全 文 ：【文章编号】1005-4057( 2004) 03-0205-03
半边旗 5F对瘢痕成纤维细胞增殖和胶原合成的影响
左　强 ,张培华 ,罗少军 ,汤少明 ,梁　杰 ,张　刚 ,李　瑾
(广东医学院附属医学整形外科 ,广东湛江 524001)
【基金项目】广东省自然科学基金资助　 (项目编号: 036736)
【收稿日期】2003-12-04;【修订日期】2004-02-19
【作者简介】左　强 ( 1969-) ,女 ,学士 ,主治医师。
【摘要】目的:研究天然药物半边旗 5F对瘢痕成纤维细胞的作用 ,以期寻找新的治疗病理性瘢痕的有效药物。方法:以
四甲基偶氮唑盐 ( M TT )方法和吸光度检测法及逆转录聚合酶链反应 ( RT-PCR)法测定半边旗 5F对成纤维细胞增殖和培
养基中的胶原含量以及Ⅰ 、Ⅲ型前胶原 mRN A表达的影响。结果:半边旗 5F对成纤维细胞的增殖具有显著的抑制作用 ,还
能显著降低培养基中可溶性胶原的含量 (P < 0. 01)。 上述抑制作用呈现药物浓度和作用时间依赖性。 采用 RT-PCR法对
Ⅰ 、Ⅲ型前胶原的 mRN A检测显示随着药物质量浓度增高前两者的表达量降低。 结论:半边旗 5F对瘢痕成纤维细胞的增
殖和胶原合成具有显著的抑制作用 ,为寻找有效治疗病理性瘢痕的药物提供了新的思路。
【关键词】半边旗 ;成纤维细胞 ;增殖 ;胶原合成
【中图分类号】R 965　　【文献标识码】 A
Effect of compound 5F isolated fromPter is semipinnata L. on proliferation and
collagen synthesis of pathological scar-derived fibroblasts
ZUO Qiang ,Z HANG Pei-hua ,LUO Shao-jun , TANG Shao-ming ,L IANG J ie, Z HANG Gang , LI J in
( Depa rtment of Plastic Surg ery, Af filia ted Hospi tal of Guangdong
M edical Col leg e, Zhanjiang 524001 China)
【Abstract】Objective: T o study the effect o f compound 5F iso la ted from Pteris semipinnata L . ( PSL ) on pro lifera tion of
pa thological scar-deriv ed fibroblasts. Methods: Pro lif eration, collagen lev el, and m RNA expression o f type I and type Ⅲ
proco llag en o f scar-deriv ed fibroblasts wer e detected by M TT assay , pho tometry and RT-PCR, respectiv ely. Results: Fi-
broblast pro lifera tion, so luble co llagen content, and mRN A expression o f typeⅠ and typeⅢ proco llag en w ere significantly
inhibit ed by compound 5F in a dose-dependent manne r.Conclusion: Compound 5F can substantia lly inhibit the pro lifera tion
and co llagen synthesis of scar-de riv ed fibr obla sts in vitr o, and might be developed as a new drug fo r treation the pa tho lo gi-
ca l scar.
