全 文 ：天然产物研究与开发 Nat Prod Ｒes Dev 2015，27:617-620
文章编号:1001-6880(2015)4-0617-04
收稿日期:2014-10-28 接受日期:2015-01-16
基金项目:中国博士后科学基金(2014M551291)
* 通讯作者 Tel:86-452-2663375;E-mail:qyybliu@ 126． com
狼毒大戟二萜类成分 HPLC指纹图谱及聚类分析
洪 博1，李文静1，刘树民2，刘吉成1*
1齐齐哈尔医学院药学院医药科学研究中心，齐齐哈尔 161000;
2黑龙江中医药大学基础医学院中药教研室，哈尔滨 150040
摘 要:为建立狼毒大戟药材的特征图谱，科学评价其质量，本文采用高效液相色谱法，乙腈-水梯度洗脱，测定
了 11 批不同来源的狼毒大戟样品二萜类化合物，通过相似度分析建立了狼毒大戟提取物的高效液相指纹图谱，
并对 11 批药材进行系统聚类分析。本文采用乙腈-水为流动相，梯度洗脱，检测波长:230 nm，流速:1． 0 mL /
min，进样量:10 μL，柱温:30 ℃。相似度评价结果显示 11 批不同产地的狼毒大戟相似度均高于 0． 9，并对 11 批
样品建立共有模式，确定了 23 个特征共有峰，聚类分析结果将狼毒大戟样品分为 2 类，与药材产地相关。本文
所建立狼毒大戟的指纹图谱方法简便、可靠，可作为狼毒大戟药材的基源鉴定参考方法。
关键词:狼毒大戟;HPLC指纹图谱;相似度;聚类分析
中图分类号:Ｒ917 文献标识码:A DOI:10． 16333 / j． 1001-6880． 2015． 04． 012
HPLC Fingerprinting and Cluster Analysis of Diterpenoids
Constituents in Euphorbia fischeriana
HONG Bo1，LI Wen-jing1，LIU Shu-min2，LIU Ji-cheng1*
1Qiqihar Medical University，Pharmacy School，Medical Science Ｒesearch Center，Qiqihar 161000，China;2Heilongjiang
University of Chinese Medicine，Basic Medical Sciences School，Chinese Materia Medica Department，Harbin 150040，China
Abstract:This study was aimed to establish the method of fingerprint analysis of chemical constituents of Euphorbia fis-
cheriana by reverse-phase high-performance liquid chromatography (HPLC) and hence to control its quality． A mixed
mobile phase of water and acetonitrile in a gradient elution mode was applied to determine diterpenoid compounds in 11
batches of E． fischeriana． The flow rate was 1． 0 mL /min;the UV detection wavelength was 230 nm;the injection volume
was 10 μL;the column temperature was 30 ℃ ． In addition，classification of different E． fischeriana samples was obtained
using systematic cluster method． The analysis results of Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint
suggested that the degree of similarity of the 11 batches of E． fischeriana samples were over 0． 9． The HPLC chromato-
