全 文 ：收稿日期：2009- 03- 28
*基金项目：湖北省自然科学基金（No：2007ABA080）
[通信作者] 张淑玲，Tel：027- 62629209
草木犀，豆科(Leguminosae)草木犀属(Melilotus)
一年生或二年生草本植物，是临床用于抗炎的一种
中草药。然而，草木犀产生抗炎作用的分子生物学机
制还不明确。本实验拟通过 LPS刺激 RAW 264.7
小鼠巨噬细胞系建立炎症细胞模型[1]，并检测草木犀
正丁醇提取物干预前后炎症介质的变化，对其在炎
症中的作用进行初步研究。
1 材料和方法
1.1 材料
文章编号： 1005- 8982（2009）19- 2893- 04
·论著·
草木犀正丁醇提取物对小鼠巨噬细胞促炎介质的影响*
庞 然 1，张淑玲 1，赵 雷 1，叶 翩 1，董继华 2
（华中科技大学同济医学院协和医院 1 .感染科；2.中心实验室，湖北 武汉 430022）
摘要：目的 研究草木犀正丁醇提取物在体外的抗炎作用。 方法 通过 LPS干预 RAW264.7 细胞系建立
炎症细胞模型，使用 1、5和 10 mg/ L 3种浓度的草木犀正丁醇提取物对其进行干预。ELISA法检测药物干预
前后上清液中 TNF- α、IL- 1β和 IL- 6的分泌量，Griess反应测定 NO 水平；实时荧光定量 RT- PCR 检测
TNF- α、iNOS和 COX- 2的 mRNA表达；Western blot法检测 COX- 2的蛋白表达水平。 结果 草木犀正
丁醇提取物干预后，上清中 TNF- α、IL- 1β、IL- 6和 NO 含量与模型组相比均显著降低（P <0.01），并存在剂
量依赖关系；干预后细胞 TNF- α，iNOS和 COX- 2的 mRNA表达水平显著降低（P <0.01），也存在剂量依赖
关系；草木犀正丁醇提取物及 DM干预后 COX- 2蛋白水平明显降低（P <0.01）。 结论 草木犀正丁醇提取物
可以下调 TNF- α、IL- 1β、IL- 6、NO 和 COX- 2等炎症介质的表达，该药物体外抗炎作用可能通过抑制这些
炎症介质而产生。
关键词：草木犀；正丁醇；RAW 264.7细胞系；炎症介质
中图分类号：R- 332 文献标识码：A
Effect of n-butanol extract from Melilotus on pro-
inflammatory factors in murine macrophages*
PANG Ran1, ZHANG Shuling1, ZHAO Lei1, YE Pian1, DONG Jihua2
(1.Department of Infectious Diseases, Huazhong University, 2. Central Laboratory,
Union Hospital, and Technology, Wuhan Hubei, 430022, P.R.China)
Abstract:【Objective】To investigate the anti -inflammatory mechanism of n -butanol extract from Melilotus
suaveolens Ledeb(MSL) in vitro.【Method】The cell model was established by lipopolysaccharide(LPS) induction on
the RAW264.7 macrophages cell line. ELISA assay was used to measure the secretion of TNF-α, IL-1β and IL-6 in
the supernatant of MSL treated and untreated macrophages. The mRNA expression of TNF-α, iNOS，COX-2 and the
protein expression of COX-2 were detected by real-time PCR and Western blot respectively.【Results】The secretion
levels of TNF-α, IL-1β, IL-6 and NO were significantly lower in the supernatant of MSL treated macrophages than
those in the controls (P <0.01). We also found significant differences among the mRNA expression of TNF-α, iNOS
and COX-2 between the supernatant of MSL treated and untreated macrophages, as well as the protein expression of
COX-2(P <0.01).【Conclusion】 The n-butanol extract from Melilotus suaveolens Ledeb could inhibit inflammation
by down-regulating the expression and secretion of pro-inflammatory factors.
