全 文 ：狼毒大戟中没食子酸乙酯的提取分离
及抗肿瘤活性
简白羽，郭丽娜，马立威，韩翠翠，杨莹，刘吉成
(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)
摘 要:目的: 对狼毒大戟中没食子酸乙酯进行提取分离，并探索其抗肿瘤作用。方法: 采用硅胶柱色谱
法、Sephadex LH －20 凝胶柱色谱法和半制备高效液相色谱法从狼毒大戟的乙酸乙酯层分离纯化没食
子酸乙酯，通过 MTT法观察其在不同浓度和时间条件下对三种肿瘤细胞的生长抑制作用。结果:没食
子酸乙酯对结肠癌 LOVO 细胞、肺癌 A549 细胞、口腔鳞癌 CAL － 27 细胞的生长均具有一定的抑制作
用，经药物作用 72h后，最大抑制率分别达到( 74． 67 ± 0． 47) %、( 62． 01 ± 1． 27) %和( 37． 17 ± 2． 12) %。
结论:狼毒大戟乙酸乙酯层提取分离的没食子酸乙酯在体外有抗肿瘤活性。
关键词:狼毒大戟;没食子酸乙酯; 提取分离;抗肿瘤
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标识码:A 文章编号:1002 － 2406(2014)03 － 0007 － 03
Extraction and Isolation of Ethyl Gallate from Euphorbia Fischeriana and Its Antitumor Activity
JIAN Bai － yu，GUO Li － na，MA Li － wei，HAN Cui － cui，YNGA Ying，LIU Ji － cheng
(Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China)
Abstract:Objective:To extract and isolate ethyl gallate from Euphorbia fischeriana and to explore its antineo-
plastic activity． Method:Isolate ethyl gallate from the ethyl acetate parts of Euphorbia fischeriana by silica gel
column chromatography，Sephadex LH －20 chromatography and semi － preparative reversed phase liquid chro-
matography． MTT assay was used to test the inhibitive effect of ethyl gallate on three tumor cells with different
concertrations and at different action time． Ｒesults:The results showed that ethyl gallate inhibited the growth in
colon cancer cells LOVO，lung cancer cells A549 and oral adenosquamous carcinoma cells CAL － 27 ． After
they were treated with different concentrations of ethyl gallate for 72h，maximum inhibitive rates were(74． 67 ±
0． 47)%，(62． 01 ± 1． 27)% and(37． 17 ± 2． 12)% respectively． Conclusion:Ethyl gallate from Euphorbia
fischeriana has an anti － tumor effect in vitro．
Key words:Euphorbia fischeriana;Ethyl gallate;Extraction and isolation;Antitumor