graphic fingerprint of chemical constituents in the 11 batches of E． fischeriana was established，which showed 23 charac-
teristic common peaks． The cluster analysis results indicated that the 11 batches of samples were classified into 2 clas-
ses，which was related to the origins of herbs． The developed HPLC method can be used to identify the origins of E． fisch-
eriana herbs and to control its quality．
Key words:Euphorbia fischeriana;HPLC fingerprint;similarity;cluster analysis
狼毒大戟(Euphorbia fischeriana Steud． )又名东
北狼毒、白狼毒、猫眼草，为大戟科植物狼毒大戟的
根。在中药中也作狼毒使用，其味辛，性平，有毒，具
有祛痰逐水、破积杀虫等功效，用于治疗水肿腹胀、
咳嗽、气喘等［1］。目前对狼毒大戟药材的研究多集
中在化学成分的提取和分离，主要有二萜、三萜、鞣
质、甾醇、蒽醌类等［2-5］。其中二萜类化合物为主要
活性成分，经药理学研究证明其有抗肿瘤活性［6］，
同时也具有细胞毒及刺激性等毒性作用［7，8］。关于
狼毒大戟的质量标准研究，在 2010 年版《中国药
典》［9］收载有“狼毒”项下有性状、显微和薄层鉴别
等质控项目;大部分文献采用测定狼毒大戟中活性
成分岩大戟内酯 B、狼毒乙素等含量测定的方法进
行质量评价。随着分析手段的发展，中药指纹图谱
研究以其充分的化学特征作为质量控制模式，可以
综合反映药材中各主要成分及其相对含量，从而提
供更加丰富的质量评价信息。
狼毒大戟药材中含量较高的二萜类化合物，临
床上长期应用于消炎、抗结核、抗肿瘤等治疗。本文
以狼毒大戟中二萜类化合物，岩大戟内酯 B(药理研
究已表明其有明显的抗癌活性)［2，10］为研究对象，在
已明确二萜类成分最佳提取工艺基础上，采用二元
梯度洗脱模式，建立了狼毒大戟药材二萜类成分的
HPLC 特征图谱和质量评价方法，未见文献对此类
成分的特征图谱进行研究。本文有针对性地对狼毒
大戟药材中二萜类成分进行分离、分析，方法可靠、
重复性好，操作简便，为给狼毒大戟药材的合理使用
和基源选育提供理论依据，进一步开发狼毒大戟的
药用功能提供一定的质量保证。
1 仪器及材料
1． 1 仪器
Waters 2695 四元泵全自动进样高效液相色谱
仪(美国 Waters 公司)，含 UV2489 检测器;柱温箱;
Waters Empower色谱工作站;LAC214 型电子分析天
平(常熟市百灵天平仪器厂);HHS 型电热恒温水浴
锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);KQ-3200E
型超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司);国家药
典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”
(2004 版)软件。
1． 2 试药
岩大戟内酯 B对照品为本实验室自制，经波谱
学方法鉴定结构，并由色谱法确定其纯度为
99. 2%。11 批狼毒大戟药材来源于黑龙江齐齐哈
尔(批号:120323、111229、120225)、黑龙江哈尔滨
(批号:120818、120527、110723)、吉林长春(批号:
120114、120123)、河北保定(批号:120312)、内蒙古
(批号:110913)、黑龙江牡丹江(批号:120720)，经
齐齐哈尔医学院药学院中药学教研室郭丽娜教授鉴
定为大戟科大戟属植物狼毒大戟的干燥根。
分析用甲醇、乙腈为色谱纯 (美国 Merck 公
司)，药材提取用无水乙醇等试剂为分析纯购自山
东禹王试剂有限公司，液相用水为杭州娃哈哈纯净
水。
2 实验方法
2． 1 色谱条件
Agilent C18色谱柱(250 mm × 4． 6 mm，5 μm)。
