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溪黄草提取条件的优化及抑菌活性研究



全 文 :基金项目:四川教育厅川菜发展研究中心科技项目(编号:CC10Z09)
作者简介:叶光斌(1980-),四川理工学院讲师,博士。
Email:guangbin1980@126.com
通讯作者:边名鸿
收稿日期:2013-05-17
第29卷第4期
2 0 1 3年7月
OOD&MACHINERY
食 品 与 机 械
Vol.29,No.4
Jul.2 0 1 3
10.3969/j.issn.1003-5788.2013.04.043
溪黄草提取条件的优化及抑菌活性研究
Study on extracting process and extracts antibacterial
activity of Ra b dosia serra Hara
叶光斌1,2
YE Guang-bin
 
边名鸿1,2
BIAN Ming-hong
 
曹新志1
CAO Xin-zhi
 
王 毅1,2
WANG Yi
 
刘 绪2,3
LIU Xu
 
杨晓东1,2
YANG Xiao-dong
(1.四川理工学院生物工程学院,四川 自贡 643000;2.酿酒生物技术及应用四川省重点实验室,
四川 自贡 643000;3.四川省食品发酵工业研究设计院,四川 成都 611130)
(1.College of Bioengineering,Sichuan University of Science &Engineering,Zigong,Sichuan,643000,China;
2.Liquor Making Bio-Technology &Application of Key Laboratory of Sichuan Province,Zigong,Sichuan,643000,
China;3.Sichuan Food Fermentation Industry Research &Design Institute,Chengdu,Sichuan,611130,China)
摘要:通过单因素以及正交试验优化溪黄草提取工艺:乙醇
为溪黄草中抑菌物质的优选浸提剂,超声波提取的最佳条件
为70%乙醇,时间25min,料液比1∶30(m∶V)。 同时确定
最佳提取条件下溪黄草提取液对大肠杆菌的最低抑菌浓度
和最低杀菌浓度分别为5.0%和6.2%,对枯草芽孢杆菌的
最低抑菌浓度和最低杀菌浓度分别为4.8%和5.6%。
关键词:溪黄草;提取物;抑菌活性
Abstract:The single-factor experiments and orthogonal experiments
were designed to optimize the extracting conditions of Rabdosia serra
Hara.The results showed:ethanol was the preferred extractant to
extract the antibacterial substances fromRabdosia serra Hara;the
optimum ultrasonic extraction conditions were a 30-fold volume of
70%aqueous ethanol solution at 50℃for 25min.The minimum in-
hibitory concentration(MIC)and minimum bactericidal concentration
(MBC)of Rabdosia serra Hara extracts against E.coli were 5.0%
and 6.2%,respectively.The MIC and MBC of Rabdosia serra Hara
extracts against Bacillus subtilis were 4.8%and 5.6%,respectively.
Keywords:Rabdosia serra(Maxim.)Hara;extraction;antioxidant
activity
溪黄草 (Rabdosin serrae Hara)为唇形科香茶菜属植
物,具有清热利湿、退黄祛湿、凉血散瘀、抗肿瘤、抗菌、抗氧
