全 文 ：溪黄草有机酸提取分离及抑制亚硝
化反应研究
段志芳 ,陈庆华(肇庆学院生物医药工程中心 , 广东 肇庆
526061)
摘要:目的　提取分离溪黄草中有机酸并研究其对亚硝化反
应的抑制作用。方法　采用直接电位滴定法测定溪黄草中总
有机酸含量 ,试验其最佳提取工艺条件 , 依此条件提取总有机
酸并进行分离纯化 , 鉴定有机酸结构类型并研究其对亚硝化反
应的抑制作用。结果　溪黄草总有机酸提取率可达 3.97%,主
要为乌苏烷型三萜类有机酸 , 在一定浓度范围能阻断亚硝胺
的合成及清除亚硝酸盐。结论　溪黄草有机酸对亚硝化反应
具有抑制作用。
关键词:溪黄草;有机酸;提取分离;抑制亚硝化
中图分类号:R284.2　　　文献标识码:A　　　
文章编号:1004-2407(2009)05-0367-03
基金项目:肇庆市科技局资助项目(203E501)
　　唇形科香茶属植物溪黄草(Rabdosia serra
(Max im.)Hara)是一种多年生小草本 ,在华南各地
应用较广 ,具有清热祛湿 、凉血散瘀 、抗肿瘤 、抗菌 、消
炎及保护肝脏作用 ,临床用于治疗乙型肝炎 、急性黄
疸型肝炎 、急性胆囊炎以及痈肿等症[ 1] 。
越来越多的研究表明 ,中药中的有机酸类成分具有
抗肿瘤 、抑菌 、抗血栓 、抗艾滋病毒等广泛的生物活性。
因此 ,中药有机酸类成分的研究开发具有非常大的潜
力 ,有望成为一类应用广泛 、疗效好、作用强的药物[ 2] 。
笔者应用直接电位滴定法测定溪黄草中总有机
酸含量 ,试验得到最佳提取工艺条件 ,依此方法提取
并分离纯化有机酸 , IR 、MS 、NM R谱图解析鉴定有
机酸的结构类型 ,通过对二甲基亚硝胺(NDMA)合
成的阻断及对亚硝酸钠的清除率的测定 ,研究其对亚
硝化反应的抑制作用 ,以期为溪黄草有机酸的广泛开
发和应用提供依据。
1　仪器与试药
1.1　仪器　UV-2550型紫外可见分光光度计(日本
岛津);X-4显微熔点仪(北京);FTIR-8400S 红外光
谱仪(日本岛津);VGZAB-HS 型质谱仪(美国);
UNIT YINOVA500型核磁共振仪(美国)等。
1.2　试药　溪黄草 Rabdosia serra(Maxim .)Hara
购于肇庆市中药材商店(经肇庆学院生物系陈雄伟副
教授鉴定);其它试剂均为分析纯。
2　方法与结果
2.1　溪黄草有机酸的提取分离
2.1.1　提取条件的选择　提取工艺流程为:溪黄草
※干燥 ※粉碎 ※过筛 ※提取 ※离心 ※过滤 ※
减压浓缩 ※定容 ※取样检测有机酸得率 。以不同
体积分数的乙醇作为提取试剂 ,分别进行提取剂浓
度 、料液比 、提取温度 、提取时间单因素试验和正交试
验以及提取次数等实验条件的选择 。有机酸含量测
定采用直接电位滴定法 , 具体方法和操作参考文
献[ 3] 。单因素试验结果表明乙醇体积分数控制在
60%～ 80%、料液比定在 1∶10 ～ 1∶15 、提取时间定
在 2 ～ 3 h 、提取温度以 80 ～ 90 ℃之间较好;正交试
验结果表明溪黄草有机酸最佳提取条件为 60%乙醇
水溶液 、在温度 90 ℃、料液比为 1∶15条件下提取 3
h;提取次数试验结果表明只需提取2次 ,即可将大部
分有机酸从溪黄草中提取出来 ,2次有机酸提取率可
达 3.97%。
表 1　溪黄草有机酸提取 L9(34)的正交设计及极差分析结果
实验号 乙醇体积分数/ %
A
料液比/1:n
B
提取温度/ ℃
C
提取时间/ h
D
总有机酸含量/ %
1 60(1) 10(1) 80(1) 2.0(1) 2.21
2 60(1) 13(2) 85(2) 2.5(2) 2.42
3 60(1) 15(3) 90(3) 3.0(3) 2.73
4 70(2) 10(1) 85(2) 3.0(3) 2.38
5 70(2) 13(2) 90(3) 2.0(1) 2.42
6 70(2) 15(3) 80(1) 2.5(2) 2.31