流动相:乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱(0 ～ 10 min，
15%A;10 ～ 20 min，15% ～ 50% A;20 ～ 30 min，50%
～60% A;30 ～ 40 min，60% ～ 70% A;40 ～ 50 min，
70% ～ 90% A)，平衡时间 5 min。检测波长:230
nm;柱温:30 ℃;流速:1． 0 mL /min;进样量:10 μL。
在上述色谱条件下，理论塔板数按岩大戟内酯 B 峰
计算不小于 3500。
2． 2 对照品溶液和供试品溶液的制备
精密称取岩大戟内酯 B对照品 1． 0 mg，置 1 mL
容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，即得对照品储
备液。
根据前期对二萜类成分提取方法的正交实验结
果，确定供试品溶液的提取方法，取狼毒大戟粉末
(过 4 号筛)约 1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精
密加入 90%乙醇 20 mL，超声处理(功率 300 W，频
率 35 kHz)30 min，提取温度 70 ℃，放冷后补足减少
的重量，摇匀，滤过，精取续滤液用微孔滤膜(0． 45
μm)滤过，取续滤液即得供试品溶液。
2． 3 方法学验证
2． 3． 1 精密度试验
精密吸取同一供试品溶液 10 μL，连续进样 6
次，按色谱条件测定，以 21 号色谱峰的保留时间和
峰面积为参照，选择 23 个共有峰进行比较，结果表
明，各共有峰相对保留时间的 ＲSD ＜0． 52%，各共有
峰相对峰面积 ＲSD ＜ 1． 25%，表明仪器的精密度良
好，符合指纹图谱要求。
2． 3． 2 重复性试验
取同一批狼毒大戟粉末 6 份，按照供试品溶液
制备方法平行操作供试品溶液，分别进样，按色谱条
件测定指纹图谱，对 23 个共有峰的保留时间和峰面
积进行比较，以岩大戟内酯 B 为参照峰，计算相对
保留时间和相对峰面积的 ＲSD 值，结果表明，各共
有峰相对保留时间 ＲSD ＜ 2． 11%，各共有峰相对峰
面积 ＲSD ＜3． 05%，表明该方法重复性良好。
2． 3． 3 稳定性试验
取同一供试品溶液适量，分别于制备后 0、2、4、
8、12、24 h检测指纹图谱，测得 23 个共有峰的保留
时间和峰面积，以岩大戟内酯 B 为参照峰，计算相
对保留时间和相对峰面积的 ＲSD 值，结果表明，各
共有峰相对保留时间 ＲSD ＜ 1． 23%，各共有峰相对
峰面积 ＲSD ＜2． 42%，表明供试品溶液在 24 h 内稳
定。
2． 4 样品测定
以《中药注射剂指纹图谱的技术研究》为指导，
将 11 批狼毒大戟样品按供试品项下方法制备，考虑
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到各样品中均有 21 号色谱峰且含量较高，其保留时
间及峰形稳定，分离度良好，故以此峰作为参照峰，
记录色谱图。将 11 批样品色谱图 HPLC 色谱图导
入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，生成狼毒
大戟对照图谱。再以对照图谱为参照图谱，计算相
似度。以共有峰峰面积为变量，运用 SPSS软件对个
样品进行聚类分析，得出树状图。
3 实验结果
3． 1 狼毒大戟二萜类成分指纹图谱的建立
按照供试品制备方法制备 11 批不同狼毒大戟
样品按供试品溶液，按照色谱条件进行测定，记录色
谱图 50 min并导入《中药色谱指纹图谱相似度评价
系统(2004 年 A 版)》，进行色谱峰匹配，匹配数据
显示 23 个峰是所有样品共有的，按出峰时间依次标
定为 1 ～ 23 号峰，以保留时间为 38． 85 min 的 21 号
色谱峰(岩大戟内酯 B)作为参照峰，确定了 23 个共
有特征指纹峰(见图 1)。特征峰的选取原则:与相
邻峰的分离度达到 1． 2 以上，其他特征峰也达到一
定分离，峰尖与峰谷的距离至少大于该峰高的 2 /3
以上，如果未达到，则 2 个峰可以合并为 1 个峰计
算［11］。在同样色谱条件下测定的对照品溶液通过
与样品峰的保留时间进行比对，指认 21 号峰为岩大
戟内酯 B。
图 1 狼毒大戟二萜类化合物提取物(A)及岩大戟内酯 B(B)的 HPLC色谱图