基金项目:国家自然科学基金项目(No． 30973932)
作者简介:简白羽(1989 －)，女，硕士研究生，主要研究方向:肿瘤药
理学。
通讯作者:刘吉成(1958 －)，男，博士，教授，博士研究生导师，主要研究
方向:分子药理学和肿瘤药理学。
收稿日期:2013 － 10 － 08
修回日期:2013 － 11 － 10
狼毒大戟(Euphorbia fischeriana)为大戟科狼毒属
植物，主产于中国北方，俗称猫眼草［1］。始载于《神农
本草经》，其味辛、性平，有大毒［2］，具有逐水祛痰，散
结杀虫的功效，临床上用于肿瘤、结核病、皮肤病的治
疗。国内外学者经大量科学研究证实，狼毒大戟对肿
瘤细胞抑制作用强，抗瘤谱广，副作用小，具有一定的
研发价值［3 － 4］。但其成分复杂，且具体作用机制尚不
明确，为探明其抗肿瘤成分，本实验对狼毒大戟抗肿瘤
活性部位乙酸乙酯层进行分离得到了没食子酸乙酯，
并对其进行了结构确证和纯度分析，采用 MTT法进行
了抗肿瘤活性筛选，为狼毒大戟抗肿瘤物质基础的寻
找提供参考。
1 材料
1． 1 细胞株 人肺癌 A549 细胞株，结肠癌 LOVO 细
胞株(中国科学院细胞库);口腔鳞癌 CAL － 27(中国
协和医科大学研究所细胞中心)。
1． 2 药物 狼毒大戟(齐齐哈尔医学院郭丽娜教授
鉴定)。
1． 3 仪器与试剂 Waters 半制备高效液相色谱仪
·7·
2014 年 5 月第 31 卷第 3 期
Vol. 31，No. 3，May． 2014
中 医 药 信 息
Information on Traditional Chinese Medicine

(美国 Waters公司);层析柱为不同规格口径玻璃柱;
SephadexLH － 20 凝胶(Pharmacia);3111 型 CO2培养
箱(Thermo 公司);5417Ｒ 离心机(Eppendorf 公司);
SAFIＲEⅡ － BASIC －酶标仪(TECAN公司);MTT(Sig-
ma公司);DMEM培养基(美国 GIBCO 公司);胰蛋白
酶(0． 25%EDTA);胎牛血清(HYCLONE公司)。
2 方法
2． 1 没食子酸乙酯提取分离
2． 1． 1 提取
取干燥狼毒大戟药材 5kg，用 90%乙醇回流直至
药液无色为止。收集合并提取液，减压浓缩成浸膏，加
水混悬后，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，
合并乙酸乙酯层萃取液，减压蒸馏，得浸膏 0． 3691kg。
2． 1． 2 分离
取狼毒大戟乙酸乙酯浸膏 20g，经硅胶柱色谱分
离，以正己烷 －乙酸乙酯梯度洗脱，得到 16 个馏分，其
中馏分 4 再经过硅胶柱色谱分离，收集正己烷 －乙酸
乙酯(6∶ 4)的洗脱部分，该部分经 Sephadex LH －20 凝
胶柱色谱分离，采用甲醇作为洗脱剂，经 TLC 识别收
集点相似的部分。
2． 1． 3 半制备液相纯化
采用半制备液相色谱进一步纯化。色谱条件为色
谱柱 Diamonsil(250mm × 10mm，5um);流动相甲醇 －
水(30∶ 70，V /V);流速 4． 0ml /min;柱温:25℃;检测波
长 210nm。通过 0． 45μm 微孔滤膜过滤样品，根据色
谱峰出峰时间接收馏分，得到化合物 10． 14mg。
2． 1． 4 结构测试
取化合物进行1H － NMＲ和13C － NMＲ结构测试。
2． 1． 5 纯度检测
选用取分离所得化合物，采用 TLC 法，分别选取
氯仿 －乙酸乙酯，正己烷 －乙酸乙酯，氯仿 －甲醇三种
展开系统不同体积比的展开剂对化合物进行纯度分
析，并采用分析性 HPLC，在 210nm，280nm两个检测波
长下测定纯度。
2． 2 没食子酸乙酯抗肿瘤活性筛选
2． 2． 1 药液的配制 取没食子酸乙酯溶解于 DMSO
中，取适量加入含 10%小牛血清的 DMEM培养液稀释
制成 5μg /mL、10μg /mL、20μg /mL、40μg /mL、80μg /
mL的溶液，0． 22μm的微孔滤膜过滤除菌，备用。
2． 2． 2 细胞培养 LOVO、A549、CAL － 27 细胞用含
