全 文 ：学 报
Journal of China Pharmaceutical University 2014，45(1) :92 － 96
半边旗中二萜类化合物 5F对乳腺癌生长和转移的体内
抑制作用
何振辉
1
，何太平
2
，翁闪凡
1
，黄越群
1
，覃燕梅
2
，梁念慈
3*
(1佛山科学技术学院医学院医学检验系，佛山 528000;2广东医学院生物化学与
分子生物学研究所，湛江 524023;3广东天然药物研究与开发重点实验室，湛江 524023)
摘 要 为研究半边旗中二萜类化合物 5F在体内对乳腺癌生长和转移的影响及其作用机制，以 MDA-MB-231 乳腺癌
原位移植模型观察 5F抗乳腺癌的效应。在治疗的同时，观察 5F对裸鼠的不良反应。以 ＲT-PCＲ、Western blot法检测 5F对
乳腺肿瘤组织血管内皮生长因子(VEGF)、激酶嵌入结构域受体(KDＲ)mＲNA和蛋白表达的影响。结果显示，5F通过减少
原发肿瘤体积和肺转移结节数目，显著抑制 MDA-MB-231 乳腺癌移植瘤的生长和肺转移。这种抑制转移的作用不依赖于
其对原发肿瘤的生长抑制作用。5F对裸鼠的肝肾功能无明显的影响。5F抗 MDA-MB-231 乳腺癌作用机制与 5F下调肿瘤
组织 VEGF、KDＲ mＲNA和蛋白表达水平有关。
关键词 半边旗提取物 5F;血管内皮生长因子;激酶嵌入结构域受体;转移;乳腺癌
中图分类号 Ｒ965 文献标志码 A 文章编号 1000 － 5048(2014)01 － 0092 － 05
doi:10． 11665 / j． issn． 1000 － 5048． 20140117
Inhibitory effect of the diterperoid compound 5F isolated from Pteris semipin-
nata L． on breast cancer growth and metastasis in vivo
HE Zhenhui1，HE Taiping2，WENG Shanfan1，HUANG Yuequn1，QIN Yanmei2，Liang Nianci3
1Department of Laboratory Medicine，Medical College，Foshan University，Foshan 528000; 2 Institute of Biochemistry and Molecular
Biology，Guangdong Medical College，Zhanjiang 524023; 3Guangdong Provincial Key Laboratory for the Ｒesearch and Development of
Natural Drugs，Zhanjiang 524023，China
Abstract The aim of this study was to investigate the effect and its possible mechanism of the diterperoid com-
pound 5F isolated from Pteris semipinnata L． on breast cancer growth and metastasis in MDA-MB-231 orthotopic
breast tumor xenograft model. The potential side-effects were monitored in addition to its therapeutic effect.
ＲT-PCＲ and Western blot were applied to detect the expression levels of vascular endothelial growth factor
( VEGF) ，kinase domain insert containing receptor ( KDＲ) in breast cancer tissue. Ｒesults showed that 5F signifi-
cantly suppressed breast cancer growth and metastasis in nude mice by reducing the volume of primate tumor and
the number of metastatic nodules in lung. Furthermore，5F suppressed metastases independent of its inhibitory
effect on primary tumor growth. 5F treatment exhibited no toxic effect on liver or kidney in nude mice. 5F can
suppress growth and metastasis of MDA-MB-231 breast cancer xenograft. Its mechanism may be involved in the
deduction of the expression levels of VEGF and its main receptor KDＲ in tumor tissue.
