全 文 ：第 26 卷第 5 期
2012 年 10 月
白 城 师 范 学 院 学 报
Journal of Baicheng Normal University
Vol． 26，No． 5
Oct．，2012
草木犀黄酮提取工艺优化及抑菌活性研究
丛建民，陈凤清，孙春玲，王 雪，王 翔，王国强，姚 娜
(白城师范学院 生命科学学院，吉林 白城 137000)
摘要:利用超声波辅助技术研究优化草木犀中黄酮类化合物的提取工艺，及黄酮类化
合物的抑菌效果．采用分光光度法对所提取的黄酮类化合物的进行含量测定，通过单因子
试验、均匀设计试验考察了料液比、超声时间、乙醇浓度、超声温度对草木犀中黄酮类化合
物提取率的影响，结果表明:以上四个因子对黄酮化合物的提取具有不同程度的影响，由
大到小依次为乙醇浓度、超声时间、超声温度、料液比． 确定最佳工艺为料液比 1:10
(g·mL －1)、超声时间 30min、乙醇浓度 80%、超声温度 30 ℃，粗黄酮得率为
0． 884g·kg －1 ．通过滤纸片试验发现黄酮类化合物对土壤细菌具有一定的抑菌作用，对酵
母菌具有促进作用．
关键词:草木犀;黄酮;超声提取;抑菌
中图分类号:K28 文献标识码:A 文章编号:1673-3118(2012)05-0018-07
收稿日期:2012 － 09 － 14
作者简介:丛建民( 1974———) ，男，白城师范学院生命科学学院副教授，博士，研究方向:植物发育生物学;陈凤清( 1962———) ，女，白城师范
学院生命科学学院副教授;孙春玲( 1959———) ，女，白城师范学院生命科学学院教授，研究方向: 生理学研究．
基金项目:吉林省科技厅重点资助项目“草木犀药用价值研究与开发”( 20100903) 和吉林省教育厅:“草木犀药用成分研究”［2010］第 87号．
草木犀(Melilotus suaveclens leseb)为豆科植物，一年生或两年生草本，全草入药，在我国有数百年的栽
培历史．［1］具清热解毒、化湿、杀虫功能，常用于治疗暑热胸闷、疟疾，痢疾、淋病和皮肤疮疡．［2］药理研究
表明，草木犀具有很强的抗炎作用．［3］草木犀的主要成分有香豆素、黄酮、甾体、三萜及其苷等，［4］其中黄
酮类物质具有能防治心脑血管系统的疾病和呼吸系统的疾病，具有抗炎抑菌、降血糖、抗氧化、抗辐射、抗
癌、抗肿瘤以及增强免疫能力等作用．［5 － 8］草木犀还是良好的蜜源植物和优质香料，根系发达，可作为改良
盐碱地的生物脱盐器．［9 － 13］草木犀黄酮研究鲜见报道，本论文通过对草木犀黄酮的提取及抑菌效果的研
究，为合理的利用草木犀资源，为草木犀药用成分的提取研究及开发天然抑菌剂提供理论依据．
1 材料与方法
1． 1 材料
本实验所采用的草木犀来源于白城师范学院实习基地(经过白城师范学院初敬华教授鉴定) ，经过晒
干、粉碎过筛备用．
土壤细菌(分离于白城师范学院校园内的土壤) ，安琪酵母(安琪酵母股份有限公司)．
1． 2 试剂及仪器
1． 2． 1 试剂及培养基
所有试剂、芦丁标品均为分析纯，查氏培养基、［14］牛肉膏蛋白胨培养基．［14］
1． 2． 2 实验仪器
LRQ － LS － 18S手提式压力蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂;新苗超净工作台，上海
81
新苗医疗器械制造有限公司;SY － 360 超声仪，上海宁商超声仪器有限公司;T － 200 电子天平，美国双杰
兄弟(集团)有限公司;T6 新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司;SC － 3610 低速
离心机，科大创新股份有限公司中佳分公司．
1． 3 实验方法
1． 3． 1 波长扫描及标准曲线的制作［15］
以芦丁标品溶液在波长 420 ～ 430nm，T6 紫外分光光度计扫描最大吸收峰，并以最大吸收峰下波长为
工作波长．芦丁标品，制备标准曲线．［15］
1． 3． 2 菌种的活化与分离纯化［16］
称取酵母粉和土壤各 1克溶于 10mL无菌水中，活化 12h，然后逐级稀释，将稀释到 10 －4和 10 －5倍的酵母
菌菌液接种到查氏培养基上，将稀释到 10 －4和 10 －5倍的土壤细菌菌液接种到牛肉膏蛋白胨培养基上，每个稀
释度接两个培养皿．将长出的单菌落划线分离到新的培养基上，划线分离三次即可得到纯的菌种．
1． 3． 3 草木犀的预处理及提取流程
预处理:将阴干的草木犀的茎叶用粉碎机粉碎，筛选 0． 25 ～ 0． 63mm 细度的颗粒，用石油醚浸泡 6 天