7 80(3) 10(1) 90(3) 2.5(2) 2.45
8 80(3) 13(2) 80(1) 3.0(3) 2.24
9 80(3) 15(3) 85(2) 2.0(1) 2.28
K1 7.36 7.04 6.76 6.91
K2 7.11 7.08 7.08 7.18
K3 6.97 7.32 7.60 7.35
k1 2.45 2.35 2.25 2.30
k2 2.37 2.36 2.36 2.39
k3 2.32 2.44 2.53 2.45 最优
R 0.13 0.09 0.28 0.15 A1B3 C3 D3
优水平 A1 B3 C3 D3
2.1.2　溪黄草总有机酸的提取纯化　取溪黄草粉末
5.0 kg ,按照 2.1.1项下确定的最佳提取条件进行提
取 ,将提取液过滤 ,滤液减压浓缩至小体积;加 5%无
水碳酸钠溶液 ,调 pH11.5 左右;用乙酸乙酯反复萃
取至萃取液无色 ,收集碱水液;以盐酸酸化至 pH2左
右;再以乙酸乙酯反复萃取 ,合并乙酸乙酯萃取液 ,减
压回收溶剂;蒸干后用乙醇溶解 ,过滤 ,滤液浓缩 ,真
空干燥 ,得总有机酸提取物 。
2.1.3　溪黄草有机酸的分离鉴定　将溪黄草总有机
酸提取物溶于甲醇 ,拌入 100 ～ 200 目硅胶 ,室温干
燥 ,然后上硅胶柱进行层析分离 ,以石油醚 、乙酸乙酯
进行梯度淋洗 ,所得组分反复柱层析 ,得到 2个主要
组分:化合物 I 和化合物 II ,产物经 IR 、MS 、1H-NMR
和13C-NMR解析并与标准谱图对照确定 。溪黄草中
的有机酸主要为乌苏烷型三萜类有机酸。化合物 I:
白色粉末 , mp281 ～ 283 ℃, Liebemann-Burchard 反
应阳性 。IR(KBr)cm-1 :3 434 , 2 928 , 2 869 , 1 690 ,
1 456 ,1 382 , 1 032 , 996;EI-MS m/ z:456 , 438 , 423 ,
248 , 235 , 203 , 189 , 133;1H-NMR 和13 C-NMR 谱图
数据与文献[ 4] 报道基本一致 ,故确定化合物 I为乌苏
酸 。化合物 II:白色粉末 , Liebemann-Burchard 反应
阳性。 IR(KBr)cm-1 :3 425 , 1 692 , 1 637 , 1 457 ,
367西北药学杂志　2009 年 10 月　第 24 卷　第 5 期
1 389 ,1 107 , 1 049;EI-MS m/ z:473[ M +1] +;1H-
NMR和13C-NMR谱图数据与文献[ 5]报道基本一致 ,
故确定化合物 II为 2α-羟基乌苏酸 。
2.2　溪黄草有机酸抑制亚硝化反应研究　亚硝胺是
最令人关注的一类化学致癌物 ,它能引起肝脏等多种
器官的恶性肿瘤 。阻断亚硝胺合成或清除亚硝胺的
前体是预防癌症的一个有效途径 。溪黄草有机酸阻
断亚硝胺合成及清除 NaNO2 的试验具体操作参考
文献[ 6] 。
2.2.1　溪黄草有机酸对二甲基亚硝胺合成的阻断　
当向溪黄草有机酸中依次加入二甲胺与亚硝酸钠时 ,
溪黄草有机酸优先同亚硝酸钠作用 ,使得二甲胺不能
与亚硝酸钠反应 ,达到阻止亚硝胺生成的目的 。生成
亚硝胺量少 ,溪黄草有机酸的阻断能力就强 ,反之则
弱。分别取不同浓度溪黄草有机酸的体积分数 95%
乙醇溶液 1.0 mL 置于 25 mL 量瓶中 ,加入 pH3.0
的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液 10 mL ,1 mmo l/L NaNO 2
溶液 1 mL , 1 mmol/ L 二甲胺溶液1 mL ,用蒸馏水定
容至刻度 ,在 37 ℃下恒温 1 h 。吸取 1.0 mL 上述
NDMA反应液至 6 cm2 的培养皿中 , 加入 0.5%
