全 文 ：［基金项目］高等学校特色专业建设点（Ｎｏ．［２０１０］１５）；贵州省科技厅、贵阳医学院联合基金资助项目［黔科合ＬＧ［２０１２］０５４号］；贵州省科技
厅、贵阳医学院联合基金资助项目［黔科合ＬＧ［２０１２］０１２号］；贵州省科技计划课题 （编号：黔科合Ｊ字［２０１４］２０２７号）；地方高校国家级大学
生创新创业训练计划项目（编号２０１４１０６６００１４）；贵州省大学生创新创业训练计划项目（编号：２０１４１０６６００１４）；贵阳医学院附属医院博士基金
（编号：２０１４）　［作者简介］张姝，女，博士，副教授，研究方向：病原微生物学　［通讯作者］罗昭逊，Ｅ－ｍａｉｌ：２８６０３３０２３６＠ｑｑ．ｃｏｍ
头花蓼对幽门螺杆菌抗菌作用分析
张姝，罗昭逊，莫非，熊丽娟，王莹，张婉颖，袁昌增　 （贵阳医学院医学检验学院临床检验教研室，贵州 贵阳）
［摘要］　目的：探讨头花蓼对幽门螺杆菌（Ｈｐ）的抗菌机制。方法：采用琼脂稀释法检测头花蓼对幽门螺杆菌国际标准测序株
ＡＴＣＣ７００３９２的最低抑菌浓度（ＭＩＣ）；选用三氯醋酸／丙酮沉淀法收集药物作用前后的幽门螺杆菌全菌蛋白，应用双向凝胶
电泳技术（２－ＤＥ）和Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ技术检测头花蓼对幽门螺杆菌蛋白及基因表达水平的影响。结果：头花蓼对幽门螺杆菌国
际标准测序株 ＡＴＣＣ７００３９２的 ＭＩＣ为４　ｍｇ·ｍｌ－１；通过质谱技术鉴定出１０个差异蛋白点，其中延胡索酸还原酶黄素蛋白亚
基、烷基过氧化氢还原酶、粘附－巯基还原酶、非血红素铁蛋白仅在药物作用前的全菌蛋白中表达，乙酰脲利用蛋白 Ａ、亮氨酰
胺肽酶、过氧化氢酶在头花蓼作用后明显下调，而丙酰胺左旋门冬氨酸酶、延长因子Ｐ和 ＮＡＤＰＨ 黄素还原酶的蛋白表达则
在药物作用后上调；Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ结果显示头花蓼作用后幽门螺杆菌的过氧化氢酶基因、烷基过氧化氢还原酶基因、粘附－巯
基还原酶基因基因ｍＲＮＡ表达量呈减弱趋势，实验组与对照组相比，ｋａｔＡ的基因表达水平下调１．５２倍，ＴｓａＡ的基因表达水
平下调２．９４倍，ＴａｇＤ的基因表达水平下调３．６５倍（Ｐ＜０．０５）。结论：头花蓼对 Ｈｐ具有明显的抑制作用，是通过干扰和抑制
Ｈｐ蛋白表达水平和ｍＲＮＡ水平的发挥作用。
［关键词］　幽门螺杆菌；头花蓼；抗氧化系统基因；抑菌机制
［中图分类号］Ｒ９６９　［文献标识码］Ａ　［文章编号］１００１－５２１３（２０１５）０２－０１１３－０６　ＤＯＩ：１０．１３２８６／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｈｉｎｈｏｓｐｐｈａｒｍａｃｙｊ．２０１５．０２．０６
Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ　ｃａｐｉｔａｔｕｍ　ｏｎ　Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ
ＺＨＡＮＧ　Ｓｈｕ，ＬＵＯ　Ｚｈａｏ－ｘｕｎ，ＭＯ　Ｆｅｉ，ＸＩＯＮＧ　Ｌｉ－ｊｕａｎ，ＷＡＮＧ　Ｙｉｎｇ，ＺＨＡＮＧ　Ｗａｎ－ｙｉｎｇ，ＹＵＡＮ
Ｃｈａｎｇ－ｚｅｎｇ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｚｈｏｕ　Ｇｕｉｙａｎｇ　５５０００４，Ｃｈｉｎａ）
ＡＢＳＴＲＡＣＴ：ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ　Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ＴｏｕＨｕａｌｉａｏ　ｔｏ　Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ（Ｈｐ）．ＭＥＴＨＯＤＳ　
Ａｇａｒ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ａｄｏｐｔｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ｍｉｎｉｍａｌ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ＭＩＣ）ｏｆ　ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ　ｃａｐｉｔａｔｕｍ　ｔｏ　ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ－
ａｌ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｓｔｒａｉｎ　ＡＴＣＣ７００３９２　ｏｆ　Ｈｐ．ＴＣＡ／ａｃｅｔｏｎｅ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ａｄｏｐｔｅｄ　ｔｏ　ｃｏｌｅｃｔ　ｔｈｅ　Ｈｐ　ｗｈｏｌｅ　ｃｅｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂｅ－
ｆｏｒｅ　ａｎｄ　ａｆｔｅｒ　ｄｒｕｇ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ａｎｄ　２－ＤＥ　ａｎｄ　Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＴｏｕＨｕａｌｉａｏ
