全 文 ：收稿日期:2014-06-12
基金项目:广西高校科研项目(2013LX161) ;钦州学院校级科研项目(2014XJKY-58C) ;大学生创新创业训练计划项目(201411607064)
作者简介:庞庭才(1985-) ，男，硕士，实验师，研究方向:植物有效成分提取与分析;Tel:0777-2808806，E-mail:pangtingcai@ 126. com。
* 通讯作者:胡上英，Tel:0777-2808786，E-mail:hushying@ 126. com。
响应面法优化超声辅助提取银叶树果壳黄酮的工艺
庞庭才，胡上英* ，钟秋平，廖日权，周桂芬
(钦州学院，广西 钦州 535099)
摘要 目的:利用响应面分析法优化银叶树果壳中黄酮的提取工艺。方法:以黄酮得率为指标，采用单因素和
响应面分析法对乙醇浓度、液料比、超声时间和超声温度进行考察。结果:优选出最佳超声提取工艺为:乙醇浓度
61. 2%，液料比 74. 9∶ 1(mL∶ g)，超声时间 34. 0 min，超声温度 49. 7 ℃，理论银叶树果壳黄酮的得率为 11. 89%，在
最佳工艺条件下进行验证试验，实际测得黄酮得率为 11. 83%，与理论值仅相差为 0. 06%。结论:该优化方法合理
可行。
关键词 响应面;银叶树;黄酮;提取
中图分类号:Ｒ284. 2 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2014)12-2289-05
DOI:10. 13863 / j. issn1001-4454. 2014. 12. 043
银叶树 Heritiera littoralis Dryand. 是梧桐科银叶
树属植物，为热带海岸红树林的树种之一，我国广
东、广西和台湾等省区均有分布〔1〕。我国民间常用
银叶树的树皮水煎液内服治血尿病、腹泻和赤
痢〔2〕。研究表明，银叶树主要含有黄酮类、三萜类、
甾体类、倍半萜类等化合物〔3，4〕。其中，黄酮类化合
物具有抗癌、抗氧化、抗衰老、抗辐射等作用〔5〕。目
前，对于银叶树黄酮成分的研究主要集中在树叶，对
果实、果壳的研究还比较少〔6〕。本文以银叶树果壳
为原料，采用超声辅助提取黄酮，通过响应面分析法
优化出最佳超声提取条件，旨在为进一步开发和利
用丰富的红树林资源提供一定的理论基础。
1 仪器与材料
1. 1 仪器 HH-4 数显恒温水浴锅(金坛市科析仪
器有限公司);EL204 电子天平［梅特勒-托利多(上
海)有限公司］;EＲZ-A5110A 全自动新型鼓风干燥
箱(上海智诚分析仪器制造有限公司) ;UV-3200 紫
外-可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司) ;
FW-100 高速万能粉碎机(上海胜启仪器仪表有限
公司) ;H1850 台式离心机(湖南湘仪实验室仪器开
发有限公司) ;KH300SP 型超声波清洗机(昆山超声
仪器有限公司)。
1. 2 材料 银叶树果壳采自广西北仑河口国家级
自然保护区，经笔者钟秋平副教授鉴定为梧桐科银
叶树属植物银叶树 Heritiera littoralis Dryand. 的果实
外种壳。
乙酸乙酯 (批号:20120618)、丙酮 (批号:
20130520)、甲醇(批号:20121015)、无水乙醇(批
号:20130822)、氢氧化钠(批号:20131216)、亚硝酸
钠(批号:20130816)、硝酸铝(批号:20131209)均购
自上海国药集团化学试剂有限公司。芦丁对照品
(批号:20130609)购自上海金穗生物科技有限公
司。
2 方法与结果
2. 1 银叶树果壳黄酮提取工艺流程 银叶树果壳
烘干后粉碎过 100 目筛，称量 0. 20 g，移入锥形瓶，
加入提取溶剂，超声(240 W，20 kHz)提取，提取液
离心过滤，滤液浓缩定容至 50 mL，过滤，续滤液即
为待测样液，量取 1. 0 mL测吸光度，计算黄酮得率。
2. 2 标准曲线的绘制与黄酮得率计算 准确称取
经干燥至恒重的芦丁对照品 0. 010 g，置于 50 mL量
瓶中，加 60%乙醇溶液定容，即得到 0. 2 mg /mL 的
芦丁对照品溶液。分别精确吸取芦丁对照品溶液
0、0. 5、1. 0、1. 5、2. 0、2. 5、3. 0 mL 于 10 mL 比色管
中，各加入 2. 0 mL 60%乙醇，再各加入 0. 3 mL 5%
NaNO2溶液，摇匀，静置 6 min;加入 0. 3 mL 10%的