Key words: Melilotus suaveolens Ledeb；n-butanol；RAW264.7 cell line；pro-inflammatory factors
第 19卷第 19期 中国现代医学杂志 Vol. 19 No. 19
2009年 10月 China Journal of Modern Medicine Oct. 2009
2893· ·
RPMI1640、Trizol购自 Gibico，LPS和 MTT购自
Sigma；鼠 TNF-α、IL- 1β和 IL- 6 ELISA试剂盒购
自 Quantikine,R&D Systems；NO 检测试剂盒购自
Beyotime Biotech；COX- 2 羊抗鼠多克隆抗体购自
Santa Cruz 公司；M-MLV 逆转录酶、dNTP 购自
Promega；SYBR Green购自 Biotium；Oligo（dT18）及
引物由 Invitrogen合成。草木犀于 2006年 8月在陕
西陇县采集，经陈科力教授（湖北中医学院）鉴定后
保存于湖北中医学院药学部的植物样本库中。小鼠
巨噬细胞系 RAW 264.7购自中国典型培养物保藏
中心。
1.2 方法
1.2.1 草木犀正丁醇提取物的制备 取 50 g风干的
草木犀磨成粉末，用 700 mL/L乙醇于 85℃提取 3
次（每次 500 mL，1.5 h /次），真空过滤浓缩提取液，
用去离子水稀释至 1 g/mL（药材：水）浓度。取 5 mL
浓缩液至 100 mL的分液漏斗中，连续正丁醇提取直
至其干重达 2.425 g。用 RPMI1640培养基将其稀释
成 3种浓度 10、5和 1 mg/L备用。
1.2.2 细胞培养 小鼠巨噬细胞系 RAW 264.7使
用 RPMI1640 培养液（加入 100 ku/L青霉素，100
mg/L链霉素和 10%胎牛血清），5%二氧化碳培养
箱中 37℃培养。
1.2.3 细胞模型的建立和干涉 黄芪多糖（APS）处
理前 24 h将细胞接种于 6、24和 96孔板上，24 h后
细胞贴壁后弃上清，加入含 LPS 10μg/L的培养液
和不同浓度的提取物，作用不同时间后收集上清和
细胞，分别使用 ELISA法、实时荧光定量 RT- PCR
和Western blot法检测。
1.2.4 实验分组 实验共分 5组。正常对照组：不用
LPS 处理也不加药物干预；炎症模型组：只用
10μg/L的 LPS处理而不加药物干预；阳性对照组：
地塞米松（DM）0.5μg/L干预作阳性对照；阴性对照
组：黄芪多糖（APS）100 mg/L干预作为阴性对照；实
验组：不同浓度草木犀提取物干预。
1.2.5 药物细胞毒性的检测 MTT法，在终止细
胞培养前 4 h 加入 20μL MTT溶液（浓度 5 g/L，
pH7.4），终止细胞培养后每孔加入 150μL DMSO，
Spectramax 250 全自动定量绘图酶标仪测定 A490
值。细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）检测，细胞
在提取液中培养 24 h后在显微镜下观察细胞形态
以检测细胞病变。
1.2.6 细胞因子 TNF- α、IL- 1β 和 IL- 6 的检测
ELISA法检测 10、5和 1 mg/L 3种浓度的提取物对
炎症细胞模型中细胞因子 TNF-α、IL- 1β 和 IL- 6
的影响。细胞干预 24 h后取上清，按 ELISA试剂盒
说明进行操作，测定细胞因子含量，每个实验均设两
个复孔。
1.2.7 NO 的检测 使用 Griess反应测定细胞培养
液中一氧化氮衍生物亚硝酸盐的水平，按亚硝酸盐
检测试剂盒说明进行操作，利用亚硝酸钠的产生量
绘制标准曲线。
1.2.8 TNF- α、iNOS和 COX- 2 的 mRNA 水平
的检测 实时荧光定量 RT- PCR法检测 TNF-α、i-
NOS和 COX- 2 的基因表达。细胞干预 4 h后提取
RNA检测基因表达量。细胞总 RNA提取采用 TRIzol
试剂提取法，具体方法参照说明书。将 RNA保存在
- 80℃备用。采用 ABI- 7700序列检测仪。引物序列：
Mus- iNOS：Forward:5- GGAGCGAGTTGTGGATTGTC
- 3，Reverse:5- GTGAGGGCTTGGCTGAGTGAG- 3；
Mus- TNF-α：Forward:5- GTGGAACTGGCAGAAGA
GGC- 3，Reverse:5- AGACAGAAGAGCGTGGTGGC-
3；Mus- COX- 2：Forward:5- GAAGTCTTTGGTCTGGT
GCCTG- 3,Reverse:5- GTCTGCTGGTTTGGAATAGTT
GC- 3；Mus-β- actin:Forward:5- GCTACAGCTTCAC