后，挥发后备用．
提取流程:草木犀 －粉碎 －乙醚浸泡 －挥发乙醚 －草木犀 －提取 －真空旋转回收 －浓缩 －黄酮浸膏
－回收浸膏
1． 3． 4 草木犀黄酮类化合物的提取单因子试验
1． 3． 4． 1 料液比对提取率的影响
称取备用细度为 0． 63 ～ 0． 25 毫米的草木犀粉末 2 克，每个样品做 3 个平行，分别按 1:10、1:15、1:20、
1:25、1:30(g·mL －1)的料液比加入 50%的乙醇，以 40℃超声提取 20min． 5000rpm离心 10min，提取两次，
合并两次上清液，旋转蒸发、浓缩定容至 50mL，按标准曲线法测定黄酮类化合物的含量．
1． 3． 4． 2 超声时间对提取率的影响
使用料液比 1:20 (g·mL －1) ，分别按 10min、15min、20min、25min、30min 的时间进行超声提取． 方法
同 1． 3． 4． 1．
1． 3． 4． 3 乙醇浓度对提取率的影响
分别用 40%、50%、60%、70%、80%的乙醇浓度进行提取．方法同 1． 3． 4． 1．
1． 3． 4． 4 超声温度对提取率的影响
使用 1:20 的料液比、60%的乙醇，分别在 30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的超声温度条件下超声 20min
提取，方法同 1． 3． 4． 1．
1． 3． 5 均匀设计试验
为了优化提取工艺，在单因素试验的基础上确定均匀设计试验的因素和水平，［17］选用 U5(5
4)均匀设
计表进行试验方案设计，本均匀设计试验为 4 因素 5 水平，见表 1，具体试验方案见表 2．
1． 3． 6 抑菌研究
提取液制成浸膏后用蒸馏水溶解，用蒸馏水定容到 40mL为原液，并分别做 2 倍、4 倍、8 倍、16 倍稀释
液，不同稀释倍数的提取液经过过滤灭菌后分别浸泡滤纸片，直径为 5mm，无菌水浸泡滤纸片对照．每个
培养皿分别放三片，其中一片为对照，另两片为用提取液浸泡．菌种分别用细菌、酵母菌菌种 1． 1 中已述，
每个菌种每个稀释下做三次重复．酵母菌 28℃、土壤细菌 37℃培养箱中培养．不定时观察生长状态，记录
现象、照相，统计．
2 结果与分析
2． 1 波长扫描结果
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草木犀黄酮提取工艺优化及抑菌活性研究
表 1 均匀设计试验因素与水平表
水平
编号
因 素
超声时间(min)
A
超声温度(℃)
B
乙醇浓度(%)
C
料液比
D
1 10 30 40 1:10
2 15 40 50 1:15
3 20 50 60 1:20
4 25 60 70 1:25
5 30 70 80 1:30
表 2 U5(5
4)均匀设计试验设计方案
试验号 A B C D
1 1 2 3 4
2 2 4 1 3
3 3 1 4 2
4 4 3 2 1
5 5 5 5 5
扫波长的结果见图 1．
图 1 波长扫描结果
根据图 1 可看出芦丁标品在此波长为 424nm下吸光值最大，选 λ424nm为测定黄酮含量的波长．
2． 2 标准曲线
由芦丁标准曲线的方程，芦丁浓度 C = 0． 2915A424 + 0． 0006 (mg /mL) ，R = 0． 9997，表明 C 与 A424线
性关系良好，方程可用．
2． 3 单因子试验黄酮含量的测定结果
2． 3． 1 料液比试验黄酮含量的测定结果
在 424nm下测吸光值，结果见图 3．
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图 2 标准曲线
图 3 料液比对提取率的影响
根据图 3 可以看出提取率随溶剂量的增加而增加，在料液比为 1:20 时吸光值最大为 0． 902，提取的
黄酮含量最多，在此以后，吸光值明显下降．可能是因为提取剂的体积过大，导致旋转蒸发的时间过长，致
使部分黄酮流失．
2． 3． 2 超声时间试验黄酮含量的测定结果
在 λ424nm下测吸光值，结果见图 4．
图 4 超声时间对提取率的影响
根据图 4 可以看出提取率随超声时间的延长而增加，在超声时间为 20min 时吸光值最大为 0． 875，此
时的黄酮提取率最大，在此之后，随时间的增加提取率降低．
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草木犀黄酮提取工艺优化及抑菌活性研究
2． 3． 3 乙醇浓度试验黄酮含量的测定结果