Key words 5F from Pteris semipinnata L． ; vascular endothelial growth factor; kinase domain insert containing
receptor; metastasis; breast cancer
This study was supported by the National Natural Science Foundation of China ( No． 39870900) ; the Foundation of Administration of
Traditional Chinese Medicine of Guangdong Province on the Construction of Chinese Medicine Strong Province ( No． 20111057) ; and
the Ｒesearch Project of Foshan University ( No． 2014006)
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* 收稿日期 2013-06-23 * 通信作者 Tel:0759 － 2388501 E-mail:ncliang@ gdmc. edu. cn
基金项目 国家自然科学基金资助项目(No. 39870900) ;广东省中医药局建设中医药强省课题资助项目(No. 20111057) ;佛山科学
技术学院校级科研基金资助项目(No. 2014006)
第 1 期 何振辉等:半边旗中二萜类化合物 5F对乳腺癌生长和转移的体内抑制作用
20 世纪 90 年代初，本课题组从半边旗(Pteris
semipinnata L．，PsL)全草中分离出若干个二萜类
化合物［1］。11α-羟基-15-氧-16-烯-ent-贝壳杉烷-19
酸(ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid)
是分离得到的第 5 个有效成分(fract) ，故命名为
5F。5F分子式为 C20H28O4，相对分子质量为 332. 4，
结构式见图 1。5F对肝癌、鼻咽癌、胃癌等多种肿瘤
细胞具有杀伤作用，其作用机制与 5F诱导肿瘤细胞
凋亡有关［2－ 3］。但 5F体内抗肿瘤效应的报道较少，
5F对乳腺癌生长和转移的影响，未见文献报道。本
研究以裸鼠动物模型研究了 5F 对乳腺癌生长和转
移的影响并分析了其可能的作用机制。
Figure 1 Chemical structure of 5F isolated from Pteris semipinnata L．
1 材 料
1. 1 药品和试剂
小牛血清(杭州四季青生物工程有限公司) ;
DMEM培养基(美国 Gibco 公司) ;PVDF 膜(美国
BD公司)。KDＲ、VEGF 小鼠 IgG 单抗、β-actin 山
羊 IgG 多抗(美国 Santa Cruz 公司) ，使用时以
TBST溶液按 1∶ 1 000 ～ 1∶ 2 000 稀释;辣根过氧化
物酶标记山羊抗小鼠 IgG、兔抗山羊 IgG(北京中杉
金桥生物有限公司) ，使用时以 TBST 溶液按
1∶ 4 000 ～ 1∶ 10 000 稀释。半边旗提取物 5F(广东
医学院天然药物开发中心) ，5F提取和纯化的方法
参照文献［4］进行。
1. 2 细胞株
人高转移乳腺癌细胞MDA-MB-231购自美国典
型培养物保藏中心(ATCC)。细胞在含体积分数为
10%小牛血清，1 ×105 U /L青霉素和 100 mg /L链霉
素的 DMEM完全培养基中，37 ℃、5% CO2 饱和湿
度孵箱培养。细胞经过消化传代，取对数生长期的
细胞进行实验。
1. 3 动 物
BALB /c(nu /nu)雌性裸鼠，6 ～ 8 周龄，体质量
18 ～ 20 g，由广东医学院实验动物中心提供并饲养
于该中心 SPF 级动物房，自由摄取水和食物。实
验动物生产许可证号:SCXK(粤)2008-008;实验动
物使用许可证号:SYXK(粤)2008-007。
2 方 法
2. 1 MDA-MB-231 原位移植模型
将 6 ～ 8 周龄的雌性裸鼠随机分成 4 组，每组
8 只，在每只裸鼠的乳腺脂肪垫接种 1. 5 × 106
MDA-MB-231 细胞，此后每周以 0，5，10，20 mg /kg
的 5F腹腔注射两次，持续 15 周。接种细胞后以游
标卡尺每周两次测量乳腺肿瘤的的长径(L)和宽径
(W) ，按照公式:肿瘤体积(V)= L ×W2 × 0. 523 6［5］
计算移植瘤的体积。接种细胞后第 15 周，处死动
物，解剖后，剥离乳腺肿瘤并称重，同时剥离小鼠肺，
在解剖显微镜下计数其表面白色转移结节的数目。
为排除乳腺原发肿瘤的生长速度对肺转移的
影响，做了另外一个实验。接种细胞和 5F 治疗如
前所述。但接种后每日监测乳腺肿瘤的体积，直到
原发肿瘤体积达到 2 100 mm3，处死动物，剥离小
鼠肺，在解剖显微镜下计数其表面白色转移结节的
数目。
2. 2 对裸鼠的毒性试验［6］
将 6 ～ 8 周龄的雌性裸鼠随机分成 4 组，每组
8 只，以 0，5，10，20 mg /kg 的 5F 每周腹腔注射两