Na2CO 3 溶液 0.5 mL ,于黑布遮盖的紫外分析仪上
照15 min ,紫外灯离液面 15 cm ,取出后加1%对氨基
苯磺酸溶液 1.5 mL ,再加 0.1%的α-萘胺 1.5 mL ,
加蒸馏水精确为 5.0 mL ,然后摇匀放置 15 min ,在
525 nm处测吸光度值(A x)。同时用 95%乙醇做空
白实验测吸光度值(A 0),计算阻断率。阻断率 =
(A 0-A x)/ A0 ×100%试验首先在质量浓度 0.01 ～
100 g · L-1范围选择试验点 ,结果表明在 0.1 ～ 1.0
g ·L-1质量浓度范围出现拐点 ,为了研究溪黄草有
机酸对二甲基亚硝胺合成的阻断规律 ,试验再在拐点
浓度附近选取试验点 ,0.1 ～ 0.5 g ·L -1质量浓度溪
黄草有机酸对二甲基亚硝胺合成阻断作用 ,见图 1。
图 1　溪黄草有机酸对亚硝胺合成的阻断率
由图 1可见 ,当溪黄草有机酸质量浓度小于 0.10
g ·L-1时 ,其对二甲基亚硝胺的阻断率较小;当溪黄
草总有机酸浓度在 0.10 ～ 0.30 g ·L-1之间时 ,随着
溪黄草有机酸用量的增加 ,其对二甲基亚硝胺的阻断
率呈现出明显梯度变化;当溪黄草总有机酸浓度大于
0.30 g ·L -1时 ,对二甲基亚硝胺的阻断率略有下降 。
2.2.2　溪黄草有机酸对 NaNO 2 的清除作用　亚硝
酸盐在弱酸性的条件下 ,能与氨基苯磺酸重氮化后 ,
再与 N-1-萘乙二胺盐酸盐偶合生成红色的化合物 ,
测定红色化合物的变化可以反映出提取物清除
NaNO 2 能力的强弱。分别取不同浓度溪黄草有机酸
的 95%乙醇溶液 1.0 mL 置于 25 mL 量瓶中 ,加入
10 mL pH3.0的柠檬酸钠-盐酸缓冲液 ,25 mg · L-1
的 N aNO 2 溶液 2 mL ,用蒸馏水定容至刻度 ,37 ℃恒
温 1 h ,然后各吸取 1 mL 反应液于 6 cm2 培养皿中 ,
加入 0.4%的对氨基苯磺酸溶液 2 mL ,0.2%N-1-萘
乙二胺盐酸盐溶液 2 mL ,摇匀放置 15 min后 ,用分光
光度计在 540 nm 处测吸光度值(Ax),同时用 95%乙
醇做空白实验测吸光度值(A 0),计算清除率 。清除
率=(A0-A x)/ A0 ×100%
试验选择不同质量浓度范围溪黄草有机酸反复
实验 ,找出能够反映溪黄草有机酸对 NaNO 2 清除作
用规律的浓度范围 ,0.1 ～ 0.5 g ·L -1溪黄草有机酸
对 N aNO 2 清除作用 ,见图 2。
图 2　溪黄草有机酸对亚硝酸钠的清除率
由图 2可见 ,当溪黄草有机酸质量浓度小于 0.10
g ·L-1时 ,其对 NaNO 2 清除作用较弱;当溪黄草总
有机酸质量浓度在 0.10 ～ 0.40 g · L -1时 , 其对
NaNO 2 清除作用具有明显的梯度变化;当溪黄草总
有机酸浓度大于 0.40 g ·L-1时 ,对 NaNO2 清除率
略有下降。
3　讨论
溪黄草总有机酸的最佳提取条件为:使用体积分
数 60%的乙醇水溶液 、在温度 90 ℃、料液比为 1∶15
条件下提取 3 h ,连续提取2次 ,总提取率可达3.97%。
利用该条件对溪黄草总有机酸进行提取并萃取 ,总有
机酸经柱色谱进一步分离纯化得到 2个主要组分 ,理
化性质及谱图数据表明它们为乌苏烷型三萜类 ,总有
机酸及各单组分有机酸对亚硝化反应有抑制作用 ,具
有一定预防保健应用前景 ,为开发利用溪黄草提供了
有益的参考 。
参考文献:
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分离鉴定与抗肿瘤活性[ J] .中国药物化学杂志 , 2004 ,
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作用研究[ J] .化学世界 , 2004 , 45(1):26-28.