在 λ424nm下测吸光值，结果见图 5．
图 5 乙醇浓度对提取率的影响
根据图 5 可以看出随着乙醇浓度的增高黄酮的提取率不断升高．一方面可能是因为乙醇和黄酮都是
有机物质，根据相似相溶原理乙醇浓度越高，黄酮越易溶解，另一方面可能是因为草木犀中含有大量的色
素，虽然用石油醚浸泡过也不能完全除去，所以随着乙醇浓度的增加也会有部分色素溶出而对吸光值有一
定影响．
2． 3． 4 超声温度试验黄酮含量的测定结果
在 λ424nm下测吸光值，结果见图 6．
图 6 超声温度对提取率的影响
根据图 6 可以看出随着超声温度的提高吸光值不断增大．可能是因为部分黄酮是水溶性的，当温度不
断升高，水分子变得也越来越活跃，从而使黄酮更容易从样品中溶出．
2． 4 均匀设计试验黄酮含量的测定结果
在 λ424nm下测吸光值，结果见表 3．
根据 DPS软件得出回归方程:Y = 0． 2688 + 0． 0197X1 － 0． 0037X2 + 0． 6245X3，相关系数 R = 0． 9910
(X1:超声时间、X2:超声温度、X3:乙醇浓度、X4:料液比)
根据方程得出料液比和超声温度对试验的影响不显著，料液比的影响最不显著，超声时间和乙醇浓度
对试验影响相对乙醇浓度影响更明显一些．所以可以确定最优方案为超声时间 30min、超声温度 30 ℃、乙
醇浓度 80%、料液比 1:10，与单因素趋势一致．通过验证试验可获得吸光值为 A424为 1． 211，获得黄酮得率
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为为 0． 884g·kg －1 ．
表 3 U5(5
4)均匀设计试验设计方案及结果
试验号 A B C D 吸光值 A424
1 1 2 3 4 0． 666
2 2 4 1 3 0． 623
3 3 1 4 2 1． 019
4 4 3 2 1 0． 863
5 5 5 5 5 1． 104
2． 5 抑菌试验结果
通过观察发现随着草木犀黄酮提取液浓度的增加酵母菌菌落的直径不断增大，说明草木犀黄酮提取
液对酵母菌的生长具有促进作用;随着草木犀黄酮提取液浓度的增加细菌抑菌圈有一定的增大，说明草木
犀黄酮提取液对细菌有明显的抑制作用，机理有待于进一步研究．
图 7 稀释液对酵母菌生长情况 (从左到右依次为 4、8、16 倍稀释液)
图 8 稀释液对酵母菌生长情况(A，B，C 分 4、8、16 倍稀释液)
3 结论
采用超声波辅助技术提取草木犀中的黄酮，考察了料液比、超声时间、乙醇浓度、超声温度四个因素对
黄酮提取率的影响，并采用 U5(5
4)均匀设计试验对结果进行优化获得了提取草木犀黄酮的最佳提取工艺
条件:料液比 1:10(g·mL －1)、超声时间 30min、乙醇浓度 80%、超声温度 30℃，并得出影响超声提取草木
犀黄酮的各因素主次顺序为乙醇浓度 ＞超声时间 ＞超声温度 ＞料液比，黄酮得率为为 0． 884 g·kg －1 ．抑
菌试验表明黄酮类化合物对土壤细菌具有一定的抑菌作用，对酵母菌具有促进作用．
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草木犀黄酮提取工艺优化及抑菌活性研究
参考文献:
［1］高作民，朱全军．草木犀的栽培要素［J］．黑河科技，2003( 2) : 10 － 11．
［2］江苏新医学院编．中药大辞典［M］．上海:上海人民出版社，1977: 2519，2520．
［3］Plesca － Manea，Luminita; Parvu，Alina Elena; Parvu，M． ; Taamas，M． ; Buia，R． ; Puia，M． Effects of Melilotus officinalis on acute inflammation
［J］． Phytotherapy Research． 2002，16( 4) : 316 － 319．
［4］李静，何明三．黄花草木犀香豆素和黄酮类化合物成分研究［D］．武汉:湖北中医学院，2007．
［5］曹纬国，刘志勤，邵云等．黄酮类化合物药理作用的研究进展［J］．西北植物学报，2003，23( 12) : 2241 － 2247．
［6］陈扬，闫洪印，李振宁．草木犀流浸液治疗外科损伤性肿胀的临床应用［J］．广州医药，2002，33( 6) : 24 － 26．
［7］延玺，刘会青，邹永青等．黄酮类化合物生理活性及合成研究进展［J］．有机化学，2008，28( 9) : 1534 － 1544．
