全 文 ：doi:10.3969/ j.issn.1002-7351.2009.03.023
不同预处理对人心果叶片原生质体产量的影响
罗丽华 ,杨定海 ,严虹羽
(海南大学热带园艺植物资源与遗传改良教育部重点实验室 ,海南 海口 570228)
摘要:以人心果嫩叶为材料 , 研究暗处理 、萎蔫处理和预先质壁分离 3 种不同预处理对人心果叶片原生质体产量的影响。
结果表明:经过暗处理后叶片原生质体产量都有所增加 ,其中处理 36 h 产量最高 , 比对照提高了 36.46%;经预先质壁分离
处理后叶片原生质体产量有明显的增加 ,在 90 min 内随处理时间的增加而增多;萎蔫处理后对叶片原生质体产量的影响较
复杂 ,处理 6 h 产量有所减少 ,而处理 8 h 产量相对较多 , 比对照提高了 22.93%。
关键词:人心果;预处理;原生质体;产量
中图分类号:S667.9　　　文献标识码:A　　　文章编号:1002-7351(2009)03-0098-04
Effect of Different Pretreatments on the Protoplast Yield of Manilkara zapodi lla Leaf
LUO Li-hua ,YANG Ding-hai , YAN Hong-yu
(Key Laboratory of Tropical Horticultural Plant Resource and Genetic Improvement of M inistry
of Education , Hainan University , Haikou 570228 , Hainan , China)
Abstract:The paper studied the effect of three different pretreatments of leaves dark treatment , wilting treatment and plasmolysis
in advance on leaf protoplam production of Manilkara zapodilla by using the M.zapodilla tender leaf as the material.The results
show ed that all the production of pro toplam increased after dark treatment , the best of y ield was after 36 hours , increasing by
36.46% as compared with the control;the production of pro toplam increased significantly af ter treatment of plasmoly sis in ad-
vance , in 90 minutes , the y ield increased with the increasing of treatment time;the w ilting treatment effect on production of pro-
toplam w as more complex , the yield reduced after 6 hours of treatment , but the yield w ere relatively high after 8 hours , increased
by 22.93% as compared w ith the control.
Key words:Manilkara zapodilla;pretreatment;pro toplam;production
　　人心果(Manilkara zapodil la)为山榄科 、人心果属植物[ 1] ,原产墨西哥 、中美洲以及东南亚 ,中国主要