次，持续 16 周。5F 处理期间，每日观察裸鼠的摄
食量、活动度等一般情况。每周两次测量小鼠的体
重。每周一次使用毛细管从眼眶静脉丛采血，抗凝
后分离血浆，在全自动生化分析仪上测量丙氨酸转
氨酶(ALT)的活性及肌酐(CＲE)的浓度，以评估裸
鼠的肝肾功能。
2. 3 Ｒeal-time PCＲ 检测肿瘤组织 mＲNA 表达
水平
在乳腺肿瘤组织中加入 Trizol 匀浆，提取总
ＲNA，逆转录为 cDNA，按照试剂盒说明配置 PCＲ反
应体系，在 Mx3000P 实时定量荧光 PCＲ 仪上进行
反应。反应参数为:94 ℃，10 s;55 ℃，20 s;72 ℃，
15 s。其中，预变性 5 min;共循环 40 次。引物序
列如下:VEGF 正义引物:5-CTCGCAGTCCGAGC-
CGGAGA-3，反义引物:5-GCAGCCTGGGACCACT-
TGGC-3;KDＲ 正义引物:5-AGGGTGG AGGT-
GACTGAG-3，反义引物:5-GAGTCAGT GGAGGT-
GGGA-3;GAPDH 正义引物:5-TCATTGACCT-
CAACTACATGGTTT-3，反义引物:5-GAAGATGG
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学 报 Journal of China Pharmaceutical University 第 45 卷
TGATGGGATTTC-3。记录各管循环阈值(CT) ，采
用 2 －△△CT法［7］进行相对定量。
2. 4 Western blot分析肿瘤组织蛋白表达水平
在肿瘤组织 100 mg中加入细胞裂解液 1 mL，
在匀浆器中匀浆后，置于碎冰上冰育 30 min，将裂
解液收集于预冷的 1. 5 mL 的 EP 管中，冰上超声
破碎细胞，4 ℃、12 000 r / imin离心 15 min。上清液
转移至另一个 1. 5 mL离心管中，取少量上清液用考
马斯亮蓝法进行蛋白定量。取相同含量蛋白样品
和 4 ×上样缓冲液以 3 ∶ 1的比例混合，100 ℃水中
煮沸 5 min 使蛋白质变性。进行 Western blot，以
β-actin为内参照分析目的基因的表达。
2. 5 统计学分析
实验数据以 珋x ± s表示，采用 SAS V8. 1 统计软
件进行重复测量方差分析或单因素方差分析。组
间两两比较用 SNK-q 检验。P ＜ 0. 05 表示差别具
有统计学意义。
3 结 果
3. 1 5F 对乳腺癌原发肿瘤生长和肺转移的的
影响
接种 MDA-MB-231 细胞后，以 5F 持续治疗，
使肿瘤形成时间延长，在 10，20 mg /kg 的剂量下，
成瘤时间分别为(14. 4 ± 1. 5)d 和(15. 6 ± 2. 1)
d，而对照组为(9. 2 ± 2. 2)d(P ＜ 0. 05)。与对照
组相比，10，20 mg /kg 的 5F 使乳腺癌原发肿瘤生
长更缓慢，体积更小，使肺转移结节数量明显减少。
结果如图 2 所示。
Figure 2 5F treatment inhibited primary tumor growth and lung metastasis in nude mice
Female BALB /c nu /nu mice were inoculated with MDA-MB-231 cells (1. 5 × 106 /mouse)into the mammary fat pads and received intraperitoneal in-
jection with different dose of 5F or PBS(control). A:Xenograft tumor grow curves;B:Primary tumor weight;C:Lung metastases. * P ＜ 0. 05 vs
control group
3. 2 5F 抑制乳腺癌的肺转移不依赖于其对原发
肿瘤的生长抑制效应
为了排除原发肿瘤的生长速度对肺转移的影
响，接种 MDA-MB-231 细胞后以 5F 持续治疗。让
各组原发肿瘤长至大约 2 100 mm3(此时原发肿瘤
的质量大致相等) ，然后处死小鼠，剥离小鼠肺，计
数其表面的白色结节，结果显示在原发肿瘤的体积
(质量)相等情况下，在 5F 10，20 mg /kg剂量组，肺
转移结节数量仍明显少于对照组，如图 3 所示。该
实验说明 5F抑制裸鼠乳腺癌肺转移的作用独立于
其抑制原发肿瘤生长的效应。
Figure 3 5F treatment inhibits lung metastasis independent of primary tumor growth in nude mice bearing breast cancer (珋x ± s，n = 8)
The mice were sacrificed until the volume of primary tumor reached 2 100 mm3. Volume (A) ，weight (B) ，and numbers of lung metastases (C)in