Al(NO3)3溶液，摇匀，静置 6 min;加入 4. 0 mL 4%
NaOH溶液，摇匀;再以 60%乙醇定容至刻度，摇匀，
放置 15 min;以空白试剂为参比液，于波长 510 nm
处测定其吸光度。以芦丁对照品溶液浓度(mg /
mL)为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得出
线性回归方程:y = 12. 116x － 0. 0023，r = 0. 9999。
黄酮得率(%)=
C × V1 × V3
V2 × m
× 100
式中:C为测量液的黄酮浓度(mg /mL) ;V1为测量液的
定容体积(mL);V2为测量时量取的体积(mL);V3为提取液
的定容体积(mL) ;m为样品质量(mg)。
2. 3 提取溶剂的选择 选择蒸馏水、甲醇、丙酮、
乙酸乙酯、60%乙醇、无水乙醇为提取溶剂，考察不
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同提取溶剂对银叶树果壳黄酮得率的影响。结果可
知，影响黄酮得率高低的顺序是:60%乙醇 ＞甲醇 ＞
水 ＞无水乙醇 ＞丙酮 ＞乙酸乙酯。表明 60%乙醇
浸提的效果最好，浸出率高，故选择一定浓度的乙醇
作为提取剂。
2. 4 单因素试验
2. 4. 1 乙醇浓度对超声提取银叶树果壳中黄酮得
率的影响:以银叶树果壳黄酮得率为指标，在固定液
料比 60∶ 1(mL∶ g)、超声温度 45 ℃、超声时间 25 min
的条件下，考察不同乙醇浓度(30%、40%、50%、
60%、70%)对黄酮得率的影响。结果见图 1。
图 1 乙醇浓度对超声提取银叶树果壳中黄酮得率的影响
由图 1 可知，乙醇浓度低于 60%时，黄酮得率
随着乙醇浓度的增大而增加，乙醇浓度超过 60%
时，黄酮得率开始下降。因此，选择最佳乙醇浓度为
60%。
2. 4. 2 液料比对超声提取银叶树果壳中黄酮得率
的影响:以银叶树果壳黄酮得率为指标，在固定超声
温度 45 ℃、超声时间 25 min、乙醇浓度 60%的条件
下，考察不同液料比(60∶ 1、65∶ 1、70∶ 1、75∶ 1、80∶ 1)
对黄酮得率的影响。结果见图 2。
图 2 液料比对超声提取银叶树果壳中黄酮得率的影响
由图 2 可知，在液料比 60∶ 1 增加到 75∶ 1 的过
程中，黄酮得率随着溶剂用量的增加而提高，在 75
∶ 1 时达到最大值;随着溶剂用量的继续增加，提取
液中的黄酮反而有所下降。从原料和试剂成本方面
考虑，选择液料比为 75∶ 1(mL∶ g)为最佳。
2. 4. 3 超声时间对超声提取银叶树果壳中黄酮得
率的影响:以银叶树果壳黄酮得率为指标，在固定超
声温度 45 ℃、乙醇浓度 60%、液料比 75∶ 1(mL∶ g)
的条件下，考察不同超声时间(15、25、35、45、55
min)对黄酮得率的影响。结果见图 3。
图 3 超声时间对超声提取银叶树果壳中黄酮得率的影响
由图 3 可知，在一定范围内，延长超声时间会提
高黄酮得率，提取时间达到 35 min 时，黄酮得率达
到最高，之后随着提取时间的延长，黄酮得率呈下降
趋势。可能是当超声时间过短时，黄酮没有完全溶
出;而提取时间过长，会引起部分黄酮结构发生分
解。因此，选择最佳的超声时间为 35 min。
2. 4. 4 超声温度对超声提取银叶树果壳中黄酮得
率的影响:以银叶树果壳黄酮得率为指标，在固定乙
醇浓度 60%、液料比 75∶ 1(mL∶ g)、超声时间 35 min
的条件下，考察不同超声温度(45、50、55、60、65 ℃)
对黄酮得率的影响。结果见图 4。
图 4 超声温度对超声提取银叶树果壳中黄酮得率的影响
由图 4 可知，当超声温度 50 ℃时，黄酮得率达
到最高;随着超声温度的继续升高，黄酮得率逐渐减
少，可能是由于温度太高导致黄酮物质发生氧化而
被破坏，从而使黄酮得率有所下降。因此，选择最佳
超声温度为 50 ℃。
2. 5 响应面试验设计 在单因素试验的基础上选
取 4 因素 3 水平的响应面分析试验(表 1)，根据
Box-Benhnken中心组合设计原理，以乙醇浓度(A)、
液料比(B)、超声时间(C)、超声温度(D)为自变量。
其中，1 ～ 24 是析因试验，25 ～ 27 是零点中心试验。
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表 1 响应面试验因素与水平
水平