分布在海南 、广东 、福建 、台湾 、广西 、云南等地 ,极喜高温湿润气候[ 2] 。人心果营养丰富 ,有清心润肺之功
效 ,种子 、树皮和根可入药 ,树干胶汁可作口香糖的胶料 ,是经济价值较高的树种;而且周年常绿 ,树姿优
美 ,也是良好的观赏树木[ 3] 。因此 ,人心果的产量和质量越来越受到重视 。种植生产上 ,除台湾外 ,缺乏
优良品种 ,栽培技术也较落后 。
为了获得优良品种 ,可以采取原生质体培养的方法 。由于每个细胞的原生质体都含有该个体的全部
遗传信息 ,在适宜的培养条件下具有再生成与亲本相似个体的全能性和原生质体能克服性细胞的不亲和
障碍性 ,进行远缘杂交 ,从而获得远缘杂种。原生质体经过诱导产生融合体并再生细胞壁后 ,进行核融合 ,
产生杂种细胞 ,经过选择 、鉴定后 ,诱导杂种细胞分化而培养成杂种植株 。原生质体培养和细胞融合创造
出新品种或育成优良品种 ,从而加速优良品种的培养和选育有着重要的意义[ 4] 。
由于植物细胞壁上具有活性很强的核酸酶 ,核酸酶可阻止外源 DNA进入植物细胞。除去细胞壁后 ,
可避免核酸酶对异体 DNA的破坏 ,没有细胞壁的原生质体较易从外界摄入病毒 、细菌 、细胞核 、蛋白质 、
核酸等[ 5] 。在酶解前对材料进行预处理 ,可以改变细胞壁的生理状态 ,增加细胞膜的生理强度 、达到提高
细胞壁酶解效率 、减少原生质体损伤的目的 ,对提高原生质体的产量具有重要意义[ 6] 。目前常见的预处理
　收稿日期:2008-08-26;修回日期:2008-10-22
　基金项目:海南大学校级自然科学基金课题项目(编号:Ktjj0614)
　作者简介:罗丽华(1974-), 女 ,福建连城人 , 海南大学讲师 ,硕士研究生 , 从事植物学和植物生理学教学科研工作。
　通讯作者:杨定海(1975-), 男 ,陕西宝鸡人 , 海南大学讲师 ,硕士研究生 , 从事植物景观研究教学工作。
第 36 卷 第 3 期
2 0 0 9 年 9 月
福 建 林 业 科 技
Jour of Fujian Forestry Sci and Tech
Vol.36　No.3
Sep., 2 0 0 9
方法主要有:叶片暗处理 、叶片萎蔫预处理 、预先质壁分离处理 、低温处理和诱导愈伤组织培养基预培养
等。本实验主要研究叶片暗处理 、叶片萎蔫处理 、预先质壁分离处理这 3种不同的预处理方法对原生质体
产量的影响。
1　材料与方法
1.1　材料
实验材料为海南大学农学园人心果椭圆形果类型的嫩叶 ,叶片的摘取时间为每次试验开始之前
30 min之内 。
1.2　实验方法
1.2.1　原生质体分离方法　采用酶解法进行分离 ,所采用的酶为纤维素酶和果胶酶 。
1.2.2　原生质体产量的测定　原生质体产量用血球计数板计数 ,以每 g 鲜重的起始材料分离得到的原
生质体个数(个·g-1)来表示 ,即:
　　悬浮液中的原生质体数/mL=1个大方格悬浮液中的原生质体数×10×1 000
　　原生质体产量=悬浮液中的原生质体数/mL ×总体积 。
1.3　实验设计
1.3.1　最佳酶组合的确定　人心果的嫩叶放入不同浓度的纤维素酶(质量分数分别为 0.5%、1%、
1.5%、2%、3%、4%)和果胶酶(质量分数分别为 0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%)的酶解液中 ,在暗处
酶解 2 h ,在显微镜下观察原生质体分离情况 ,以确定最佳酶组合 。
1.3.2　最佳酶处理时间的确定　将叶片转入最佳酶组合液中 ,分别设 2 h 、4 h 、6 h 、8 h 、10 h 、12 h共 6个
时间处理 ,比较不同处理时间人心果叶片原生质体产量和细胞碎片多少的影响 ,以确定最佳酶解时间。
1.3.3　预处理实验设计