each group at the time of sacrifice. * P ＜ 0. 05 vs control group
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第 1 期 何振辉等:半边旗中二萜类化合物 5F对乳腺癌生长和转移的体内抑制作用
3. 3 5F对裸鼠的不良反应
以健康裸鼠为研究对象，观察 5F 对裸鼠潜在
的不良反应。在整个治疗期间，未发现裸鼠的摄食
量下降、活动度下降、体重减轻和其他明显的异常。
图 4 显示了 5F 首次腹腔注射后第 15 日和第 105
日时 ALT和 CＲE 的平均水平。其他时间点的检
测数据与之相似(数据未列出)。结果表明 5F 治
疗对裸鼠无明显不良反应。
Figure 4 Plasma levels of alanine aminotransferase (ALT)and creati-
nine after 5F treatment (珋x ± s，n = 8)
Blood samples were collected in day 15，105 after first injection of
5F. The mice received PBS treatment were used as controls
3. 4 5F对乳腺癌原发肿瘤组织的 VEGF、KDＲ 表
达的影响
治疗结束时对原发肿瘤组织匀浆后提取蛋白
和 mＲNA。结果表明，5F 显著下调原发肿瘤组织
中 VEGF及其主要受体 KDＲ mＲNA和蛋白的表达
水平。见图 5，6。
Figure 5 Effect of 5F on the expression of vascular endothelial growth
factor (VEGF) ，kinase domain insert containing receptor (KDＲ)mＲ-
NA in MDA-MB-231 orthotopic xenograft tissue (珋x ± s，n = 8)
* P ＜ 0. 05 vs control group
1:Control;2:5F(5 mg /kg) ;3:5F(10 mg /kg) ;4:5F(20 mg /kg)
Figure 6 Effect of 5F on the expression of VEGF，KDＲ protein in
MDA-MB-231 orthotopic xenograft tissue
4 讨 论
以往的 5F药理学研究多集中于对肝癌、肺癌
等肿瘤细胞的直接杀伤作用［8］。本课题首次研究
了 5F在体内模型中抗乳腺癌的作用。结果表明
5F能抑制裸鼠中乳腺癌的生长和转移，并且这种
治疗无明显的不良反应，提示 5F 可以作为乳腺癌
的潜在治疗药物。
研究表明，血管生成是乳腺癌等实体肿瘤生长
和转移的基础。肿瘤血管生成的首要环节，是肿瘤
血管生成因子与血管生成抑制因子失衡，血管生成
表型(angiogenic phenotype)形成。在诸多血管生
成因子中，血管内皮生长因子 VEGF 处于中心地
位［9］。VEGF在体内能够调节血管的通透性，在体
外能促进基质的降解、内皮细胞的增殖、迁移和血
管腔样结构的形成。有研究报道:在乳腺癌中，
VEGF与肿瘤微血管密度(MVD)、肿瘤体积及腋下
淋巴结转移呈正相关，VEGF 的含量是乳腺癌病人
预后的独立预测因子之一［10］。本研究显示在裸鼠
模型中 5F 下调肿瘤组织 VEGF 的表达，这一结果
与 5F在体外下调某些肿瘤细胞系 VEGF表达的体
外研究结果相一致［11－ 12］。这可能是 5F 抑制乳腺
癌生长和转移的原因之一。
VEGF的生物学活性是与其受体结合后发挥
作用的。目前，VEGF 受体已发现至少有 5 种:
VEGFＲ-1(Flt-1) ，VEGFＲ-2(KDＲ /Flk-1) ，VEGFＲ-
3(Flt-4) ，NP-1 和 NP-2［13］。KDＲ 是受体酪氨酸蛋
白激酶(receptor tyrosine kinase，ＲTK) ，主要在血管
内皮细胞上表达。VEGFＲ-2(KDＲ)是 VEGF 最重
要的受体，处于信号转导的上游。KDＲ 在 VEGF
所诱导的血管生成和血管通透性中起主要作用。
VEGF结合 KDＲ后通过 PLC-γ和 MAPK系统引发
一系列的生物学效应，如内皮细胞的增殖、运动，血
管通透性增加。单独使用 KDＲ 抑制剂，就能阻断
VEGF和 bFGF所诱导的血管生成［14］。近年来，有
文献报道乳腺癌细胞中存在 KDＲ、Flt-1 等受体，且
有 VEGF自分泌现象，显示了 VEGF系统在促进乳
腺癌细胞运动、侵袭、存活方面的重要意义［15］。本
研究表明，5F 下调裸鼠肿瘤组织 VEGF、KDＲ 表
达，显示 5F对肿瘤血管生成的干扰作用。但 5F抑
制乳腺癌肺转移的作用独立于其抑制原发肿瘤生
长的效应，提示 5F抗乳腺癌转移可能存在其他机
59
学 报 Journal of China Pharmaceutical University 第 45 卷
制。关于 5F抗乳腺癌转移的机制，仍有待于进一
步研究。
参 考 文 献
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