脓杆菌感染实验,分别为:空
白对照组、模型对照组、盐酸左氧氟沙星阳性对照组、SFE组、
EE组、WE组。各组给药情况如下:将生药量为10 g/kg的溪黄
草提取物给小鼠连续灌胃7 d,1次/d;空白组和模型组灌胃等
量的生理盐水;阳性对照组感染前1 d给药1次。第8天将适宜
浓度的菌液0.5 mL/只注入小鼠腹腔,空白组注入等量的生理
盐水。感染后6 h,阳性对照组再给药1次,继续给药1 d。统计
小鼠平均存活时间和7 d内的平均生存率。
1.2.5 二萜类成分测定 二萜类成分测定采用紫外分光光
度法[13],以冬凌草甲素5.5-55.0 μg/mL作为对照品制定标准曲
线(r2=0.9995),以冬凌草甲素含量计二萜成分含量。
2 结果与分析
2.1 连续稀释法测定最低抑菌浓度(MIC) 溪黄草3种提取物
对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性菌(绿脓杆菌)
均有较好抑制作用,MIC值从小到大顺序依次为SFE结果显示SFE对测试菌种的抑制作用强于EE和WE。(见表1)
表1 溪黄草提取物的最低抑菌浓度
MIC(mg/mL)
SFE EE WE
金黄色葡萄球菌 + 1 2 3
绿脓杆菌 - 2 3 4
2.2 体外抗菌实验 3种提取物对金黄色葡萄球菌和绿脓杆
菌均有较好抑制作用,10 mg/mLSFE可显著抑制金黄色葡萄
球菌和绿脓杆菌的生长,抑菌圈直径分别为16.6 mm和10.9 mm,
对于绿脓杆菌的抑菌作用SFE强于WE和EE,对金黄色葡萄球
菌抑菌作用SFE与EE相似,但强于WE,体外抗菌实验显示SFE
的抑菌活性强于WE和EE,与MIC实验结果相一致。(见表2)
表2 溪黄草提取物体外抑菌实验作用
抑菌圈直径(mm)
金黄色葡萄球菌 绿脓杆菌
SFE 10 16.6 10.9
EE 10 16.7 8.6
WE 10 11.6 9.9
2.3 体内抑菌实验 3种提取物均能够降低金黄色葡萄球菌
和绿脓杆菌引起的小鼠死亡率并延长存活时间。同样,SFE比
WE、EE具有更强的抑菌活性,与MIC实验、体内抑菌实验结
果一致。(见表3)
表3 溪黄草提取物体内抑菌实验结果
金黄色葡萄球菌 绿脓杆菌
死亡数 平均存活 死亡率 死亡数目 存活时间 死亡率
(只) 时间(d) (%) (只) (d) (%)
对照组 -
模型组 -
盐酸左氧氟沙星 0.14
头孢拉定 0.7
SFE 1.0
EE 1.0
WE 1.0
注:-表示该组动物未给予该药物
2.4 溪黄草提取物二萜含量 结果显示,超临界萃取法较传
统提取方法可提取出更多的二萜类成分 [(2.33±0.014)%w/w]。
(见表4)
表4 溪黄草提取物二萜成分含量
样品 二萜成分(%,w/w)
SFE 2.33±0.014
EE 1.91±0.012
WE 1.41±0.015
3 小 结
二萜类化合物是具有四个异戊二烯结构的成分,被认为
具有抗菌、抗炎活性。溪黄草所含二萜类成分被证明具有较
强的抗菌活性[13]。有研究表明溪黄草乙醇提取物具有可显著
抑制细菌特别是金黄色葡萄球菌的生长 [3],且乙醇提取物二
萜化合物提取率高于水提物[14],与本研究结果一致。一些极性
成分在超临界流体中的溶解度很小,添加夹带剂可以显著增
加极性成分在超临界流体中的溶解度,包括二萜类成分。本
研究还显示,SFE对金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的抑菌作用
较EE、WE强,本文显示不同的提取方法提取溪黄草有效成分
的提取率不同,进而导致抗菌活性的差异。
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欢 迎 订 阅 欢 迎 投 稿
SFE常被用于脂类物质的提取,长链不饱和脂肪酸被公认
具有抗菌活性,脂肪酸也被用于食物添加剂抑制不必要的微
生物的生长[15]。超临界CO2萃取会得到较高含量的脂肪,酸也
可能是SFE高抗菌活性的物质基础之一。总之,溪黄草应用超
临界CO2萃取的SFE较传统的提取物具有更高的抑菌活性,结
果为超临界流体萃取这种环境友好的提取分离方法应用于
溪黄草有效成份开发利用提供了研究基础。然而,本文只探
讨了溪黄草3种提取方法对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗
菌活性,对于其它致病菌的活性还需进一步探讨。
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(收稿日期:2013-10-10 编辑:李海洋)
目前的研究现状看来,还存在研究手段单一,研究层次较浅
等不足之处。本实验将竹沥成分分析与药效分析相结合,实
验结论更具说服力。为进一步进行竹沥谱效学研究提供了参
考依据。
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