【Key words】Pteris semipinnata L ; fibroblast; pr olifer ation; colla gen synthesis
　　病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩 ,是以成
纤维细胞异常增殖、胶原大量合成、细胞外基质过度沉
积为组织学特点的皮肤纤维增生性疾病。 其发病率较
高 ,是影响烧伤和创伤患者康复的一大难题。成纤维细
胞 ( FB)是参与瘢痕形成的主要细胞 [ 1]。因此 ,探讨药
物对 FB的增殖及其胶原合成的影响 ,从而寻找安全、
有效、毒副作用小的药物是当前整形外科领域的重要
研究课题之一。本实验选用从天然药物半边旗中提取
的一种具有抗肿瘤活性 ,但毒副作用极小的成分——
二萜类化合物 5F[2, 3 ]作用于 FB,探讨 5F抑制瘢痕增
生的可能机制 ,以期为病理性瘢痕的防治提供实验依
据。
1　材料与方法
1. 1　实验材料
1. 1. 1　药物试剂　半边旗 5F由广东医学院天然药
物研究与开发重点实验室提供。半边旗 5F分子式为
C20 H28 O4 ,化学结构 112-羟基 -15氧 -16-烯 -对映贝壳
杉烷-19-酸 ,为白色针状结晶。 使用前制成钠盐 ,用
DMEM溶解 ,经 0. 22μm滤器除菌 , 4℃贮存备用。
DMEM 培养基 ( Gibco 公司 ) ; 四甲基偶氮唑盐
( M TT, Sigma公司 ) ;羟脯氨酸检测试剂盒 (南京建成
生物工程研究所 ) ; Trizo l总 RNA提取试剂盒 ( Gibco
公司 ) ; Superscipt逆转录试剂盒 ( Gibco公司 ) Taq酶
( Gibco公司 ) ;Ⅰ 型、Ⅲ型前胶原及内参引物 (上海生
205
　第 22卷第 3期
2004年 6月 　　　　　
广　东　医　学　院　学　报
JO URNAL OF GU ANGDONG M EDICAL COLLEGE
　　　　 Vo l. 22 No. 6　
Jun. 2004　
物工程有限公司 )。
1. 1. 2　 FB的来源　取自本科室病人手术切除的病理
性瘢痕组织 ,年龄 5～ 40岁 ,瘢痕生长时间为 3个月～
32 a,取材部位为颜面、前胸、四肢等。
1. 2　实验方法
1. 2. 1　 FB的培养　在无菌条件下 ,将术中取下的瘢
痕组织剪除结缔组织及表皮 ,剪成约 0. 5～ 1 mm3的
组织块 ,接种于 50 mL培养瓶 ,具体参考 Solomon
等 [4 ]的方法进行 FB原代及传代培养 ,实验选用第 3～
8代细胞。
1. 2. 2　半边旗 5F对 FB生长特性的影响　向对数生
长期 FB中加入不同质量浓度的半边旗 5F,以不加药
组作为对照。培养 48 h后 ,倒置显微镜下观察 FB的生
长状况及形态 ,并拍照。
1. 2. 3　半边旗 5F对 FB增殖的影响　采用改良
MT T比色法 [ 5]测定 ,将 FB接种于 96孔培养板 ,每孔
1× 104个细胞 ,加入 100 mL培养基。24 h后更换培养
基并加入不同 5F,同种药物质量浓度共做 8个平行孔
(重复 3次 ) ,以不加药组为对照。 于加药后 24、 48、 72
h,用酶标仪检测 A值 ,检测波长 570 nm,参考波长
630 nm。 抑制率 ( IR% ) = ( 1-用药组 A值 /对照组 A
值 )× 100%。
1. 2. 4　半边旗 5F对 FB胶原合成的影响　将细胞接
种于 24孔培养板 ,细胞密度 5× 104 /孔 ,每孔加入 1
m L培养基。接种 48 h后更换培养基 ,同时加入不同质
量浓度 5F,每一质量浓度设计 4个平行孔。 药物作用
48 h ,从每孔各吸取 0. 5 mL培养基 ,按羟脯氨酸