［8］Saija，A，Scalese，M，Lanza，M，Marzullo，D，Bonina，F，Castelli，F． Free Radical Biol． Med［J］． 1995: 19，481．
［9］马丽．浅谈草木樨的综合利用［J］．新疆畜牧业，2005( 4) : 56 － 57．
［10］陈连管．香料用草木樨及浸膏的开发利用研究［J］．北京日化，1996( 1) : 20 － 23．
［11］王清连．植物组织培养［M］．北京: 中国农业出版社，1998: 186 － 199．
［12］四川成都市园林局．花卉植物组培进展［Z］． 2001: 69 － 76．
［13］刘庆忠．提高草木犀转化效率的研究［J］．果树科学，2000，17( 3) : 159 － 163．
［14］［16］周德庆主编．微生物学试验教程［M］．北京: 高等教育出版社，2006．
［15］李艳提，赵金凤，张卫明，等．罗布麻茶总黄酮含量测定方法研究［J］．食品科技，2010，35( 6) : 274 － 277．
［17］方开泰．均匀设计与均匀设计表［M］．北京:科学出版社，1994: 149．
A Study of Extraction Process Optimization and
Bacteriostatic Activity on Melilotus Suavcolen Flavone
CONG Jian － min，CHEN Feng － qing，SUN Chun － ling，WANG Xue，
YAO Na，WANG Guo － qiang，WANG Xiang
(College of Life Science，Baicheng Normal University，Baicheng 137000，China)
Abstract:Using ultrasonic wave assisted technic to study the optimal conditions of flavones extraction from
Melilotus Suavcolens and its bacteriostatic effects． Adapting spectrophotometry to do an assaying on flavonoid
compounds，by single factor experiment，uniform design to inspect feed liquid ratio，ultraphonic time，ethanol
concentration，the influence of ultraphonic temperature upon flavonoid compounds extraction efficiency from Me-
liloutus suavcolen． The results showed that:the factors mentioned above affected flavonoid compounds extraction
at different levels，in descending order which was ethanol concentration，ultraphonic time，ultraphonic tempera-
ture，and feed liquid ratio． The best technic would be determined by the ration of 1:10(g·mL －1) ，ultraphonic
time was 30min，ethanol concentration was 80%，ultraphonic temperature was 30 ℃，the rough flavone ratio
was0． 884g·kg． And it was found that flavonoid compounds played a bacteriostatis role in soil bacteria and it
promoted the role of saccharomycetes by filter paper test．
Key Words:Melilotus Suaveclens;flavonoids;ultrasonic extraction;bacteriostatic effects
责任编辑:王丽萍
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