(收稿日期:2009-04-14)
正交实验法优选南五味子的炮制
工艺
孙华芳1 ,李　洁2(1.中山大学东莞东华医院 , 广东 东莞
523110;2.东莞市药品检验所 ,广东 东莞 523110)
摘要:目的　对南五味子醋制的炮制工艺进行了规范化研究 ,
并在此基础上探讨南五味子的最佳醋蒸工艺。方法　以分光
光度法测定总木脂素的含量为指标 , 选择醋的用量 、蒸制时
间 、闷润时间 3 个因素 , 并通过 L9(3)4 正交实验 ,采用方差分
析方法 ,对南五味子进行醋蒸工艺的优选。 结果　蒸制时间
对南五味子质量有显著的影响。结论　醋制五味子的最佳工
艺为 A 2B3C2 , 即取南五味子 100 kg , 加入 20 kg 醋 , 拌匀闷润
1 h ,蒸制 4 h ,干燥即得。
关键词:南五味子;木脂素;醋蒸;炮制工艺
中图分类号:R927.2　　　文献标识码:A　　　
文章编号:1004-2407(2009)05-0369-02
　　南五味子为木兰科植物华中五味子 Schisandra
sphenanthera Rehd.et w ils.的干燥成熟果实 ,主产于
河南 、陕西 、山西等地 。南五味子性味酸 、甘 、温 ,具有
收敛固涩 、益气生津 、补肾宁心之功效 ,因醋制能增强
酸涩收敛作用 ,故醋南五味子涩精止泻作用更强。临
床常用醋南五味子 ,一般均采用醋蒸法对其进行加工
炮制 ,但目前 2005年版中国药典一部规定[ 1] ,醋蒸南
五味子的炮制方法没有量化标准 ,导致醋蒸南五味子
的炮制工艺因人而异 ,其质量难以得到保证。本实验
选用 L9(3)4 因素水平表 ,以南五味子的木脂素类成
分为指标[ 2] ,结合生产实际选择了醋的用量 、蒸制时
间及闷润时间进行南五味子醋蒸工艺的考察 ,以确定
南五味子的最佳炮制工艺条件 ,为炮制南五味子的生
产及临床应用提供科学依据。
1　仪器与材料
1.1　仪器　TU-1901 型紫外分光光度仪(北京普析
通用仪器有限责任公司)。
1.2　材料　南五味子药材(市售品 ,经作者鉴定为南
五味子);五味子酯甲对照品(中国生物制品检定所);
米醋为江苏镇江老陈醋(市售品),酸度计测其 pH 为
3.5;其它所用试剂均为分析纯 。
2　方法与结果
2.1　正交表的设计　根据南五味子药材的性质并结
合实际生产 ,在本实验中选取不同的辅料用量 ,蒸制
时间 、闷润时间为 3 个考察因素 , 进行醋蒸工艺研
究 ,以南五味子总木脂素的含量为指标 ,并比较了 3
个因素(加辅料量 、蒸制时间 、闷润时间)对总木脂素
含量的影响 ,从而确定了醋制各因素的水平 ,各因素
与水平见表 1 。
表 1　正交法优选醋蒸南五味子工艺的因素水平表
水平
因　　素
A ,醋质量分数/ % B ,蒸制时间/h C ,闷润时间/h
1 10 2 0.5
2 20 3 1
3 30 4 1.5
2.2　样品制备　按选用 L9(3)4 表 2中拟定的试验
方法进行炮制研究 , 即称取净南五味子 200 g 为 1
份 ,共 9份 ,加入规定比例量的米醋(质量比),分别置
适宜的容器内 ,闷润相应的时间后 ,每个试验号隔水
加热蒸至规定的时间 ,取出干燥 ,备用。
2.3　南五味子总木脂素的含量测定[ 3]
2.3.1　对照品溶液的制备　取五味子酯甲对照品约
7.5 mg ,精密称定 ,用甲醇溶解并定容至 25 mL 量瓶
中 ,摇匀 ,即得 0.300 8 g · L-1的对照品溶液 。
2.3.2　供试品溶液的制备　取南五味子各醋制品粉
末(过 3号筛)约 1 g ,精密称定 ,置于 20 mL 量瓶中 ,
加甲醇约18 mL ,超声处理20 min ,放冷 ,用甲醇定容
至刻度 ,摇匀 ,滤过 ,取续滤液备用。
2.3.3　总木脂素的含量测定　精密吸取供试品溶
液 、五味子酯甲对照品溶液 、甲醇各 20 μL ,分别置于
2支具塞试管中 ,挥去甲醇 ,再分别精密加入 10%变
色酸澄清水溶液 0.5 mL 、硫酸 3 mL 、水 1.5 mL ,摇
匀 ,置沸水浴中加热 30 min ,迅速冷却 ,以上述甲醇
管为空白 ,照分光光度法于 570 nm 波长处测定吸收
度 ,计算含量 ,结果见表 2。
2.4　数据统计结果　以南五味子各炮制品中的总木
脂素含量为指标进行评价 ,对上述实验结果进行方差
分析 ,结果见表 3。
由表 3可知 ,B因素有显著性差异(P <0.05),C因
素与A 因素无显著性差异(P >0.05),即辅料用量及
闷润时间对南五味子醋蒸品的质量无显著的影响 ,而
蒸制时间对南五味子醋蒸品的质量有显著的影响 。
以南五味子总木脂素含量评定的实验结果及由表 2
中极差 R 值大小来看 ,即取南五味子 100 kg ,加入 20
kg 的醋 ,拌匀闷润 1 h ,蒸制 4 h ,干燥即得。因此确
定南五味子最佳的炮制工艺应为 A 2B3C2 。
369西北药学杂志　2009 年 10 月　第 24 卷　第 5 期