10%灭活的胎牛血清的 DMEM培养基，置于 37℃，5%
CO2培养箱中培养，取处于对数生长期的细胞用胰酶
消化后用 PBS 清洗 1 ～ 2 遍后，通过含血清的 DMEM
培养基调整浓度为 5 × 105个 /mL细胞悬液备用。
2． 2． 3 MTT法检测细胞活性
将单细胞悬液接种于 96 孔板中，每孔 200μl，培
养 24h细胞贴壁后，换成含有上述不同浓度药物的培
养基，每组设五个复孔，置于培养箱中，分别培养 24h、
48h、72h，在培养结束后每孔加入 5mg /ml 的 MTT
20μl。继续培养 4h后弃上清，每孔加入 150μl的 DM-
SO震荡 10min，通过酶标仪在 490nm处检测各孔的吸
光度值。计算肿瘤细胞的抑制率［5 － 6］。
肿瘤细胞的生长抑制率(%)=(1 －实验组平均
OD值 /对照组平均 OD值)× 100%
2． 2． 4 统计学处理 数据用(珋x ± s)表示，结果采用
SPSS 13． 0 软件进行统计分析，P ＜ 0． 05 具有统计学
意义。
3 结果
3． 1 没食子酸乙酯的结构确证
没食子酸乙酯(Ethyl gallate)，白色针状结晶(氯
仿 －甲醇)，三氯化铁 －铁氰化钾反应阳性，示有酚羟
基;1H － NMＲ (300MHz，DMSO － d6)δ:9． 26(2H，s，3、
5 － OH)、8． 94(1H，s，4 － OH)、6． 94(2H，s，2、6 － H)、
4． 21(2H，q，8 － H)，1． 27(3H，t，9 － H) ;13 C － NMＲ
(75MHz，DMSO － d6)δ:166． 2(C － 7)、145． 9(C － 3，
C －5)、138． 7(C － 4)、120． 0(C － 1)、108． 8(C － 2，
C －6)、60． 4(C － 8)、14． 6(C － 9)。根据波谱数据结
合文献［7］，确定化合物为没食子酸乙酯。结构式如图 1。
图 1 没食子酸乙酯的化学结构
3． 2 纯度验证
不同展开系统不同体积比均显示单一的斑点。在
双波长检测下均为单一的色谱峰，纯度均高于 99%
(结果见图 2，图 3)。
图 2 物质在 210nm波长下检测图谱
·8·
中 医 药 信 息
Information on Traditional Chinese Medicine
2014 年 5 月第 31 卷第 3 期
Vol. 31，No. 3，May． 2014

图 3 物质在 280nm处检测图谱
3． 3 没食子酸乙酯对 LOVO，U251，CAL － 27 的生长
抑制作用
实验结果表明(见表 1)，没食子酸乙酯对三种肿
瘤细胞均有不同程度的抑制作用。与对照组相比，具
有显著性差异。且随着药物浓度的增高，抑制率随之
增高，呈现良好的量效关系。药物作用 72h 后，对 LO-
VO，U251、CAL － 27 的最高抑制率分别为(74． 67 ±
2. 84)%、(67． 38 ± 1． 30)%和(35． 52 ± 2． 14)%。
表 1 药物作用时间和浓度与死亡率之间的关系(珋x ± s，n = 5)
受试细胞 样品名称 质量浓度(μg /ml)
细胞抑制率(%)
24h 48h 72h
LOVO 没食子酸乙酯 5 2． 26 ± 0． 53 7． 02 ± 1． 40 17． 77 ± 2． 47
10 5． 31 ± 1． 01 16． 34 ± 1． 72 28． 77 ± 1． 18
20 16． 77 ± 1． 34 27． 15 ± 2． 10 53． 04 ± 2． 41
40 33． 58 ± 2． 21 52． 67 ± 1． 73 71． 32 ± 0． 96
80 47． 51 ± 2． 23 66． 04 ± 1． 48 74． 44 ± 0． 47
A549 没食子酸乙酯 5 1． 79 ± 0． 33 5． 81 ± 0． 97 13． 77 ± 2． 33
10 4． 85 ± 0． 91 13． 20 ± 0． 86 26． 82 ± 1． 38
20 13． 85 ± 2． 03 23． 54 ± 2． 33 43． 61 ± 1． 41