A 乙醇
浓度 /%
B 液料比
/(mL∶ g)
C 超声
时间 /min
D 超声
温度 /℃
－ 1 50 70 25 45
0 60 75 35 50
1 70 80 45 55
2. 5. 1 响应面试验与结果:以乙醇浓度 A、液料比
B、超声时间 C、超声温度 D 为自变量，黄酮得率为
响应值(Y)，试验方案与结果见表 2。
利用 Design Expert 8. 0. 5b统计分析软件对表 2
数据进行二次多元回归拟合，得到黄酮得率 Y与 A、
B、C、D之间的二次回归方程为:
Y = 11. 87 － 0. 057A + 0. 019B + 0. 059C + 0. 033D －
0. 092AB － 0. 20AC － 0. 19AD － 0. 060BC － 0. 18BD － 0. 21CD
－ 0. 39A2 － 0. 27B2 － 0. 34C2 － 0. 26D2。
回归方程方差分析(表 3)表明该模型极显著。
由 P 值可知，方程中 B 不显著，A、C、AB、AC、AD、
BD、CD、A2、B2、C2、D2对 Y值影响极显著，D、BC对 Y
值影响显著。Ｒ2 = 98. 52%，说明回归方程的拟合度
良好，响应值(得率)的变化有 98. 52%来源于所选
变量，即乙醇浓度、液料比、超声时间、超声温度。失
拟项 P = 0. 1736，无显著性影响，表明数据没有异常
点，不需要分析更高的项，模型适当。因此，该回归
方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关
系，可以用其确定最佳提取条件。
表 2 响应面试验与结果
试验号 A B C D Y得率 /%
1 － 1 － 1 0 0 11. 13
2 1 － 1 0 0 11. 24
3 － 1 1 0 0 11. 34
4 1 1 0 0 11. 08
5 0 0 － 1 － 1 10. 94
6 0 0 1 － 1 11. 51
7 0 0 － 1 1 11. 41
8 0 0 1 1 11. 13
9 － 1 0 0 － 1 11. 05
10 1 0 0 － 1 11. 28
11 － 1 0 0 1 11. 49
12 1 0 0 1 10. 97
13 0 － 1 － 1 0 11. 11
14 0 1 － 1 0 11. 26
15 0 － 1 1 0 11. 33
16 0 1 1 0 11. 24
17 － 1 0 － 1 0 10. 98
18 1 0 － 1 0 11. 26
19 － 1 0 1 0 11. 49
20 1 0 1 0 10. 97
21 0 － 1 0 － 1 11. 12
22 0 1 0 － 1 11. 53
23 0 － 1 0 1 11. 56
24 0 1 0 1 11. 27
25 0 0 0 0 11. 87
26 0 0 0 0 11. 80
27 0 0 0 0 11. 85
表 3 回归模型方程的方差分析
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 Pr ＞ F 显著性
模型 1. 90 14 0. 14 76. 30 ＜ 0. 0001 ＊＊
A 0. 039 1 0. 039 21. 63 0. 0006 ＊＊
B 4. 408 × 10 －3 1 4. 408 × 10 －3 2. 47 0. 1417 不显著
C 0. 042 1 0. 042 23. 58 0. 0004 ＊＊
D 0. 013 1 0. 013 7. 49 0. 0181 *
AB 0. 034 1 0. 034 19. 21 0. 0009 ＊＊
AC 0. 16 1 0. 16 89. 82 ＜ 0. 0001 ＊＊
AD 0. 14 1 0. 14 78. 95 ＜ 0. 0001 ＊＊
BC 0. 014 1 0. 014 8. 08 0. 0148 *
BD 0. 12 1 0. 12 68. 77 ＜ 0. 0001 ＊＊
CD 0. 18 1 0. 18 101. 40 ＜ 0. 0001 ＊＊
A2 0. 80 1 0. 80 448. 62 ＜ 0. 0001 ＊＊
B2 0. 39 1 0. 39 219. 62 ＜ 0. 0001 ＊＊
C2 0. 63 1 0. 63 352. 94 ＜ 0. 0001 ＊＊
D2 0. 37 1 0. 37 209. 60 ＜ 0. 0001 ＊＊
残差 0. 021 12 1. 781 × 10 －3