CACCACAG- 3,Reverse:5- GGTCTTTACGGATGTCA
ACGTC- 3。
RNA经逆转录反应合成 cDNA，RT及 PCR 反
应体系按试剂盒说明书进行。实验结果采用
ABI- 7700自带软件对数据自动分析后，用所给 Ct值
应用公式 Folds = 2-ΔΔCt进行基因表达差异分析[2]。
1.2.9 COX- 2 的蛋白水平检测 Western blot 法
检测细胞中药物干预前后 Cox- 2 蛋白表达量的变
化。细胞干预 24 h后，加入细胞裂解液，细胞刮刮下
并收集裂解液，10 000 r/min 4℃ 10 min，取上清保
存于 - 20℃。用 BCA法测定蛋白质浓度, 取相同量
蛋白质用于 100 g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳；转
移至硝基纤维素膜 50 g/L脱脂奶粉溶液 37℃封闭 1
h；COX- 2 羊抗鼠抗体（1∶200），4℃孵育过夜，洗
膜；应用辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶1 000）室
温孵育 1 h，再加入化学发光显色剂显色，X光片曝
光显影，凝胶成像分析系统扫描，pro3.0软件半定量
分析。
1.3 数据分析
应用 SPSS12.0统计分析软件包，采取单因素方
差分析对实验数据进行处理，以 P <0.05为差异有
中国现代医学杂志 第 19卷
2894· ·
第 19期 庞 然，等：草木犀正丁醇提取物对小鼠巨噬细胞促炎介质的影响
显著性。
2 结果
2.1 药物对细胞的毒性
MTT实验结果显示 3种浓度（10、5和 1 mg/L）
药物干预细胞 24 h 后对细胞活性没有显著影响。
CPE结果，见图 1。
a：正常巨噬细胞，b：10 mg/L药物干预后巨噬细胞
图 1 细胞病变效应检测结果
2.2 炎症模型
小鼠巨噬细胞经 LPS刺激后所分泌的促炎症
介质显著高于正常对照组细胞；地塞米松干预细胞
后，细胞分泌的促炎症介质显著低于只有 LPS刺激
的模型组细胞，P <0.01，见表 1。
2.3 药物干预前后细胞因子 TNF-α、IL- 1β、IL- 6
和 NO 的水平
由表 1可以看出，药物提取物干预后细胞所分
泌的 TNF-α、IL- 1β、IL- 6及 NO水平与模型组相
比显著降低，并且药物浓度越高，细胞因子分泌的水
平越低，呈现一个剂量依赖型关系，之间的差异有显
著性（P <0.01），见表 1。
表 1 不同组上清液中 TNF-α、IL- 1β、IL- 6
和 NO水平 （x±s）
注：1）与正常对照组比较，P <0.01
2）与炎症模型组比较，P <0.01
2.4 药物干预前后 TNF-α、iNOS 和 COX- 2 的
mRNA水平
由表 2可以看出，药物提取物干预后细胞所表
达的 TNF-α、iNOS和 COX- 2与模型组相比显著降
低，并且药物浓度越高，表达水平越低，呈现一个剂
量依赖型关系。
表 2 不同组 TNF-α、iNOS 和 COX- 2
的 mRNA表达水平
注：1）与正常对照组比较，P <0.01
2）与炎症模型组比较，P <0.01
2.5 药物干预前后 COX- 2的蛋白水平
见图 2，Western blot结果显示草木犀正丁醇提
取物及 DM干预后 COX- 2蛋白水平明显降低，差异
有显著性，P <0.01。
图 2 不同组 COX- 2的蛋白水平
3 讨论
炎症反应是多细胞、多因子参与的机体防御反
应, 其发生和发展涉及机体内诸多环节, 目前认为
巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞等炎细胞的
激活是始动环节。巨噬细胞通过分泌炎症介质（如
IL- 1β、IL- 6和 TNF-α等）在炎症反应中起重要作
用，这些炎症介质可出现在多种炎症细胞和组织中。
草木犀为豆科（Leguminosae）草木犀属（Melilo-
tus）一年生或二年生草本植物，民间常以叶、花制成
软膏, 用作外伤药，用于痔、撕裂伤、哮喘以及抗炎
消肿[3]，其苦马酸提取物被证明对淋巴水肿有效 [4]。
有文献报道，草木犀的提取物与氢化可的松和香豆
素抗炎性质相似[5]。
中药抗炎作用的重要分子机制是对细胞因子及
其受体的影响。TNF-α是炎症过程中关注最多的
一个细胞因子，在炎症细胞因子产生的级联反应中
属于末期的效应分子，也是炎症中起正反馈调控的
一个关键分子，参与多种局部和全身的炎症反应[6]。
因此，本实验首先检测草木犀正丁醇提取物对
组别 TNF-α(ng/L) IL- 1β(ng/L) IL- 6(ng/L) NO(mmol/L)
正常对照组 1 216.49±76.94 2.93±0.25 2.31±0.29 4.86±0.44