1)暗处理 。将嫩叶片洗净晾干 ,进行暗处理 ,暗处理的时间分别为 24 h 、28 h 、32 h 、36 h ,测定原生质
体的产量 ,并与叶片没有经过预处理的空白实验进行对照 ,分析其预处理对原生质体产量的影响。
2)叶片萎蔫预处理 。萎蔫处理的时间分别为 2 h 、4 h 、6 h 、8 h ,测定原生质体的产量 ,并以未经预处
理的叶片作为对照 ,分析预处理对原生质体产量的影响 。
3)预先质壁分离处理。预先质壁分离处理的时间分别为 30 min 、60 min 、90 min 、120 min ,测定原生
质体的产量 ,并以未经预处理的叶片作为对照 ,分析预处理对原生质体产量的影响。
2　结果与分析
2.1　酶类组合对叶片原生质体分离的影响
酶类组合是影响原生质体分离的最大因素之一 ,不同浓度的酶液组合对叶片原生质体产量及活性的
影响明显不同。
从表 1可以看出 ,纤维素酶质量分数<2%时 ,原生质体产量极低甚至未发生酶解 ,随着纤维素酶的浓
度增大 ,原生质体的产量明显增加 ,细胞碎片也增多 ,酶质量分数为 3%时 ,原生质体数量最多 ,但当纤维
素酶质量分数增大到 4%时 ,原生质体的产量反而下降 ,细胞碎片明显增多 ,这说明酶液在解离细胞壁的
同时 ,高浓度酶液对原生质体也有一定的毒害作用 。
当纤维素酶质量分数为 3%,果胶酶质量分数为 0.2%～ 0.4%时 ,原生质体的数量最多;当果胶酶质
量分数为 0.6%时 ,原生质体的数量减少 ,细胞碎片增加。进一步对纤维素酶 3%+果胶酶 0.2%～ 0.4%
组合进行实验 ,结果见表 2。由表 2可知 ,随着果胶酶的质量分数增加 ,原生质体的数量增加 ,当果胶酶的
质量分数为 0.4%时 ,原生质体的产量最大达到 4.6×106 个·g-1 FW 。综上所述 ,纤维素酶∶果胶酶=
3%∶0.4%为最佳酶液配比。
2.2　酶处理时间对叶片原生质体分离的影响
同一酶液组合 ,不同处理时间原生质体的产量也不同。从表 3可以看出 ,酶解时间对原生质体的产量
·99·第 3 期 罗丽华 ,等:不同预处理对人心果叶片原生质体产量的影响
和质量有明显影响 ,酶解 2 ～ 4 h内 ,随时间的延长原生质体的产量增加 , 6 h与 8 h 相比增加不显著 ,10 h
后原生质体数量减少 ,细胞碎片明显增加 。这一方面说明 2 ～ 4 h的酶解时间已接近人心果的原生质体产
量的最高值;另一方面证明了长时间(10 h 以上)酶解对细胞有负面作用。综合上述因素 ,人心果叶片分
离酶解的时间以 2 h为宜。
表 2　3%纤维素酶和不同质量分数的果胶酶组合
对人心果嫩叶原生质体分离的影响
果胶酶质
量分数/ % 产量/ ×106 个·g -1 镜检 细胞碎片
0.2 0.25 + +
0.3 0.54 ++ ++
0.4 4.6 ++++ ++
表 3　酶解时间对人心果原生质体分离的影响
酶解时间/ h 产量/ ×106 个·g -1 镜检 细胞碎片
2 4.60 ++++ +
4 3.80 +++ ++
6 3.80 +++ ++
8 2.50 ++ +++
10 1.60 + ++++
12 1.28 + +++
2.3　不同预处理对人心果叶片原生质体产量的影
响
在确定酶的最佳质量分数配比为纤维素酶∶果
胶酶=3%∶0.4%和最佳酶解时间为 2 h 后 ,进行
原生质体分离 ,测其产量 ,以此为对照 ,同时对人心
表 1　纤维素酶对叶片原生质体分离的影响
纤维素酶质量分数/ % 果胶酶质量分数/ % 观察酶解情况 细胞破碎
0.5 0.05 - -
0.5 0.1 - -
0.5 0.2 - -
1.0 0.05 - -
1.0 0.1 - -
1.0 0.2 - -
1.5 0.05 - -
1.5 0.1 - -
1.5 0.2 + -
2 0.2 + -
2 0.3 ++ +
2 0.4 ++ +
3 0.2 +++ +
3 0.3 +++ +