( HPr )检测试剂盒说明书方法测定培养基中 HPr含
量。用酶标仪 540 nm检测 A值 ,样品中 HPr质量浓度
( mg /L )= 测定管 A值×标准管质量浓度 /标准液 A
值 ;样品中胶原质量浓度样品 HPr质量浓度× 7. 46×
稀释倍数 ( 7. 46是从 HPr换算为胶原时的计算常数 )。
抑制率 IR= ( 1-用药组胶原含量 /对照组胶原含量 )×
100%。
1. 2. 5　半边旗 5F对 FBⅠ 型、Ⅲ型前胶原 mRNA表
达的影响　采用 RT-PCR法 ,依照 Trizol试剂盒说明
书进行操作。取对数生长期 FB,细胞密度 1× 106 ,加入
不同质量浓度 5F,以不加药组为对照。 5F作用 48 h
后 ,弃去培养基并收集细胞。用 Trizol、氯仿、异丙醇抽
提 FB总 RNA,逆转录为 DNA模板 ,进行 PCR扩增。
扩增参数: 预变性 94℃ , 6 min; 94℃ , 50s→ 55℃ , 50 s
→ 72℃ , 1. 5 min (共 32个循环 ) ; 72℃ ,延伸 5 min。
PCR产物经 1. 5%琼脂糖凝胶电泳 , UV P凝胶成像系
统中分析电泳结果。 Ⅰ 、Ⅲ型前胶原及内参引物序
列 [6, 7 ] (表 1)。
表 1　RT-PCR检测Ⅰ 、Ⅲ型前胶原及内参引物序列
　引物名称 　　　　　　序　　列 长度
( bp)
Ⅰ 型前胶原 5’ CTGGTCCCAAGGGTAACAG3’
5’ GCCAGGAGAACCACGT TC3’ 285
内参照
　 (β-肌动蛋白 )
5’ CCCATCACCATCTT CCAG3’
5’ AGAAGGTGGAAGCAGG3’ 574
Ⅲ型前胶原 5’ CTGCCA TCCAGAACT CAAGAGTGG3’
5’ CCATCCTCCTGAACT GTGT AGG3’ 447
内参照
　 ( GAPDH)
5’ TCCTGTGGCATCCACGAAACT3’
5’ GAAGCAT TT GCGGT GGACGAT3’ 313
1. 3　统计学处理
本实验数据资料用 x-± s表示 ,使用 SPSS11. 0统
计软件进行统计描述 ,采用单因素方差分析后 ,多个实
验组和对照组比较用最小显著差法 ( LSD法 )检验 , P
< 0. 05差异有统计学意义。
2　结果
2. 1　体外培养 FB的形态学改变
倒置显微镜观察可见正常存活 FB生长旺盛、密
集 ,呈平行极性排列 ,细胞晕清晰 ,形态规则 ,有扁平而
长的突起。用药组随药物质量浓度加大 ,细胞间隔增
宽 ,细胞缩小 ,突起缩短 ,细胞变圆 ,胞浆减少 ,染色质
浓缩边集 ,胞核模糊 (图 1-4)。
图 1　正常对照组 ;图 2　半边旗 20mg / L;图 3　半边旗 40 mg /L;图 4　半边旗 80 mg /L
2. 2　半边旗 5F对 FB增殖的影响
5F对体外培养 FB具有显著的抑制作用 ,其抑制
作用随药物质量浓度的增高和作用时间的延长而增强
(P < 0. 01) (表 2)。
206 　　　　　　　　　　　　广　东　医　学　院　学　报　　　　　　　　　　　　　 2004年第 22卷　
表 2　半边旗 5F对瘢痕成纤维细胞增殖的影响 ( x-± s,n= 24)
质量浓度
( mg /L )
抑制率 (% )
24h　　　　　　 48h　　　　　　 72h
20 34. 32± 0. 12 57. 21± 0. 09 70. 22± 0. 13
40 53. 56± 0. 16 77. 52± 0. 11 85. 12± 0. 15
60 64. 23± 0. 13 84. 17± 0. 06 89. 47± 0. 15