失拟项 0. 021 10 2. 057 × 10 －3 5. 14 0. 1736 不显著
纯误差 8. 000 × 10 －3 2 4. 000 × 10 －3
总和 1. 92 26
注:* 表示影响显著，P ＜ 0. 05;＊＊表示影响极显著，P ＜ 0. 01
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2. 5. 2 各因素的交互作用:由二次回归方程可知，
对银叶树果壳黄酮得率的影响次序为:超声时间 ＞
乙醇浓度 ＞超声温度 ＞液料比。各因子交互作用的
响应面曲面图见图 5 ～ 10。
图 5 乙醇浓度和液料比交互影响黄酮
得率的曲面图
由图 5 可看出，在超声时间为 35 min、超声温度
为 50 ℃时，乙醇浓度和液料比对银叶树果壳黄酮得
率的交互作用显著。乙醇浓度和液料比在接近零水
平时，即乙醇浓度在 55% ～ 65%之间，液料比在 74
～ 76(mL∶ g)之间，黄酮的得率最高。
图 6 乙醇浓度和超声时间交互影响黄酮
得率的曲面图
由图 6 可看出，在液料比为 75∶ 1(mL∶ g)、超声
温度为 50 ℃时，乙醇浓度和超声时间对银叶树果壳
黄酮得率的交互作用显著。乙醇浓度和超声时间在
接近零水平时，即乙醇浓度在 55% ～ 65%之间，超
声时间在 30 ～ 40 min之间，黄酮的得率最高。
图 7 乙醇浓度和超声温度交互影响黄酮
得率的曲面图
由图 7 可看出，在液料比为 75∶ 1(mL∶ g)、超声
时间为 35 min时，乙醇浓度和超声温度对银叶树果
壳黄酮得率的交互作用显著。乙醇浓度和超声温度
在接近零水平时，即乙醇浓度在 55% ～ 65%之间，
超声温度在 49 ～ 51 ℃之间，黄酮的得率最高。
图 8 液料比和超声时间交互影响黄酮
得率的曲面图
由图 8 可看出，在乙醇浓度为 60%、超声温度
为 50 ℃时，液料比和超声时间对银叶树果壳黄酮得
率的交互作用显著。液料比和超声时间在接近零水
平时，即液料比在 74∶ 1 ～ 76∶ 1(mL∶ g)之间，超声时
间在 30 ～ 40 min，黄酮的得率最高。
图 9 液料比和超声温度交互影响黄酮
得率的曲面图
由图 9 可看出，在乙醇浓度为 60%、超声时间
为 35 min时，液料比和超声温度对银叶树果壳黄酮
得率的交互作用显著。液料比和超声温度接近零水
平时，即液料比在 74∶ 1 ～ 76∶ 1(mL∶ g)之间，超声温
度在 49 ～ 51 ℃之间，黄酮的得率最高。
图 10 超声时间和超声温度交互影响黄酮
得率的曲面图
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由图 10 可看出，在乙醇浓度为 60%、液料比为
75∶ 1(mL∶ g)时，超声时间和超声温度对银叶树果壳
黄酮得率的交互作用显著。超声时间和超声温度接
近零水平时，即超声时间在 30 ～ 40 min 之间，超声
温度在 49 ～ 51 ℃之间，黄酮的得率最高。
2. 5. 3 最佳提取条件的确定与验证:利用 Design
Expert 8. 0. 5 软件分析，可得出银叶树果壳黄酮提
取最佳工艺条件为乙醇浓度 61. 2%，液料比 74. 9∶ 1
(mL∶ g)，超声时间 34. 0 min，超声温度 49. 7 ℃，由
回归模型预测黄酮得率理论值为 11. 89%。
在优选出的工艺条件下进行 3 次平行验证试
验，其结果显示，银叶树果壳平均黄酮得率为
11. 83%，与理论值仅相差 0. 06%，与理论预测值基
本一致。
3 结论
本实验采用超声提取银叶树果壳中黄酮类成
分。根据 Box-Behnken中心组合设计原理和响应面
分析法，借助 Design Expert 软件进行试验设计和数
据分析，得出银叶树果壳黄酮提取的最佳条件为:乙
醇浓度 61. 2%，液料比 74. 9 ∶ 1(mL∶ g)，超声时间
34. 0 min，超声温度 49. 7 ℃。在此最优提取条件提
取银叶树果壳黄酮的实际得率为 11. 83%，与理论
值仅相差 0. 06%，表明响应面法可有效用于银叶树
果壳黄酮超声提取方法的优化。
参 考 文 献
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版社，1983:140.
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