全 文 ：书·基础研究·
狼毒大戟石油醚提取物对小鼠肝脏细胞凋亡及 p- EＲK、Bcl - 2、Bax、
半胱氨酸蛋白酶-3 的影响
蔡珍珍 金 铭1 杨盼盼 刘吉成1 (齐齐哈尔医学院精神卫生学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)
〔摘 要〕 目的 探讨狼毒大戟石油醚提取物对小鼠肝脏细胞凋亡及磷酸化细胞外信号调节激酶(p-EＲK)、Bcl-2、Bax、半胱氨酸蛋白酶
(Caspase)-3 表达的影响。方法 80 只昆明种小白鼠随机分为低剂量组、中剂量组、高剂量组和植物油对照组，每组 20 只。采用腹腔注射法给药，
1 次 /d(0. 39、0. 78、1. 55 mg·kg-1·d-1)。于实验第 14 天分别进行体重测量，对小鼠肝脏组织进行 HE染色，TUNEL法原位标记凋亡细胞，采用免疫
组织化学染色检测 Bcl-2、Bax蛋白表达，Western印迹法检测 p-EＲK、Caspase-3 蛋白表达。实时定量 PCＲ 对 Bcl-2、Bax、Caspase-3 进行定量分析。结
果 与植物油对照组比较，高剂量组小鼠体重明显下降，肝脏细胞发生明显凋亡，p-EＲK、Bcl-2 表达下调，Bax表达上调(P ＜ 0. 05)，Caspase-3 产生活
化形式的 Cleaved-Caspase-3。结论 狼毒大戟石油醚提取物可使小鼠肝脏细胞发生凋亡，其机制可能与降低 p-EＲK、Bcl-2，增强 Bax 蛋白表达，并使
Caspase-3 产生活化形式的 Cleaved-Caspase-3 有关。
〔关键词〕 狼毒大戟;凋亡;Bcl-2
〔中图分类号〕 Ｒ285 〔文献标识码〕 A 〔文章编号〕 1005-9202(2016)01-0001-05;doi:10. 3969 / j. issn. 1005-9202. 2016. 01. 001
基金项目:国家自然科学基金项目(81573660)
1 齐齐哈尔医学院医药科学研究院多基因病研究所
通讯作者:刘吉成(1958-)，男，教授，博士生导师，主要从事抗肿瘤药物
研究。
第一作者:蔡珍珍(1982-)，女，硕士，助理研究员，主要从事抗肿瘤、抗
抑郁药物研究。
Effect of petroleum ether extracts of Euphorbia fischeriana on the liver cell apoptosis and the expression of p-EＲK，Bcl-2，Bax and
Caspase-3 in mice
CAI Zhen-Zhen，JIN Ming，YANG Pan-Pan，et al.
Institute Mental Health，Qiqihaer Medical College，Qiqihaer 161006，Heilongjiang，China
【Abstract】 Objective To investigate the effect of petroleum ether extracts of Euphorbia fischeriana on the liver cells apoptosis in
mice and the expressions of phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase (p-EＲK)，Bcl-2，Bax，Caspase-3 in the liver of mice．
Methods Eighty Kunming mice were randomly divided into low dose，middle dose，high dose and the control groups with vegetable oil
(0． 39，0． 78，1． 55 mg·kg －1·d －1)，20 in each group． Model was made by intraperitoneal injection 1 time /day． In the experiment of 14