ｏｎ　ｔｈｅ　Ｈｐ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ．ＲＥＳＵＬＴＳ　ｔｈｅ　ＭＩＣ　ｏｆ　ＴｏｕＨｕａｌｉａｏ　ｔｏ　ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｓｔｒａｉｎ　ＡＴＣＣ
７００３９２　ｏｆ　Ｈｐ　ｗａｓ　４ｍｇ／ｍｌ．Ｔｅｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒａ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｍｏｎｇ　ｗｈｉｃｈ　Ｆｕｍａｒａｔｅ
ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　ｆｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｕｂｕｎｉｔ（ＦｒｄＡ），Ａｌｋｙｌ　ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＴｓａＡ），Ａｄｈｅｓｉｎ－ｔｈｉｏｌ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＴａｇＤ），Ｎｏｎｈｅｍｅ　ｉ－
ｒｏｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｆｅｒｒｉｔｉｎ（Ｐｆｒ）ｗｅｒｅ　ｏｎｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｗｈｏｌｅ　ｃｅｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂｅｆｏｒｅ　ｄｒｕｇ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｙ－
ｄａｎｔｏｉｎ　ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ（ＨｙｕＡ），Ｌｅｕｃｙｌ　ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ（ＬＡＰ），Ｃａｔａｌａｓｅ（ＫａｔＡ）ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｅｖｉｄｅｎｔｌｙ　ｂｙ　Ｍｉａｏ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ
ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ　ｃａｐｉｔａｔｕｍ，ｗｈｉｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　Ａｃｙｌａｍｉｄｅ　ａｍｉｄｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＡｍｉＥ），Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　Ｐ（Ｅｆｐ）ａｎｄ　ＮＡＤ－
ＰＨ－ｆｌａｖｉｎ　ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＦｒｘＡ）ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｂｙ　ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ　ｃａｐｉｔａｔｕｍ．Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｍＲＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ　ＫａｔＡ　ｇｅｎｅ，ＴｓａＡ　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ＴａｇＤ　ｇｅｎｅ　ｔｅｎｄｅｄ　ｔｏ　ｄｅｃｒｅａｓｅ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｔｏ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，ｋａｔＡ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｘ－
ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｂｙ　１．５２　ｔｉｍｅｓ，ＴｓａＡ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ　ｂｙ　２．９４　ｔｉｍｅｓ，ａｎｄ　ＴａｇＤ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ　ｂｙ　３．６５
ｔｉｍｅｓ（Ｐ＜０．０５）．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ　Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ　ｃａｐｉｔａｔｕｍ　ｈａｓ　ｏｂｖｉｏｕｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｈｐ　ａｎｄ　ｐｒｏｄｕｃｅｓ　ｉｔｓ　ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ
ｅｆｆｅｃｔｓ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｄｉｓｔｕｒｂａｎｃｅ　ａｎｄ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ　ａｎｄ　ｍＲＮＡ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　Ｈｐ．
ＫＥＹ　ＷＯＲＤＳ：Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ；Ｈｅａｄｄｒｅｓｓ　ｆｌｏｗｅｒ　ｓｍａｒｔｗｅｅｄ；ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｇｅｎｅｓ；ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ
　　幽门螺杆菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ，Ｈｐ）是定植
于胃黏膜表面的常见致病格兰阴性菌，与胃炎、胃
癌、胃 ＭＡＬＴ淋巴瘤的发生密切有关［１－３］，有效根除
Ｈｐ引起大家关注。然而 Ｈｐ对抗生素日趋耐药［４］，
研发新型抗 Ｈｐ药物成为临床治疗的迫切需求。
头花蓼是贵州苗族民间常用的一种中药材，目
前已通过大量的体内外实验证实其具有广谱抗菌作
用，不仅对革兰阳性菌（金黄色葡萄球菌、表皮葡萄
球菌等）、革兰阴性菌（大肠杆菌、变形杆菌等）、真菌
（石膏样孢子菌、石膏样癣菌等）。具有抑制作用，而
·３１１·中国医院药学杂志２０１５年１月第３５卷第２期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ｊａｎ　２０１５，Ｖｏｌ　３５，Ｎｏ．２
且对厌氧菌（消化球菌、消化链球菌等）同样具有抑
制效果［５］。但未见其对 Ｈｐ抗菌活性的研究报道。
本课题以头花蓼为研究对象，首次检测其对幽
门螺杆菌的影响，运用双向凝胶电泳技术（２－ＤＥ）其
对 Ｈｐ作用前后的全菌蛋白的表达差异，随后采用
Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ技术检测２－ＤＥ中具有表达差异的
抗氧化相关基因在 Ｈｐ作用前后基因表达水平。研
究头花蓼对 Ｈｐ的抑菌机制，为促进该类药物的深
层次开发，寻找高效低毒、特异性强、有效抗 Ｈｐ的
新型药物打下坚实的基础，同时为其将来应用于临
床治疗 Ｈｐ相关疾病提供充足的理论和实验依据。
１　材料
万古霉素（批号Ｌ００６２３Ｂ５０１１Ｚ）、两性霉素（批
号 ＬＪ０９０１Ｂ０１１１Ｚ）、 多 粘 菌 素 Ｂ （批 号
ＬＰ０４５０８３２５０）、ＴＭＰ（批号０００１１３２０８９）购于Ｓｉｇｍａ
公司；ＩＰＧ　ｐＨ３—１０　ＮＬ干胶条（批号１６３２０００）、
ＩＰＧ　ｂｕｆｆｅｒ（批号１４３２３００）、ＤＴＴ（批号２０１００２１９）、
尿素（批号 ＮＤＢＮ１２０４８５）、硫脲（批号２０１１０２１５）、
ＴＣＡ（批号 ＥＫＫＳ１４０６）、ＡＰ（批号 ＬＫ１０１３０２１５）、
ＩＡＡ（批号ＭＦＣＤ００００５６３６）购于Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉ－
ｅｎｃｅｓ公司；蛋白定量试剂盒（批号ＰＣ００１０２５００）购
于Ｂｉｏｍｉｇａ公司。ＴｒｉｚｏＬ（批号５０１７５１１１）购于Ｉｎ－
ｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ＲＮＡ反转录试剂盒（ＡＫ２２０３）、荧光
定量ＰＣＲ试剂盒（批号 ＡＫ５００１）购于 Ｔａｋａｒａ公
司；引物均由上海生工合成。
头花蓼浸膏粉，棕色粉末，批号２００１０４０１，生药
含量为８．７２　ｇ·ｇ－１，黄酮含量：１８．２　ｍｇ·ｇ－１，没食子
酸含量：１７．８　ｍｇ·ｇ－１，由贵州威门药业股份有限公
司提供。
幽门螺杆菌ＡＴＣＣ７００３９２国际标准测序株，购
自ＡＴＣＣ（美国菌种保藏中心），由本课题组保存。
２　方法
２．１　细菌培养与鉴定　从－８０℃冰箱中取出幽门
螺杆菌ＡＴＣＣ７００３９２，室温溶解后倾倒于哥伦比亚
血琼脂平皿内，涂布均匀，３７℃三气培养箱内培养
７２　ｈ（５％Ｏ２、１０％ＣＯ２、８５％Ｎ２，相对湿度９５％以
上），观察细菌生长情况，稳定传代３次后进行尿素
酶、触酶和氧化酶、革兰染色鉴定。
２．２　头花蓼对Ｈｐ抗菌作用检测　Ｈｐ微需氧培养
７２　ｈ后收获，刮取菌落，置于ｅｐｐ管中，加入预冷的
无菌脑心浸液肉汤混匀，３　０００×ｇ、４℃离心３　ｍｉｎ
后，弃上清，重复３次后，调配其浓度在３×１０８　ＣＦＵ
·ｍｌ－１，用无菌棉签沾取菌悬液均匀涂布于含不同
浓度的药物培养皿及空白培养皿上，每个药物浓度
涂抹３个平皿，置于微需氧环境中３７℃培养７２　ｈ。
以空白培养皿上 Ｈｐ生长良好的情况下，以含药培
养皿上未见 Ｈｐ生长的最小药物浓度为苗药头花蓼
对幽门螺杆菌 ＡＴＣＣ　７００３９２ 的最小抑菌浓度
（ＭＩＣ）。
２．３　双向电泳观察头花蓼对 Ｈｐ全菌蛋白的影响
２．３．１　Ｈｐ全菌蛋白的制备　按照文献［４－６］方法，
根据头花蓼对 Ｈｐ最低抑菌浓度的检测结果，选择
亚抑菌浓度（１／２ＭＩＣ浓度）含药平板上培养至４８　ｈ