3 0.4 +++ +
3 0.6 ++ ++
4 0.3 ++ ++
4 0.4 ++ ++
4 0.6 ++ +++
＊:-为没有;+为很少;++为较多;+++为很多。下同。
果叶片进行预处理 ,以确定不同预处理对人心果叶片原生质体产量的影响 。
2.3.1　叶片暗处理对人心果叶片原生质体产量的影响　表 4表明 ,暗处理对原生质体产量均有所提高 ,
在28 ～ 36 h 内原生质体产量随时间的增多而增加 ,但在 32 h内对原生质体产量的影响并不是很明显。经
暗处理达到最佳效果的是 36 h ,其产量比原先提高了 36.46%。
2.3.2　叶片预先质壁分离处理对人心果叶片原生质体产量的影响　从表 4可以明显看出 ,用 13%的甘
露醇预处理有效地提高了人心果的原生质体产量 ,其中预处理 90 min达到较好的效果 ,原生质体产量提
高了 31.88%。这可能是质壁分离使细胞膜与壁在一定程度上分离 ,减轻了游离过程对膜的损伤 。
2.3.3　叶片萎蔫处理对人心果叶片原生质体产量的影响　表 4表明:叶片萎蔫处理对人心果叶片原生质
体产量的影响较复杂 ,6 h产量降低了 4.37%,但总体来说对原生质体产量的提高还是有促进作用 ,其中
·100· 福 建 林 业 科 技 第 36 卷
8 h产量较高 ,提高了 22.93%。产量降低的原因 ,可能是由于吸取原生质体悬浮液时没有取到更多的原
生质体 ,致使在计数板无法观察到原生质体。
3　结论与讨论
1)获得大量的 、完整的 、有活力的原生质体 ,是原生质体培养成功的首要条件 。但原生质体产量受很
多因素的影响 ,其最主要的是细胞壁降解酶的种类组合和酶解时间 ,此外还有 pH 值 、质膜稳定剂 、渗透压
稳定剂 、温度 、植物材料的生理状态等。在酶解前对材料进行预处理 ,可以改变细胞和细胞壁的生理状态 ,
增加细胞膜的强度 ,达到提高细胞壁酶解的效果 ,减少原生质体损伤的目的。此外 ,在酶解前对材料进行
预处理对于一些难以培养的材料或进一步提高已成功的原生质体无性系的再生频率是一条有效途径 ,实
验中酶解前对叶片进行预处理有效地提高了原生质体的产量。
2)本实验结果表明:①人心果嫩叶原生质体分离中酶的最佳质量分数配比为:纤维素酶∶果胶酶=
3%∶0.4%;最佳酶解时间为 2 h。 ②暗处理对人心果嫩叶原生质体产量的影响不明显 ,但预处理 36 h 达
到最佳效果 ,产量提高了 36.46%。③预先质壁分离处理对人心果嫩叶原生质体产量产生明显的影响 ,且
预处理 90 min达到较好的效果 ,其产量提高了 31.88%。 ④萎蔫处理对人心果嫩叶原生质体产量的影响
比较复杂 ,有的使产量降低 ,有的使产量增加 ,预处理 6 h产量降低了 4.37%,也是本实验中唯一使产量降
低的预处理 ,但总的来说对产量还是有促进作用。
3)许多研究报道都认为预处理对原生质体分离有利 ,但是很少有人对这方面进行系统地研究 ,本文较
系统地研究了人心果叶片暗处理 、叶片萎蔫处理 、预先质壁分离处理这 3种不同的预处理方法对原生质体
产量的影响 ,奠定了原生质体培养研究的基础 ,同时也为同类研究提供了基础资料。
4)在原生质体培养上要加强基础研究 ,应该加强再生植株的基因型研究 ,加强原生质体分裂 、分化的
潜在生理生化本质和机制 ,以及各种影响因素的深入研究 。另外由于原生质体培养的稳定性和可重复性
较差 ,因此应该提高再生率和重复性。在原生质体融合和体细胞杂交方面 ,应加强各种生理生化以及遗传
机理方面的研究 ,加强原生质体融合和体细胞杂交程序化等研究 。目前原生质体方面的研究仍停留在实
验室阶段 ,应该使其程序化 、工厂化 。
参考文献:
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·101·第 3 期 罗丽华 ,等:不同预处理对人心果叶片原生质体产量的影响