days，weight was measured，HE dyeing was used to detect liver pathologic morphology，TUNEL was used to detect liver cell apoptosis． Bcl-
2 and Bax protein expression were tested by immunohistochemical staining method． The protein expressions of p-EＲK and Caspase-3 were de-
tected by western blot． Ｒeal-time PCＲ was used for quantitative analysis of Bcl-2，Bax and Caspase-3． Ｒesults Compared with the control
group，the weights were decreased significantly，liver cell apoptosis was more obvious，the protein expressions of p-EＲK and Bcl-2 were de-
creased while Bax were increased，the protein expressions of Caspase-3 was activated to Cleaved-Caspase-3 in high dose group(P ＜ 0． 05)．
Conclusions Petroleum ether extracts of Euphorbia fischeriana could result in apoptosis of liver cells in mice． The mechanism may be relat-
ed to reduce p-EＲK and Bcl-2，enhance Bax protein expression，and produce activated Caspase-3 forms of Cleaved-Caspase-3．
【Key words】 Euphorbia fischeriana;Apoptosis;Bcl-2
狼毒大戟是大戟科植物，文献报道称，狼毒大戟可用于治
疗肝癌、肺癌、胃癌等恶性肿瘤，对结核杆菌也有较好的抑制作
用〔1〕，临床疗效显著，并未发现对心、肝、肾等系统的不良反应。
本实验使用狼毒大戟石油醚提取物，对昆明种小鼠进行体内试
验，发现其对小鼠肝脏具有一定的毒性。
1 材料与方法
1. 1 动物、药品、试剂及仪器 近郊系昆明种小白鼠，雄性，清
洁级，体重(20 ± 2)g，由吉林大学实验动物中心提供。狼毒大
戟石油醚提取物，由齐齐哈尔医学院药物研究所提供，使用植
物油将药物配制成所需浓度，过滤备用。免疫组化染色:一抗
(康为生物有限公司，兔抗小鼠 Bax单克隆抗体，兔抗小鼠 Bcl-
2 单克隆抗体)免疫组化 SP 试剂盒、DAB 显色剂、PBS 缓冲液
(购于康为生物有限公司)。逆转录试剂盒 SYBＲ  Ex-
ScriptTM ＲT-PCＲ Kit(Pefect Ｒeal Time)、PCＲ 试剂盒 ＲNAiso
Ｒeagent(购于宝生物工程有限公司)。Western 印迹:一抗(北
京中杉金桥生物技术有限公司，兔单克隆抗体 EＲK、半胱氨酸
蛋白酶(Caspase)-3。PCＲ System 扩增仪 2700(Applied Biosys-
tems公司)，荧光定量 PCＲ仪 ABI 7300(ABI 公司)。光学显微
镜 CX31Ｒ BSF(Olympus)，图像分析系统 DP801(Alphamiager
公司)，DK-8D型电热恒温水浴箱(上海合恒仪器设备有限公
司)，METTLEＲ TOLEDO PH测试仪(上海秋腾贸易有限公司)，
79-1 磁力加热搅拌器(上海雷磁新泾仪器有限公司)，THZ-82