后的 Ｈｐ　ＡＴＣＣ７００３９２设为实验组，同批未经头花
蓼处理的 Ｈｐ　ＡＴＣＣ７００３９２为对照组。分别取实
验组和对照组的 Ｈｐ菌液，用ＰＢＳ（ｐＨ７．４）洗涤，６
０００ｒ·ｍｉｎ－１，４℃离心５　ｍｉｎ，取沉淀后，分别加入５
ｍｌ　０．２％二硫苏糖醇（ＤＴＴ）、２０％三氯酸酸（ＴＣＡ）
丙酮溶液，置－２０℃冷冻过夜；６　０００　ｒ·ｍｉｎ－１、４℃
离心，１０　ｍｉｎ，去上清后加入５　ｍｌ　０．２％ ＤＴＴ丙酮
溶液，１２　０００　ｒ·ｍｉｎ－１、４℃离心，１０　ｍｉｎ，沉淀物重
悬于５　ｍｌ　０．２％ ＤＴＴ丙酮中，－２０℃冷冻４　ｈ，１２
０００ｒ·ｍｉｎ－１、４℃离心，１０　ｍｉｎ，将沉淀物－８０℃预
冻 ４　ｈ，真 空 冷 冻 干 燥，超 声 波 促 溶。
５　０００　ｒ·ｍｉｎ－１、４℃离心１０　ｍｉｎ，取上清分装，置－
８０℃保存备用。
２．３．２　全菌蛋白浓度检测　采用Ｂｉｏｍｉｇａ公司生
产的ＢＲＡＤＦＯＲＤ蛋白定量试剂盒操作说明书操
作。取蛋白标本３μｌ，加入５７μｌ的水使其稀释２０
倍，然后加入１．５　ｍｌ的染液，１０　ｍｉｎ后在５９５　ｎｍ
波长读取吸光度，根据标准曲线求出各样本的蛋白
浓度。
２．３．３　等电聚焦（ＩＥＦ）　参考ＩＰＧｐｈｏｒ等点聚焦
系统程序指南（所有液体均用超纯水配制），（１）加
样：在加样器中分别加入８００μｇ蛋白样品，ＩＰＧ
ｂｕｆｆｅｒ　２．２５μｌ，水化液补足至４５０μｌ，各加样器中分
别加入１．６　ｍｌ覆盖油。（２）ＩＥＦ：把加样器平行放于
等电聚焦电泳仪上，采用低电压溶胀，８５　８０５　ｖ／ｈ，
共计２５．５　ｈ。（３）平衡：ＩＥＦ结束后，分别取１０　ｍｌ
平衡储存液２份，各加入１００　ｍｇ　ＤＴＴ和４８０　ｍｇ
ＴＣＡ，将干胶条浸入其中，依次振荡平衡１５　ｍｉｎ。
２．３．４　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳　将平衡后的干胶条转至
１２．５％聚丙烯酰胺凝胶上，加０．５％低熔点琼脂糖封
好，电泳至溴酚蓝离下界面约５　ｍｍ处时停止电泳。
考马斯亮蓝染色用于制备型凝胶显色。
２．３．５　差异蛋白点图像扫描与分析　用 Ａｍｅｒ－
ｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ的扫描仪透射扫描，光学分辨率为
５００　ｄｐｉ，对比度与亮度采用软件默认值。考染凝胶
扫描后用保鲜膜包裹，４℃保存以便取点时使用。
数字化图像文件运用ＰＤｑｕｅｓｔ软件分析。
·４１１· 中国医院药学杂志２０１５年１月第３５卷第２期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ｊａｎ　２０１５，Ｖｏｌ　３５，Ｎｏ．２
２．３．６　质谱鉴定和蛋白质系列数据库检索　按照
ＡＢＩ　４７００型基质辅助激光解析串联飞行时间质谱
操作指南进行。利用 Ｍａｓｃｏｔ搜索引擎等将 ＭＡＬ－
ＤＩ－ＴＯＦ－ＴＯＦ／ＭＳ所测各蛋白点质量指纹谱数据
在Ｉｎｔｅｒ－ｎｅｔ上搜索 ＮＣＢＩｎｒ数据库，种属设定为
“Ｂａｔｅｒｉａ”和“Ｍａｍｍａ－ｌｉａｎ”。
２．４　Ｈｐ总ＲＮＡ提取　用脑心浸液肉汤分别将实
验组和对照组的 Ｈｐ调试成至３×１０８　ＣＦＵ·ｍｌ－１菌
悬液，然后各取１　ｍｌ，６　０００　ｒ·ｍｉｎ－１、４℃离心１０
ｍｉｎ。采用Ｔｒｉｚｏｌ法提取样品的总ＲＮＡ，用酶标仪
对提取的ＲＮＡ进行测定，计算ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比值和
ＲＮＡ浓度。总ＲＮＡ用１．０％琼脂糖凝胶电泳检测
ＲＮＡ的完整性。
２．５　反转录ｃＤＮＡ　按照ＴａＫａＲａ试剂盒说明书
进行操作，反应体系为：１μｇ总ＲＮＡ２μｌ　５×ｇＤＮＡ
Ｅｒａｓｅｒ　Ｂｕｆｆｅｒ，１μｌ　ｇＤＮＡ　Ｅｒａｓｅｒ，用 ＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅ
ｄｄＨ２Ｏ定容至１０μｌ，４２℃２　ｍｉｎ后，加入４μｌ　５×
Ｐｒｉｍｅ　Ｓｃｒｉｐｔ　Ｂｕｆｆｅｒ２（ｆｏｒ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ），１μｌ　Ｐｒｉｍｅ
Ｓｃｒｉｐｔ　ＲＴ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘ，１μｌ　ＲＴ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｍｉｘ，４μｌ
ＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅ　ｄｄＨ２Ｏ，３７℃１５　ｍｉｎ，８５℃５　ｓｅｃ，－２０
℃保存备用。
２．６　ＲＴ－ＰＣＲ　引物参照ＧｅｎＢａｎｋ上已发表的序
列，采用ｐｒｉｍｅｒ　５设计引物（跨内含子），引物序列
见表１。引物委托上海生工公司合成。５０μｌ反应
体系为：２μｌ　Ｐｒｉｍｅ　Ｓｃｒｉｐｔ　１　ｓｔｅｐ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘ，２５μｌ
２×１　ｓｔｅｐ　Ｂｕｆｆｅｒ，１μｌ目的基因的上、下游引物，２
μｌ　Ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＲＮＡ，１９μｌ　ＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅ　ｄｄＨ２Ｏ，