Fig. 1 HPLC chromatograms of diterpenoid extract of E． fischeriana (A)and jolkinolide B (B)
3． 2 指纹图谱的相似度计算
按照国家药典委员会公布的中药指纹图谱评价
软件计算方法，对 11 批狼毒大戟指纹图谱进行相关
技术参数的计算并建立共有模式，选取“时间窗宽
度”为 0． 5 min，对照图谱的生成方法为“中位数”，
自动匹配后，得到样品与对照谱图的匹配图，见图
2。计算出样品与对照品谱图的相似度数据，结果见
表 1。通常，相似度在 0． 9 以上的判定为优质药材;
相似度在 0． 7 ～ 0． 9 的药材质量一般;若相似度低于
0． 7，则判定为伪品，本文的 11 批不同产地狼毒大戟
未见伪品。由于不同产地生长环境不同，指纹图谱
相似度也有所差异。
图 2 11 批不同产地狼毒大戟样品 HPLC色谱重叠图
Fig. 2 Overlapped HPLC chromatograms of 11 batches of E．
fischeriana samples
表 1 不同产地狼毒大戟药材相似度计算结果
Table 1 Similarities of E． fischeriana samples
样品号
No．
样品来源
Source
相似度
Similarity
样品号
No．
样品来源
Source
相似度
Similarity
S1 齐齐哈尔 I(120323)Qiqihar 0． 965 S7 长春 I(120114)Changchun 0． 988
S2 齐齐哈尔 II(111229)Qiqihar 0． 989 S8 长春 II(120123)Changchun 0． 985
S3 齐齐哈尔 III(120225)Qiqihar 0． 967 S9 保定 I(120312)Baoding 0． 931
S4 哈尔滨 I(120818)Harbin 0． 982 S10 牡丹江(120720)Mudanjiang 0． 984
S5 哈尔滨 II(120527)Harbin 0． 964 S11 内蒙古(110913)Neimenggu 0． 946
S6 哈尔滨 III(110723)Harbin 0． 981
916Vol. 27 洪 博等:狼毒大戟二萜类成分 HPLC指纹图谱及聚类分析
3． 3 系统聚类分析
将 11 批不同来源狼毒大戟药材样品的 HPLC
特征图谱各色谱峰的峰面积相对药材称样量之
比［12］，即单位质量药材峰面积进行量化，得到 11 ×
23 阶的数据矩阵，应用 SPSS13． 0 统计分析软件，选
择离差平方和法为聚类方法、欧氏距离平方法为测
量距离方法进行聚类分析，得到红花药材的聚类谱
系，结果见图 3。聚类谱系中，当判别条件距离 di =
5 时，S4、S5、S6 聚为一类，S1、S2、S3、S10 聚为一类，
S7、S8、S9、S11 聚为一类;当判别条件距离 di = 10
时，将 11 批样品分为 2 类，第 7、8、9 和 11 批被分为
一类，其余 7 批分为一类。说明不同的生长环境会
导致狼毒大戟药材中化学成分的差异。
图 3 11 批狼毒大戟药材的聚类树状图
Fig. 3 Dendrogram of 11 batches of E． fischeriana samples
4 讨论
聚类分析的结果显示黑龙江省产的狼毒大戟药
材基源最为接近，聚为一类，药材中化学成分与产地
有密切关系，进一步证明狼毒大戟为北方优质药材
资源。后期本项目组将对不同产地狼毒大戟中具体
化学成分进行提取、分离研究，深入探讨地域给药材
具体成分带来的差别。
本文采用不同溶剂(不同比例的甲醇水、乙醇
水)、不同提取方法(回流提取和超声)及提取时间
(20、30、40 min)对狼毒大戟供试液提取方法进行考
察，并根据指纹图谱对不同提取方法的提取液进行
分析，结果表明，用 90%乙醇作为溶剂超声提取 30
min能够将狼毒大戟中二萜成分较完全提取出来，
且方法简单可行，得到的 11 批样品的相似度较好。
本文建立的狼毒大戟二萜类成分的 HPLC 指纹
图谱可靠，使用 HPLC 指纹图谱可全面得到狼毒大
戟药材的二萜类成分化学信息，并利用这些化学信
息可对其进行相似度计算进行有效的质量控制。
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