型恒温振荡器(江苏太仓医疗器械厂)，AL204 电子分析天平
(梅特勒-托利多仪器有限公司)，HL-2000 电子杂交箱〔香港兴
·1·蔡珍珍等 狼毒大戟石油醚提取物对小鼠肝脏细胞凋亡及 p-EＲK、Bcl-2、Bax、半胱氨酸蛋白酶-3 的影响 第 1 期
万电子仪器(厦门)有限公司〕，SF-300 型手压式封口机(海旗
荣实业有限公司) ，24DN 制胶器(北京市六一仪器厂) ，TS-100
脱色摇床(南京庚辰科学仪器有限公司)。
1. 2 方法
1. 2. 1 动物分组 近郊系昆明种小白鼠 80 只，实验开始前进
行适应性喂养，保持环境安静，温度保持在 18 ～ 20℃，自然光
线，实验小鼠未发现有孕，状态良好。随机分为四组:植物油对
照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组 20 只。
1. 2. 2 给药 参照文献〔2〕LD50 测定值，给予腹腔注射，低、
中、高剂量组给药量分别为 0. 39、0. 78、1. 55 mg·kg-1·d-1，植
物油对照组给予等体积植物油。连续注射 14 d，不禁食水，末
次给药后禁食 16 ～ 20 h，断颈处死小鼠，取肝脏组织置于冰生
理盐水中充分洗涤，滤纸吸干，称取肝组织备用。
1. 2. 3 TUNEL法检测小鼠肝脏组织凋亡 石蜡包埋的肝脏组
织，采用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT 酶)介导的带荧光的
dUTP缺口末端标记法检测。根据凋亡阳性细胞分布情况，每
张切片取 10 个阳性视野，每个视野以 30 个细胞中阳性细胞数
来计数，平均阳性细胞所占百分比，即细胞凋亡率(AＲ)。
1. 2. 4 免疫组织化学法检测 Bcl-2、Bax 取石蜡包埋的肝脏组
织，相应部位连续切片各 5 张，采用过氧化物酶标记的链霉卵
白素(SP)法进行免疫组织化学染色，并 DAB显色，通过苏木素
复染、水洗、盐酸乙醇分化后返蓝，常规脱水、透明、中性树胶封
片。每一张切片在阳性表达区域挑选 10 个无重叠视野，使用
Olympus显微镜、DP801 形态分析软件进行图像采集处理，图像
分析仪进行分析，测出 Bcl-2、Bax蛋白抗原表达的总面积、阳性
细胞数和平均吸光度 A，计算其积分吸光度(IA)。
1. 2. 5 Western印迹法检测磷酸化细胞外信号调节激酶(p-
EＲK)、Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表达 按每泳道加入总蛋白
4 μg进行 SDS-PAGE凝胶电泳，目标蛋白转移至硝酸纤维素滤
膜上，4℃封闭过夜，加入一抗 p-EＲK、Bcl-2、Bax、Caspase-3，温
箱孵育 2 h，漂洗后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗
1∶ 5 000，经过 ECL化学发光剂曝光显影，每组实验重复三次，
结果使用 Gel-Pro4 软件进行半定量分析，计算相对光密度值。
1. 2. 6 检测 Bcl-2、Bax、Caspase-3 基因的表达 取冻存肝脏组
织 4℃解冻以后，放入 DEPC 处理的 EP 管中，在低温冰块上将
其剪碎，加入 1 ml Trizol 液体进行组织匀浆。提取总 ＲNA:按
照 ＲNAiso Ｒeagent 试剂盒提取小鼠肝脏组织总 ＲNA，通过紫外
分光光度计以及琼脂糖凝胶电泳检测总 ＲNA 的纯度、浓度及
其完整性。逆转录反应:按照 SYBＲ  ExScriptTM实时定量
PCＲ Kit 反转录试剂盒操作方法进行实验:反转录反应 42℃，
15 min，反转录酶失活反应 95℃，2 min。PCＲ 反应:采用 SYBＲ
Premix Ex Taq(Perfect Ｒeal Time)kit 试剂盒相应反应体系，总
体积为 25 μl。引物的序列如下:Bcl-2 正义链:5-AAGCA-
CATCCAATAAAAGCGC-3，Bcl-2，反 义 链:5-GTTATCATAC-