ｄｄＨ２Ｏ代替 ＲＮＡ模板作为阴性对照。反应条件：
５０℃３０　ｍｉｎ；９４℃２　ｍｉｎ；９４℃３０　ｓ，５８℃３０　ｓ，
７２℃１　ｍｉｎ，３０个循环，终止延伸。扩增结束后，将
５μｌ　ＰＣＲ产物用１％琼脂糖凝胶电泳进行检测，用
ＤＬ１０００　ＤＮＡ　ｍａｋｅｒ作为指示。同时将剩余的
ＰＣＲ产物送上海生工测序。
表１　ＰＣＲ的引物
Ｔａｂ　１　Ｔｈｅ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｏｆ　ＰＣＲ
基因 增加编号 引物序列（５’－３’） 片段长度／ｂｐ
ｇｒｙＢ　 ９０００５０　 ＣＣＣＴＡＡＣＧＡＡＧＣＣＡＡＡＡＴＣＡ
ＧＣＡＣＴＡＴＣＧＣＣＣＴＣＣＡＣＴＡＡ
１９２
ＫａｔＡ　８９９３９２　 ＧＧＧＴＴＡＴＧＡＧＣＧＡＴＡＧＧＧＧＴＡ
ＣＣＴＡＡＣＴＴＣＴＧＣＧＧＣＴＴＣＴＴＣ
１７０
ＴｓａＡ　８９９７２８　 ＡＣＡＡＡＡＣＴＴＧＣＣＣＣＡＧＡＣＴＴＴＡ
ＣＡＡＴＡＧＡＣＡＣＧＣＣＡＡＴＣＡＣＡＴＴ
２１７
ＴａｇＤ　 ８９９２２５　 ＧＡＴＡＡＡＧＣＣＣＣＴＧＡＴＧＴＧＡＡＡＴ
ＴＧＡＧＡＡＡＡＡＧＧＣＡＡＧＴＣＣＡＴＡＧ
２０６
２．７　实时荧光定量ＰＣＲ　２５μｌ　ＰＣＲ反应体系：目
的基因的上下游引物各１μｌ，ｃＤＮＡ 模板２μｌ，
ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　ＥＸ　ＴａｑＴＭⅡ（２Ｘ）１２．５μｌ，ＲＮａｓｅ
Ｆｒｅｅ　ｄｄＨ２Ｏ８μｌ，ＲＯＸ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｄｙｅ（５０×）０．５
μｌ。反应条件为：９５℃３０　ｓ，９５℃５　ｓ，６０℃３０　ｓ，
４０个循环。每一个样品３个技术重复，每组做３个
生物 重 复。每 次 ＰＣＲ 反 应 均 设 置 阴 性 对 照
（ｄｄＨ２Ｏ 代替ｃＤＮＡ 模板）。采用比较２－ΔΔＣＴ
法，对目标基因进行相对定量分析。
２．８　统计学分析　用ＳＰＳＳ　１７．５软件对相关数据
进行统计学分析，组间比较用ｑ检验，Ｐ＜０．０５为有
统计学差异。
３　结果
３．１　头花蓼对 Ｈｐ最低抑菌浓度的检测　以空白
平皿中 Ｈｐ生长良好为对照，在质量浓度≤１　ｍｇ·
ｍｌ－１的含药平皿中 Ｈｐ均生长状态良好，在质量浓
度２　ｍｇ·ｍｌ－１的含药平皿中其生长稀薄，在药浓度
≥４　ｍｇ·ｍｌ－１的平皿中均未见 Ｈｐ生长。取各浓度
含药平皿中的 Ｈｐ分别做革兰染色观察，发现药物
作用后的 Ｈｐ形态明显变细变长（图１）。
图１　Ｈｐ的形态观察
Ａ．对照组；Ｂ．实验组
Ｆｉｇ　１　Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｐ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ
Ａ．ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ；Ｂ．ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ
３．２　２－ＤＥ的平行性分析　通过对同一样品在相同
上样量条件下的３次２－ＤＥ图谱ＰＤｑｕｅｓｔ软件分
析，结果显示对照中检测到７５８±１５个蛋白点，实验
组中检测到７０３±１８个蛋白点，且对照组中蛋白点
匹配率为９１％，实验组中蛋白点匹配率为９４％，表
明３次２－ＤＥ的重复性较好。
３．３　对照组和实验组 Ｈｐ菌株间差异蛋白的分析
　实验组和对照组均分离到９６０多个蛋白点，其中
１０个点在存在明显的差异，详见图２、图３。经上海
博苑科技有限公司ＡＢＩ　４７００质谱仪分析，共鉴定出
１０个差异蛋白，分别为分别为延胡索酸还原酶黄素
蛋白亚基 （Ｆｕｍａｒａｔｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　ｆｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｕｂ－
ｕｎｉｔ，ＦｒｄＡ）、烷基过氧化氢还原酶（Ａｌｋｙｌ　ｈｙｄｒｏｐｅｒ－
ｏｘｉｄｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＴｓａＡ）、粘附－巯基还原酶（Ａｄｈｅ－
ｓｉｎ－ｔｈｉｏｌ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＴａｇＤ）、非血红素铁蛋白（Ｎｏｎ－
ｈｅｍｅ　ｉｒｏｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｆｅｒｒｉｔｉｎ，Ｐｆｒ）仅在药物作用前
的全菌蛋白中表达，乙酰脲利用蛋白 Ａ（Ｈｙｄａｎｔｏｉｎ
ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ，ＨｙｕＡ）、亮 氨 酰 胺 肽 酶
·５１１·中国医院药学杂志２０１５年１月第３５卷第２期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ｊａｎ　２０１５，Ｖｏｌ　３５，Ｎｏ．２
（Ｌｅｕｃｙｌ　ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ，ＬＡＰ）、过氧化氢酶（Ｃａｔａ－