炎症模型组 2 804.26±126.631） 10.25±0.961） 8.39±0.831） 30.69±1.551）
阴性对照组 3 303.30±180.562） 12.69±0.762） 12.55±0.952） 10.83±1.332）
阳性对照组 2 012.83±136.992） 6.10±0.542） 3.02±0.512） 8.56±0.612）
实验组
1 mg/L 2 123.12±168.962） 4.46±0.182） 4.44±0.282） 10.69±1.112）
5 mg/L 1 810.02±144.522） 3.46±0.292） 3.66±0.252） 7.22±0.712）
10 mg/L 1 464.16±122.362） 3.22±0.232） 2.60±0.232） 5.64±0.712）
组别 TNF-α iNOS COX- 2
正常对照组 0.044041±0.009 0.000306±0.00016 0.00546±0.0009
炎症模型组 0.374750±0.0291） 0.004509±0.000251） 0.022491±0.00181）
阴性对照组 0.452190±0.0332） 0.003448±0.000232） 0.029523±0.00192）
阳性对照组 0.239816±0.0212） 0.001251±0.000092） 0.007729±0.00092）
实验组
1 mg/L 0.248273±0.0192） 0.002102±0.000182） 0.015010±0.00132）
5 mg/L 0.170400±0.0162） 0.001084±0.000112） 0.011443±0.00122）
10 mg/L 0.149685±0.0112） 0.000775±0.000092） 0.010521±0.00092）
COX- 2
β- actin
82 kD
42 kD
Intervention
LPS
10 5 1 DM APS 正常 炎症
对照 模型
2895· ·
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
（上接第 2892页）
(10): 1394- 1398. Chinese
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（谭 亮 编辑）
TNF-α的影响，发现对其有明显的抑制作用，且所
选剂量呈剂量依赖性关系。可以初步判断草木犀正
丁醇提取物的抗炎功效。IL- 1也被认为在感染和免
疫介导的炎症反应中起重要作用。IL- 1分为两个亚
型，在感染、细胞因子和免疫复合物的刺激下，IL- 1
由不同细胞产生，其中单核－巨噬细胞产生的是
IL- 1β。IL- 6是重要的发热介质，也被看作急性期反
应的激动剂，对炎症在天然免疫和获得性免疫中的
反应都有调节作用[7]。目前与针对 TNF-α和IL- 1β
一样，针对 IL- 6的治疗也已经成为治疗某些炎性局
部和全身疾病的手段[8，9]。因此，本实验采用这 3种
促炎介质作为评价抗炎活动的标准。实验结果显示
草木犀正丁醇提取物对促炎细胞因子有明显的抑制
作用，提示该成分可能在与促炎细胞因子相关的炎
性疾病中起到治疗作用。
COX是花生四烯酸代谢途径中前列腺素（PG）
合成过程中一个重要的限速酶, 是调节炎症介质产
生的关键酶。COX有 3种异构体形式，其中 COX- 2
是一种诱导型酶，在受到细胞因子、诱癌剂等的刺激
后，表达显著升高[10]。因此，能否抑制 COX- 2也成为
目前抗炎药物的判断标尺之一。本研究中草木犀正
丁醇提取物对 COX- 2基因和蛋白的抑制效果显著，
表明草木犀正丁醇提取物可以调控炎症反应中的限
速酶 COX- 2，初步揭示了其抗炎作用机制。
一氧化氮（NO）是由诱导型一氧化氮合酶（iN-
OS）催化生成，既是一种新的第二信使神经递质,也
是一个活性很强的自由基, 在体内广泛参与多种生
理和病理过程, 如调节血管张力、参与神经传递、介
导炎症反应[6]和免疫反应等。实验结果显示草木犀
正丁醇提取物对体外细胞培养上清液 NO具有一定
的抑制作用，并能降低 iNOS的 mRNA表达水平。因
此，抑制 NO 的生成亦可能是此药物抗炎作用机制
之一。
综上所述，草木犀正丁醇提取物具有明显的体
外抗炎和剂量依赖性作用, 其抗炎作用与抑制多种
炎性介质及细胞因子的释放有关，但要达到其抗炎
机制详细完整的阐述尚需进一步的研究工作。本实
验为今后进一步研究开发草木犀正丁醇提取物提供
了理论依据。
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（曾文军 编辑）
中国现代医学杂志 第 19卷
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