CCTGTTCTCCCG-3，Bax 正义链:5-GAGACACCTGAGCTGAC-
CTTG-3，Bax 反 义 链:5-GAAGTTGCCATCAGCAAACAT-3，
Caspase-3， 反 义 链: 5-AAGGAGCAGCTTTGTGTGTGT-3，
Caspase-3，反义链:5-AAGAGTTTCGGCTTTCCAGTC-3;GAPDH
正义链:5-GACAATTTTGGCATCGTG-3，GAPDH 反义链:5-
ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3。分别扩增 Bcl-2、Bax、Caspase-
3和 GAPDH，每个样本做 3 个复孔，得到阈循环值(Ct)平均值，
计算 ΔΔCt值，各个样本 mＲNA表达水平均以 2-ΔΔCT表示。
1. 3 统计学方法 运用 SPSS13. 0 软件包行单因素方差分析，
两两比较采用 LSD检验。
2 结 果
2. 1 肝脏细胞凋亡计数 见图 1。经过 TUNEL染色以及苏木
精复染以后，凋亡细胞呈现棕褐色，正常细胞核呈现蓝染。植
图 1 小鼠肝脏细胞 TUNEL检测(×100)
·2· 中国老年学杂志 2016 年 1 月第 36 卷
物油对照组仅可见极少数散在的凋亡细胞，高剂量组凋亡细胞
数明显增加。
2. 2 肝脏组织中 Bcl-2、Bax蛋白表达 如图 2，图 3 所示，Bcl-
2、Bax主要表达于细胞质，经图像分析系统分析测得的(IA)值
图 2 小鼠肝脏组织中 Bcl-2 蛋白表达(DAB，×100)
图 3 小鼠肝脏组织中 Bax蛋白表达(DAB，×100)
Bcl-2 表达随给药剂量增加而降低，Bax 与 Bcl-2 的表达呈相反
状态，差异有统计学意义(P ＜ 0. 05) ，但低、中剂量组间无差异
(P ＞ 0. 05)。
2. 3 各组小鼠肝脏组织中 p-EＲK、Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表
达 小鼠肝脏组织中的 p-EＲK 蛋白随剂量增加表达降低(P ＜
0. 05) ，Bcl-2 蛋白低剂量组变化不明显，中、高剂量组 Bcl-2 蛋
白表达明显降低(P ＜ 0. 05) ，Bax 蛋白低剂量组变化不明显，
中、高剂量组表达明显增高(P ＜ 0. 05) ，该提取物可以使
Caspase-3 活化，产生活性形式的 Cleaved Caspase-3，低剂量时不
促进 Caspase-3 及活化的 Caspase-3 蛋白表达，中、高剂量组
Caspase-3 及活化的 Cleaved Caspase-3 蛋白均增高(P ＜ 0. 05)。
见图 4。
2. 4 小鼠肝脏组织中 Bcl-2、Bax 和 Caspase-3 mＲNA 含量 与
植物油对照组相比，高剂量组中 Bcl-2 明显下调，而 Bax 明显上
调(P ＜ 0. 05) ，并呈剂量依赖关系，随剂量增高 Bax /Bcl-2 比值
增大。Caspase-3 随剂量增加而呈上调趋势。见表 1 ～表 3。
1 ～ 4:植物油对照组、低、中、高剂量组
图 4 小鼠肝脏组织中凋亡相关蛋白检测
表 1 小鼠肝脏细胞 Bcl-2 mＲNA表达(x ± s，n =6)
组别 CTBcl-2 CTGAPDH ΔCTBcl-2 ΔCTGAPDH ΔΔCT Bcl-2 相对表达量
植物油对照组 17. 21 ± 0. 31 15. 12 ± 0. 12 － 17. 29 ± 0. 16 － 17. 78 ± 0. 12 0. 49 ± 0. 05 0. 71
低剂量组 17. 35 ± 0. 23 15. 09 ± 0. 05 － 17. 35 ± 0. 21 － 17. 81 ± 0. 13 0. 66 ± 0. 10 0. 63
中剂量组 18. 11 ± 0. 21 15. 04 ± 0. 09 － 16. 39 ± 0. 19 － 17. 86 ± 0. 09 1. 47 ± 0. 10 0. 362)