ｌａｓｅ，ＫａｔＡ）在苗药头花蓼作用后明显下调，丙酰胺
左 旋 门 冬 氨 酸 酶 （Ａｃｙｌａｍｉｄｅ　ａｍｉｄｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ，
ＡｍｉＥ）、延长因子 Ｐ（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　Ｐ，Ｅｆｐ）、
ＮＡＤＰＨ黄素还原酶（ＮＡＤＰＨ－ｆｌａｖｉｎ　ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃ－
ｔａｓｅ，ＦｒｘＡ）的蛋白表达则在药物作用后上调。
图２　实验组和对照组 Ｈｐ菌株２－ＤＥ电泳图
Ａ．对照组；Ｂ．实验组 ；５７１１—延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基；
４３１３—ＮＡＤＰＨ黄素还原酶；３３１６—烷基过氧化氢还原酶；２３２２—非
血红素铁蛋白；５３０２—粘附－巯基还原酶；４７１１—乙酰脲利用蛋白Ａ；
５５０５—对亮氨酰胺肽酶；７６１４—过氧化氢酶；４５２４—组丙酰胺左旋门
冬氨酸酶；２３１６—延长因子Ｐ
Ｆｉｇ　２　２－ＤＥ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　Ｈ　ｐｙｌｏｒｉ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｓｔｒａｉｎ　ｉｎ　ｅｘ－
ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ
Ａ．ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ；Ｂ．ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ；５７１１－ＦｒｄＡ；４３１３ＦｒｘＡ；
３３１６－ＴｓａＡ；２３２２－Ｐｆｒ；５３０２－ＴａｇＤ；４７１１－ＨｙｕＡ；５５０５－ＬＡＰ；７６１－
ＫａｔＡ；４５２４－ＡｍｉＥ；２３１６－Ｅｆｐ．
３．４　ＲＮＡ的提取　提取样品的总ＲＮＡ经１％琼
脂糖凝胶电泳（图４）。可见真核生物明显２３Ｓ，１６Ｓ
条带较为清晰，且２３Ｓ与１６Ｓ条带的亮度之比约２∶
１，表明总ＲＮＡ无明显降解，酶标仪检测Ａ２６０／Ａ２８０
在２．０左右，表明提取 ＲＮＡ 较完整且无蛋白与
ＤＮＡ污染。
３．５　ＲＴ－ＰＣＲ产物　将５μｌ　ＰＣＲ产物进行１．０％
琼脂糖凝胶电泳。结果表明实验组和对照组内参基
因ｇｒｙＢ的片段，二者亮度相近，在１９２　ｂｐ出现特异
性条带，与理论值一致，测序得到的核苷酸序列，与
目标序列一致，同源性达１００％。实验组和对照组
的ＫａｔＡ基因、ＴａｇＤ基因、ＴｓａＡ基因（图５），各条
带所在位置与其理论值一致，亮度存在差异，条带亮
度明暗顺序为：试验组＜对照组。测序得到的核苷
酸序列，与目标序列一致，同源性达１００％，阴性对
照无扩增条带出现。
３．６　Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ结果　用荧光定量ＰＣＲ仪采
集对照组与实验组中内参基因ｇｒｙＢ，靶基因ｋａｔＡ、
ＴｓａＡ及ＴａｇＤ的荧光信号Ｃｔ值并进行融解曲线分
析，其产物的熔解曲线均为锐利单峰，且各自的熔解
温度 均 一，分 别 为８１．５℃、８２．５℃、８０．０℃ 及
８０．５℃。确定其扩增产物是唯一且具有特异性的。
图３　Ｈｐ蛋白差异点局部放大图谱
（注：５７１１－ａ与５７１１－ｂ分别为对照组和实验组：延胡索酸还原酶黄素
蛋白亚基；４３１３－ａ和４３１３－ｂ分别为对照组和实验组ＮＡＤＰＨ黄素还
原酶；３３１６－ａ和３３１６－ｂ烷基过氧化氢还原酶；２３２２－ａ和２３２２－ｂ分别
为对照组和实验组非血红素铁蛋白；５３０２－ａ和５３０２－ｂ分别为对照组
和实验组粘附－巯基还原酶；４７１１－ａ和４７１１－ｂ分别为对照组和实验
组乙酰脲利用蛋白Ａ；５５０５－ａ和５５０５－ｂ分别为对照组和实验组亮氨
酰胺肽酶；７６１４－ａ和７６１４－ｂ分别为对照组和实验组过氧化氢酶；
４５２４－ａ和４５２４－ｂ分别为对照组和实验组丙酰胺左旋门冬氨酸酶；
２３１６－ａ和２３１６－ｂ分别为对照组和实验组延长因子Ｐ）
Ｆｉｇ　３　Ｌｏｃａｌ　ｅｎｌａｒｇｅｄ　ｄｉａｇｒａｍ　ｏｆ　Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｏｔｓ
（Ｎｏｔｅｓ：５７１１－ａ　ａｎｄ　５７１１－ｂ：ＦｒｄＡ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉ－
ｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；４３１３－ａ　ａｎｄ４３１３－ｂ：ＦｒｘＡ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ
ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；３３１６－ａ　ａｎｄ３３１６－ｂ：ＴｓａＡ　ｏｆ　ｔｈｅ
ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；２３２２－ａ　ａｎｄ２３２２－
ｂ：Ｐｆｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；