40 22． 39 ± 1． 68 43． 79 ± 2． 18 59． 92 ± 0． 97
80 30． 36 ± 2． 05 50． 65 ± 1． 93 62． 01 ± 1． 27
CAL － 27 没食子酸乙酯 5 0． 71 ± 0． 12 2． 40 ± 0． 41 4． 57 ± 0． 89
10 1． 31 ± 0． 23 8． 53 ± 1． 68 12． 16 ± 1． 08
20 6． 83 ± 1． 12 12． 60 ± 1． 73 20． 96 ± 1． 58
40 16． 42 ± 1． 80 28． 16 ± 1． 94 35． 50 ± 2． 30
80 21． 81 ± 0． 89 30． 50 ± 1． 89 37． 17 ± 2． 12
4 讨论
从天然药物中寻找高效低毒的抗肿瘤药物已成为
当前研究的趋势。狼毒大戟作为我国重要的中草药资
源，常被用于癌症、水肿、腹水的治疗，并取得了很好的
疗效［8］。近年来研究发现，二萜类为其主要的抗癌活
性成分［9］，对该类成分研究偏多，对其他成分研究偏
少。据文献报道，没食子酸乙酯对肝癌、胃癌、乳腺癌
具有抑制生长的作用，但对结肠癌细胞、肺癌细胞及口
腔癌细胞的杀伤作用未见报道。本实验采用硅胶柱色
谱法、Sephadex LH － 20 凝胶柱色谱法和半制备高效
液相色谱法从狼毒大戟中提取分离没食子酸乙酯，具
有较高纯度，并通过体外抗肿瘤活性的筛选证实，没食
子酸乙酯为狼毒大戟的抗肿瘤活性成分之一。对 LO-
VO、A549、CAL －27 细胞均具有抑制肿瘤细胞增殖作
用，且该药物对不同细胞的作用存在差异，其中对 LO-
VO细胞作用最显著。但通过何种途径抑制肿瘤细胞
的生长及其相关的机制将有待于进一步的探索与
研究。
参考文献:
［1］ 蔡珍珍，金铭，温宪春，等．狼毒大戟石油醚提取物和乙酸乙酯提取物
的半数致死量测定［J］．中国医学创新，2013，10(2):158 －159．
［2］ 章振东，徐德昌．狼毒大戟的研究进展［J］． 中国甜菜糖业，2007，
45(4):26 － 28．
［3］ 王圆圆，王义善，杨桂青，等． 狼毒提取液对小鼠恶性黑色素瘤
B16 细胞体内转移能力的能力［J］． 中国实验方剂学杂志，2013，
19(1):195 － 198．
［4］ 王蒙，魏晴，王秋红，等．狼毒大戟中巴豆烷型二萜的抗肿瘤活性
研究［J］．中医药学报，2013，41(4):11 － 14．
［5］ Nawaz H，Garcia A，Meade AD，et al． Ｒaman micro spectroscopy study
of the interaction of vincristine with A549 cells supported by expres-
sion analysis of bcl － 2 protein［J］． Analyst，2013，138(20) :6177 －
6184．
［6］ 倪冲，裴志东，张镓小，等． 乌骨藤中白桦酯酸的提取分离及抗肿
瘤活性［J］．中国实验方剂学杂志，2012，18(9):172 － 175．
［7］ 刘延麟．没食子单体化合物分离鉴定及其药理活性研究［D］． 吉
林:吉林大学，2009．
［8］ Sun Yx，Liu JC． Chemical Constituents and Biological Activities of Eu-
phorbia fischeriana［J］． Chemistry and Biodiversity，2011，8(7):
1205 － 1213．
［9］ Wang YB，Huang Ｒ，Wang HB，et al． Diterpenoids from the roots of
Euphorbia fischeriana［J］． Journal of Asian Natural Products Ｒe-
search，2010，12(12) :1038 － 1043．
·9·
2014 年 5 月第 31 卷第 3 期
Vol. 31，No. 3，May． 2014
中 医 药 信 息
Information on Traditional Chinese Medicine