高剂量组 18. 96 ± 0. 33 15. 11 ± 0. 11 － 15. 54 ± 0. 24 17. 79 ± 0. 11 2. 25 ± 0. 12 0. 211)2)
与植物油对照组比较:1)P ＜ 0. 05;与前一剂量组比较:2)P ＜ 0. 05，下表同
表 2 小鼠肝脏细胞 Bax mＲNA表达(x ± s，n =6)
组别 CTBax CTGAPDH ΔCTBax ΔCTGAPDH ΔΔCT Bax相对表达量
植物油对照组 19. 65 ± 0. 30 15. 12 ± 0. 12 － 14. 85 ± 0. 21 － 17. 78 ± 0. 12 2. 93 ± 0. 10 0. 13
低剂量组 18. 32 ± 0. 22 15. 09 ± 0. 05 － 16. 18 ± 0. 19 － 17. 81 ± 0. 13 1. 63 ± 0. 08 0. 32
中剂量组 17. 91 ± 0. 27 15. 04 ± 0. 09 － 16. 59 ± 0. 30 － 17. 86 ± 0. 19 1. 27 ± 0. 10 0. 412)
高剂量组 17. 54 ± 019 15. 11 ± 0. 11 － 16. 96 ± 0. 28 17. 79 ± 0. 11 0. 83 ± 0. 15 0. 561)2)
·3·蔡珍珍等 狼毒大戟石油醚提取物对小鼠肝脏细胞凋亡及 p-EＲK、Bcl-2、Bax、半胱氨酸蛋白酶-3 的影响 第 1 期
表 3 小鼠肝脏细胞 Caspase-3 mＲNA表达(x ± s，n =6)
组别 CTCaspase-3 CTGAPDH ΔCTCaspase-3 ΔCTGAPDH ΔΔCT Caspase-3 相对表达量
植物油对照组 19. 89 ± 0. 23 15. 12 ± 0. 12 － 14. 61 ± 0. 15 － 17. 78 ± 0. 12 3. 17 ± 0. 05 0. 11
低剂量组 19. 32 ± 0. 15 15. 09 ± 0. 05 － 15. 18 ± 0. 24 － 17. 81 ± 0. 13 2. 63 ± 0. 10 0. 16
中剂量组 17. 66 ± 0. 21 15. 04 ± 0. 09 － 16. 84 ± 0. 30 － 17. 86 ± 0. 19 1. 02 ± 0. 11 0. 492)
高剂量组 17. 54 ± 0. 12 15. 11 ± 0. 11 － 16. 96 ± 0. 28 17. 79 ± 0. 11 0. 83 ± 0. 16 0. 561)2)
3 讨 论
狼毒大戟是一种有毒中药，近年来许多学者都在其抗肿
瘤、抗炎等方面进行了大量的研究，并且取得了实质性的进展。
其原植物的水、醇、石油醚等的提取物均有抑制肿瘤发展的作
用，报道称其为高效低毒的药品，但本实验发现，其石油醚提取
物对小鼠肝脏具有一定的毒性，解剖可见，肝脏大小无明显变
化，质地柔软，无粘连，色泽光亮。显微镜下观察肝脏组织变化
不明显。随着给药时间和剂量的增加，部分肝小叶内可见细胞
核消失，细胞质成深红浓染的嗜酸性小体。个别高剂量小组的
小鼠状态仍然良好。TUNEL法检测的小鼠肝脏细胞，发现高剂
量组中肝脏细胞发生明显凋亡。
细胞的凋亡发生、发展，受到细胞内凋亡调节蛋白的调控
与影响，细胞内凋亡调节蛋白分为促凋亡蛋白与抗凋亡蛋白两
类，细胞是否发生凋亡取决于两种蛋白相互拮抗失衡的状态。
目前已知的凋亡调节蛋白中，Bcl-2 家族在各类刺激信号引发的
凋亡中起到关键的作用〔3，4〕。在细胞线粒体上的 Bcl-2 与 Bax
蛋白水平的高低直接关系到细胞凋亡的发生，Bax 促进细胞凋
亡发生，Bcl-2 抑制凋亡。于是有人提出细胞在受到刺激后所表
现的的生存能力由 Bcl-2 与 Bax 两者的比率决定〔5，6〕，Bcl-2 表
达水平较高时，比率上调，可形成 Bcl-2 /Bax 的异二聚体，抑制
细胞凋亡;Bax表达水平较高时，比率下调，形成 Bax /Bax 同二