５３０２－ａ　ａｎｄ　５３０２－ｂ：ＴａｇＤ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
ｇｒｏｕｐ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．４７１１－ａ　ａｎｄ　４７１１－ｂ：ＨｙｕＡ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ
ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．５５０５－ａ　ａｎｄ５５０５－ｂ：ＬＡＰ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｎ－
ｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．７６１４－ａ　ａｎｄ　７６１４－ｂ：
ＫａｔＡ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．４５２４－
ａ　ａｎｄ　４５２４－ｂ：ＡｍｉＥ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ　ｒｅ－
ｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．２３１６－ａ　ａｎｄ　２３１６－ｂ：Ｅｆｐ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉ－
ｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
·６１１· 中国医院药学杂志２０１５年１月第３５卷第２期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ｊａｎ　２０１５，Ｖｏｌ　３５，Ｎｏ．２
图４　幽门螺杆菌的ＲＮＡ电泳图
１．实验组 Ｈｐ的ＲＮＡ；２．对照组 Ｈｐ　ｔｏｔａｌ的ＲＮＡ
Ｆｉｇ　４　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｏｆ　Ｈｐ　ＲＮＡ
１．Ｔｈｅ　Ｈｐ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ；２．Ｔｈｅ　Ｈｐ　ｔｏｔａｌ
ＲＮＡ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ
图５　ＧｒｙＢ基因、ＫａｔｅＡ基因、ＴａｇＤ基因和ＴａｓＡ 基因电泳图
Ｆｉｇ　５　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ＧｒｙＢ　ｇｅｎｅ，ＫａｔｅＡ　ｇｅｎｅ，ＴａｇＤ
ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ＴａｓＡ　ｇｅｎｅ
各扩增曲线均为典型的“Ｓ”形。４个基因无引物二
聚体形成所产生的非特异性荧光。以ｇｒｙＢ基因作
为内参，采用２－ΔΔＣＴ法对幽门螺杆菌ｋａｔＡ、ＴｓａＡ及
ＴａｇＤ基因在头花蓼作用前后的表达差异进行分
析。在头花蓼作用前后幽门螺杆菌ｋａｔＡ、ＴｓａＡ及
ＴａｇＤ基因均有表达，表达量呈减弱趋势，实验组靶
基因与对照组相比，ｋａｔＡ的基因表达水平下调１．５２
倍，ＴｓａＡ的基因表达水平下调２．９４倍，ＴａｇＤ的基
因表达水平下调３．６５倍（Ｐ＜０．０５）（图６）。
４　讨论
目前普遍采用国际标准三联疗法对 Ｈｐ感染进
行治疗。该疗法的副作用大，同时容易产生 Ｈｐ的
耐药株，为进一步治疗增加难度。此外还有很多的
不良反应。头花蓼作为贵州苗族民间常用药材目前
已证实具有广谱抗菌效果，其对 Ｈｐ抗菌活性的研
究尚未见报道。结果显示头花蓼水溶液作用于 Ｈｐ
７２　ｈ后 ＭＩＣ为４　ｍｇ·ｍｌ－１，且随着药物浓度的增加
对 Ｈｐ的抑菌活力也逐渐增强，表明头花蓼对 Ｈｐ
具有良好的抑菌效果，作为一种天然的抑菌制剂，有
望成为抗 Ｈｐ的新型中药。同时在实验中发现 Ｈｐ
在非致死量药物浓度作用后形态明显变细变长，呈
丝状体。有文献曾报导 Ｈｐ在含１μｇ·ｍｌ
－１胺曲南
和０．０１μｇ·ｍｌ
－１氨芐青霉素作用下，也可由螺旋状
转变成丝状体，提示丝状体的形成是细菌适应性调
节的表现形式，从而能够适应环境以达到生存的目
的［７］。因此推测非致死量的头花蓼作用后的 Ｈｐ分
裂虽然被抑制但生长并未终止，细菌进入非分裂状
态，表明药物已通过某种途径作用于细菌的某个或
几个关键系统，改变了细菌的正常生理功能状态，从
而抑制了细菌的生长。
图６　ＫａｔｅＡ基因，ＴａｇＤ基因和ＴａｓＡ 基因在头花蓼作用前后的相
对表达量
（注：与模型组比较，＊Ｐ＜０．０５）
Ｆｉｇ　６　Ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｍＲＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＫａｔｅＡ　ｇｅｎｅ，ＴａｇＤ　ｇｅｎｅ
ａｎｄ　ＴａｓＡ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ
（＊Ｐ＜０．０５　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ　ｖｓ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ）