80 71. 02± 0. 18 94. 26± 0. 12 97. 79± 0. 12
　　行组间单因素方差分析 , P均 < 0. 01
2. 3　半边旗 5F对 FB胶原合成的影响
半边旗 5F对 FB胶原合成有显著抑制作用 ,随药
物质量浓度增高 ,抑制作用增强 (表 3)。
表 3　半边旗 5F对 FB胶原合成的影响 ( x-± s, n= 24)
质量浓度
( mg /L )
HPr
( mg /L )
胶原蛋白
( mg / L)
抑制率
(% )*
0 2. 19± 0. 12 16. 32± 1. 03 0
20 1. 91± 0. 22 14. 21± 1. 63 12. 03± 1. 01
40 1. 71± 0. 10 12. 82± 0. 65 21. 22± 1. 02
60 1. 48± 0. 09 10. 99± 0. 45 32. 65± 1. 16
80 1. 45± 0. 18 10. 84± 1. 32 33. 85± 1. 21
　　* 行组间单因素方差分析 , P < 0. 01
2. 4　半边旗 5F对 FBⅠ 、Ⅲ型前胶原的 mR-
NA表达的影响
RT-PCR产物电泳结果 (图 5、 6) ,由图可见随着药物
质量浓度加大 ,Ⅰ 、Ⅲ型前胶原 mRNA表达量逐渐减少 ,
呈剂量依赖性抑制Ⅰ 、Ⅲ型前胶原 m RNA的表达。
　　　 M: 100bp DNA Marker　 A:对照组
　　　 B: 20 mg / L　 C: 40mg /L　 D: 80mg / L
图 5　半边旗 5F对成纤维细胞Ⅰ 型前胶原表达的影响
图 6　半边旗 5F对成纤维细胞Ⅲ型前胶原表达的影响
3　讨论
含α、β-亚甲基环戊酮结构的化合物可经 Michael
加成反应与含巯基的酶结合 ,导致该酶失活 ,从而显示
这类化合物的细胞毒作用 ,半边旗 5F含有 α、β -亚甲
基环戊酮结构 [2 ]结合实验中形态学观察及 M TT结
果: 5F抑制 FB呈现细胞数减少 ,胞体缩小 ,变圆 ,突
起缩短、消失 ,胞浆减少 ,染色质浓缩边集 ,胞核模糊等
细胞凋亡的表现 ,提示 5F能够诱导 FB凋亡 ,抑制其
生长增殖。我们由此推测半边旗 5F抑制 FB增殖并诱
导其凋亡的作用可能与该化学结构有关。而 5F诱导
FB凋亡的具体机理有待深入研究。
胶原合成增加是病理性瘢痕中胶原过度沉积的重
要原因 ,增生性瘢痕组织中Ⅰ 、Ⅲ型胶原蛋白及 mR-
NA水平明显增高。本实验 RT-PCR结果显示 ,分别用
20～ 80μg /mL 5F处理 FB 48 h,Ⅰ 、Ⅲ型前胶原 mR-
NA表达下降 , 40μg /mL即可显著下调Ⅰ 、Ⅲ型前胶
原 mRNA表达水平。由此提示 5F呈剂量依赖性降低
Ⅰ 、Ⅲ型胶原 mRNA的表达水平 ,说明 5F对Ⅰ 、Ⅲ型
胶原的合成有抑制作用 ,且在Ⅰ 、Ⅲ型胶原的转录水平
已产生。该结果经查文献 ,未见报道。我们实验提示 ,
5F是治疗病理性瘢痕的有效候选天然药物。
羟脯氨酸是胶原蛋白中一种重要且含量稳定的氨
基酸 ,在其他组织中含水量甚微。因此 ,测量羟脯氨酸
的含量是检测胶原含量的可靠方法之一。 本研究发现
半边旗 5F对 FB培养基中的可溶性胶原具有显著的
抑制作用 ,呈现良好的剂量依赖性说明 5F对 FB胶原
合成的抑制在蛋白翻译水平也得到证实。
本研究初步证明 ,半边旗 5F具有抗病理性瘢痕
的 FB生长增殖 ,诱导其凋亡的作用 ,并可通过在转录
及翻译水平呈剂量依赖性降低Ⅰ 、Ⅲ型前胶原基的表
达而抑制 FB合成胶原。 为寻找治疗病理性瘢痕的有
效天然药物提供了新的思路 ,但仍需进一步行动物及
临床实验。
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