聚体，促进细胞凋亡〔6〕。近年来，许多机构的研究表明细胞凋
亡的内在变化有一定的规律〔7 ～ 10〕。
目前在人类已鉴定了 4 条 MAPK途径:细胞外信号调节蛋
白激酶(EＲK)途径，C-Jun 基末端激酶(JNK)/应激活化蛋白
(SAPK)途径，EＲK5 /大丝裂素活化蛋白激酶 1(BMK1)途径和
p38 MAPK(p38 MAPK)传导途径〔11〕。其中 EＲK通路主要被分
裂原激活，如生长因子与受体结合后，能激活小 G 蛋白 Ｒas，进
而激活 Ｒaf→MEK→EＲK 通路。Ketam 等〔12，13〕认为，抑制 P38
通路的同时可以加强 EＲK的激活，导致细胞凋亡发生延迟。该
实验中，p-EＲK蛋白的表达随剂量的增加而降低，有可能参与
了凋亡反应的调控。
Caspase是哺乳动物细胞发生凋亡的启动、执行者〔14〕，其中
Caspase-3 是该酶家族级联下游最关键的凋亡调节蛋白酶，Bcl-2
通过干扰细胞色素 C的释放进而阻断上游 Caspase蛋白酶的激
活，从而抑制细胞凋亡的发生〔15〕。Bax作为线粒体膜上离子离
子通道的组成部分，使得细胞色素 C得以顺利穿过线粒体膜而
激活 Caspase-9 蛋白，进一步激活 Caspase-3，最终引起细胞
凋亡。
本实验结果证明，狼毒大戟石油醚提取物对小鼠的肝脏细
胞产生一定的毒性，随着给药剂量的增加，小鼠肝脏组织发生
病理改变，从分子层面上讲，Caspase-3、Bax 蛋白表达逐渐的增
加，说明狼毒大戟石油醚提取物直接或者间接通过别的信号途
径激活了 Caspase-3、Bax，并使 Bax /Bcl-2 比率下调，细胞凋亡明
显增多，这一结果与 TUNEL 的检验结果相一致。其毒性作用
机制可能是通过 EＲK 通路调节线粒体上的 Bcl-2、Bax 蛋白的
表达，最终活化 Caspase-3，启动凋亡程序。
狼毒大戟是一种近年来研究较多的抗炎、抗肿瘤药物，通
过该实验证实了，其存在一定的毒性，但是就其当下对抗肿瘤
的效果来说，期待能够通过药物配伍达到提高抗炎、抗肿瘤，并
成功减毒的效果。使其在发挥新的药物功能的同时更好地服
务于医疗卫生事业。
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〔2014-09-19 修回〕
(编辑 安冉冉 /曹梦园)
缺氧预处理对老年大鼠运动性骨骼肌损伤的作用及机制
邓文骞 王 璐 (成都体育学院运动医学系，四川 成都 610041)
〔摘 要〕 目的 了解缺氧预处理对老年大鼠运动性骨骼肌损伤发生发展的影响。方法 将老年雌性 SD大鼠随机分为对照组(CON)组、大
强度离心跑台运动组(EE)组、缺氧预处理 +离心跑台运动组(HCP)组，4 月龄大鼠作为成年对照组(ADU)组。HCP组大鼠进行 1 w 的缺氧预处理。
将 EE组及 HCP组大鼠进行一次性大强度离心跑台运动后处死，测定血清白细胞介素(IL)-6 含量、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)含量，石蜡切
片观察肌纤维细微结构;取肌肉匀浆测超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量。结果 EE 组及 HCP 组大鼠运动后均出现骨骼肌损伤现
象，EE组损伤较 HCP组严重。与 EE组相比，HCP组血清 IL-6、CK及 LDH水平明显降低，比目鱼肌 MDA水平明显降低，SOD活性明显升高。结论
缺氧预处理可提高老年大鼠骨骼肌的抗氧化能力，降低骨骼肌损伤后炎性反应，对运动性骨骼肌损伤有预防作用。
〔关键词〕 运动性骨骼肌损伤;比目鱼肌;缺氧预处理;离心运动
〔中图分类号〕 Ｒ319;Ｒ873 〔文献标识码〕 A 〔文章编号〕 1005-9202(2016)01-0005-03;doi:10. 3969 / j. issn. 1005-9202. 2016. 01. 002
基金项目:国家体育总局重点研究领域项目(2014B014) ;国家体育总局