　　在实验初期对现有的２－ＤＥ系统在分离 Ｈｐ的
全菌蛋白方面进行了评价，显示本实验的２－ＤＥ系
统具有良好的重复性，实验所选的对照为自身对照，
充分发挥了２－ＤＥ的优势，这为寻找苗药头花蓼作
用 Ｈｐ前后差异表达蛋白提供了基础。本研究选用
亚抑菌浓度１／２　ＭＩＣ作为头花蓼研究浓度，即在２
ｍｇ·ｍｌ－１药物作用下的 Ｈｐ为实验组，同批生长的
未经头花蓼作用的 Ｈｐ为对照组，发现１４个具有差
异的蛋白点，其以 Ｈｐ能够在体内定植和体外存活
密切相关［８－９］。Ｐｆｒ是一类含铁但不含血红素的蛋
白，是 Ｈｐ细胞内参与铁储存和分布的重要蛋白，其
表达提示 Ｈｐ增殖旺盛［１０］。有研究显示Ｐｆｒ不仅可
保证细菌在铁离子缺乏时的繁殖，维持细菌的能量
代谢和氧化还原代谢［１１］。本研究结果显示头花蓼
作用后的细菌非血红素铁蛋白未表达，说明药物可
通过影响细菌对铁的利用而干扰细菌的能量代谢和
氧化还原代谢功能，进而抑制细菌的生长。
ＨｙｕＡ可水解焦谷氨酸，而ＬＡＰ具有水解多种
氨基酸，如精氨酸、丙氨酸、甘氨酸等的作用［１２－１３］。
这两种蛋白酶可确保足够的氨基酸从多肽中释放。
本研究也显示 Ｈｐ在头花蓼的作用下 ＨｙｕＡ 和
ＬＡＰ的表达量均下调，提示药物也可通过影响氨基
酸的代谢从而抑杀 Ｈｐ。
·７１１·中国医院药学杂志２０１５年１月第３５卷第２期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ｊａｎ　２０１５，Ｖｏｌ　３５，Ｎｏ．２
同时实验中也发现 ＡｍｉＥ、ＥＦ－Ｐ、ＦｒｘＡ在头花
蓼作用后表达上调。ＡｍｉＥ是 Ｈｐ除尿素酶外产氨
的关键酶，可水解短链脂肪酰胺生成相应的有机酸
与氨。ＥＦ－Ｐ与肽键的合成有关，参与将氨基酰－ｔＲ－
ＮＡ转运至核糖体上，促进蛋白质的合成。ＦｒｘＡ可
催化核苷酸的代谢，促进ＡＴＰ的生成。推测 Ｈｐ在
药物的作用下试图通过增加对短链脂肪酰胺的水
解、肽键的合成、核苷酸的生成，以调节机体能量代
谢平衡，此为 Ｈｐ应对不利应激环境时所作出的一
种反应性调节。
Ｈｐ是一种对氧敏感的微需氧菌，菌体内含有
多种抗氧化蛋白，其中以过氧化氢酶、烷基过氧化氢
还原酶及粘附－巯基还原酶含量最丰富，具有高活
力、稳定并高度保守［１４］。在 Ｈｐ感染引起的炎症反
应中，中性粒细胞通过呼吸爆发可产生大量的氧自
由基，对 Ｈｐ的生存构成威胁［１５］。ＫａｔＡ、ＴｓａＡ 和
ＴａｇＤ 在解除氧自由基对 Ｈｐ的杀伤及维护自身氧
代谢平衡中其重要作用，使微需氧的 Ｈｐ能逃避宿
主的抵御和清除，在富含超氧离子的不利环境中生
存［１６－１７］。本课题通过采用２－ＤＥ技术发现头花蓼作
用于 Ｈｐ后的ＫａｔＡ、ＴｓａＡ 和ＴａｇＤ的蛋白表达水
平下调，运用实时荧光定量ＰＣＲ技术检测 Ｈｐ在头
花蓼作用前后过氧化氢酶基因表达水平的改变，结
果显示：头花蓼作用后ＫａｔＡ 的基因表达水平下调
１．５２倍，ＴｓａＡ的基因表达水平下调２．９４倍，ＴａｇＤ
的基因表达水平下调３．６５倍（Ｐ＜０．０５），说明头花
蓼可通过影响 Ｈｐ的抗氧化系统而减弱其在体外的
生存能力，从而起到抗 Ｈｐ的功效，同时推测药物也
能通过影响 Ｈｐ的抗氧化系统干扰其在机体内的定
植，减小 Ｈｐ的致病性，而这很有可能成为头花蓼的
一个重要药物作用靶点。
因此推测头花蓼作用于 Ｈｐ后，通过影响 Ｈｐ
的抗氧化系统、能量代谢系统以及参与应激反应相
关蛋白使细菌的生长代谢受到显著的影响，同时干
扰其在机体内的定植密度和降低减弱 Ｈｐ在体外的
生存能力，从而起到抗 Ｈｐ的功效。
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ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ａｎｄ　ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ｉｎ　Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ－ｉｎ－
ｆｅｃｔｅｄ　ｈｕｍａｎ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｓ：ｐｏｓｓｉｂｌｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｉｎｔｅｒｆｅｒ－
ｏｎ－ｇａｍｍａ　ｉｎ　ｐｏｌａｒｉｚｅｄ　ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ，
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Ｓｔｒｅｓｓ　ａｎｄ　Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ［Ｍ］／／Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｏｄ－
ｅｌｓ．Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ，２０１１：３４３－３７０．
［收稿日期］２０１４－０５－１０
·８１１· 中国医院药学杂志２０１５年１月第３５卷第２期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ｊａｎ　２０１５，Ｖｏｌ　３５，Ｎｏ．２