运动医学重点实验室资助项目(2013CTYY02) ;四川省教育
厅资助科研项目(12ZB014) ;四川省高校科研创新团队专项
基金资助项目(KYTD201011)
第一作者:邓文骞(1982-) ，男，博士，副教授，硕士生导师，主要从事运
动疲劳及运动损伤的防治研究。
运动性肌肉损伤(EIMD)是指机体从事不习惯高强度和或
长时间运动后发生的骨骼肌纤维微细损伤〔1〕。导致 EIMD 的
原因之一可能是剧烈运动导致机体的氧化应激反应增加，通过
增加机体抗氧化能力能够减少 EIMD 的发生〔2〕。而老年人随
着年龄的增加，机体抗氧化能力逐渐下降，发生 EIMD 的风险
也在逐渐增加，如何有效预防 EIMD 的发生，减少运动锻炼带
来的负面影响，成为老年运动医学的研究热点。近年来的研究
发现，预先短暂的缺血或轻度缺氧可激发机体内源性保护机
制，对随后的严重缺血、缺氧具有预防和保护作用，其机制可能
是缺血 /缺氧预处理调动了机体内源性抗损伤机制，使机体对
缺血、缺氧损伤发生主动性适应反应〔3，4〕。本研究旨在了解缺
氧预处理能否对老年大鼠运动性骨骼肌损伤的发生有预防作
用，并对其可能的机制进行初步探讨。
1 材料与方法
1. 1 实验动物与模型 60 只(22 ± 1)月龄雌性 SPF 级 SD 大
鼠，体重(523 ± 38)g，6 只 4 月龄雌性 SPF 级 SD 大鼠，体重
(318 ± 24)g，购自四川大学华西医学中心实验动物中心，生产
许可证编号:SCXK(川)2009-09;使用许可证编号:SYXK(川)
2009-045，动物批号:20100801、20120203。4 月龄为成年对照组
(ADU组) ，不进行任何处理。将(22 ± 1)月龄大鼠按体重配对
原则随机分为对照组(CON 组)、大强度离心跑台运动组(EE
组)、缺氧预处理 +离心跑台运动组(HCP组)3 组，每组 20 只。
适应性喂养 1 w后开始将 HCP 组进行缺氧预处理。根据氮气
稀释空气的原理，借用体外循环麻醉中使用的空气 /氧气混合
仪，改装成空气 /氮气混合仪，经 Datex 气体分析监护仪标定浓
度，制成可快速地随意调节氧气浓度和气体流量的供气系统。
调节空气 /氮气混合器使氧浓度为 10%。连续对 HCP 组大鼠
进行 7 d的缺氧预处理。具体的处理是每天用 10%氧浓度处
理大鼠 30 min后以空气复氧 5 min，连续处理 5 次。末次预处
理后 EE组和 HCP 组进行一次性大强度下坡跑台运动，速度
19 ～ 21 m /min，坡度为 － 16，运动时间为 90 min。运动中如大
鼠不能坚持运动，取出休息 2 min后继续，运动时间足 90 min。
1. 2 骨骼肌的取材与处理 分别于运动后 24、48 h 2 个时间
点随机选取各组大鼠 10 只股静脉放血处死，离心管收集静脉
血，将血样离心(4℃，3 000 r /min，10 min)分离血清，测定血清
白细胞介素(IL)-6、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)含量;
并迅速取右后肢比目鱼肌，于比目鱼肌中段切取部分肌肉组
织，行多聚甲醛固定，用于制作石蜡切片，HE 染色后观察肌纤
维结构变化;取部分肌肉组织，快速称重，按重量 /体
积(g /ml)= 1∶ 10加入冰冻生理盐水，制备匀浆，4℃低温离心机
4 000 r /min离心 10 min，取上清液用于超氧化物歧化酶(SOD)
活性、丙二醛(MDA)含量的检测。IL-6、CK、LDH、SOD、MDA的
酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒均购于南京建成生物工
程研究所，采用 Thermo Evolution 600 紫外-可见分光光度计在
450 nm波长比色。组织匀浆总蛋白浓度采用武汉博士德公司
BCA蛋白定量试剂盒测定。
1. 3 统计学处理 采用 SPSS17. 0 软件行方差分析。
·5·邓文骞等 缺氧预处理对老年大鼠运动性骨骼肌损伤的作用及机制 第 1 期