化、消炎及保护肝脏的作用,已被制成片剂、冲剂等成药,用
于治疗急性黄疸型肝炎、急性胆囊炎、痢疾、肠炎、跌打瘀痛,
多种癌症及其他顽症等,并取得显著疗效[1-4]。溪黄草中广
泛存在贝壳杉烷型二萜类成分及黄酮类物质,二者皆具有很
好的抗菌抑菌作用,但是,前人[5-7]对溪黄草的研究多集中
于医疗保健方面,对其活性物质抑菌防腐及其在食品保鲜方
面的应用研究少有报道。中国具有丰富的天然植物中草药
资源,现如今,研制天然中草药防腐保鲜剂是一个很有潜力
的方向,高效安全而经济实用的天然食品防腐剂成为食品行
业的研究热点[8-10]。本试验研究了不同溶剂及不同提取条
件下获得的溪黄草提取物的抑菌活性,探索提取物对细菌的
抑菌作用,初步了解其抗菌特性,以期为溪黄草提取物在天
然防腐剂方面的应用提供一定的理论与数据支持。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验样品
溪黄草:市场购得;
枯草芽孢杆菌、大肠杆菌:酿酒生物技术及应用四川省
重点实验室保藏。
1.1.2 主要试剂
NaOH、牛肉膏、琼脂粉、NaCl、乙醇、丙三醇、乙酸、乙酸
乙酯、乳酸、丙酮等:分析纯,成都科龙化工试剂厂。
1.1.3 主要仪器与设备
正置生物显微成像系统:55i-Ds-5M-U1型,日本 NI-
KON公司;
全自动高压灭菌锅:MLS-3020型,日本三洋公司;
恒温振荡培养箱:BS-2F型,常州精成国华仪器有限公司;
生化培养箱:MJ-250型,上海和羽良公司;
超净工作台:SW-CJ-1F型,苏净集团;
大容量平衡离心机:TDL-50型,金坛市国旺实验仪器厂;
数控超声波清洗器:KQ5200DB型,昆山市超声波仪器
有限公司。
071
1.2 试验方法
1.2.1 菌悬液的制备
(1)细菌培养基:牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼
脂20g、水1 000mL、pH 7.2~7.4。
(2)在无菌条件下,活化供试菌,并将活化后菌种接种
于液体培养基中摇床培养,37℃,18h。
1.2.2 溪黄草抑菌物质的提取
溪黄草→粉碎,60目过筛→溪黄草粉末→溶剂浸提→离
心、过滤→蒸发浓缩至5mL→提取物[11]
1.2.3 溪黄草中抑菌物质最佳浸提剂的选择 采用蒸馏水
和70%的乙醇水溶液作为浸提剂按照上述方法获得提取物。
在无菌条件下,用移液枪分别吸取各种菌悬液0.5mL均匀
涂布相应培养基上,静置20min。待菌体固定后,用灭菌的
打孔器在平皿上打4个孔,用移液枪分别加入100μL的溪
黄草水提液和醇提液,并以灭菌的蒸馏水作对照,每种提取
物做3种平行。37℃恒温培养18h,比较两种提取液抑菌活
性大小。
1.2.4 溪黄草抑菌物提取单因素试验
(1)提取温度的影响:料液比1∶30(m∶V),超声波处
理25min,功率180W,提取温度分别设定为40,50,60,70,
80℃,研究所得提取物对大肠杆菌及枯草芽孢杆菌的抑菌
效果。
(2)乙醇浓度的影响:料液比1∶30(m∶V),超声处理
25min,功率180W,提取温度为50 ℃,设定乙醇浓度为
40%,50%,60%,70%,80%,90%,研究所得提取物对大肠
杆菌及枯草芽孢杆菌的抑菌效果。
(3)料液比对溪黄草提取物抑菌效果的影响:超声处理
25min,功率180W,提取温度50℃,乙醇浓度70%,分别设
计料液比为1∶10,1∶20,1∶30,1∶40,1∶50(m∶V),研究
所得提取物对大肠杆菌及枯草芽孢杆菌的抑菌效果。
(4)提取时间的影响:料液比1∶30(m∶V),超声处理
25min,功率180W,提取温度50℃,乙醇浓度为70%,设计
不同提取时间为5,15,25,35,45,55min,研究所得提取物对
大肠杆菌及枯草芽孢杆菌的抑菌效果。
1.2.5 溪黄草抑菌物提取正交试验 在单因素试验的基础
上确定正交试验因素及水平,设计正交试验。
1.2.6 最低抑菌浓度(MIC)及最低杀菌浓度(MBC)的测定
(1)枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的最低抑菌浓度测定:将
溪黄草提取物浓缩干燥成粉末,在无菌条件下,配置浓度为
1%,2%,3%,4%,4.6%,4.8%,5.0%,5.2%,5.4%,
5.6%,6%,7%,10%,20%的溪黄草提取物培养基。分别量
取10mL培养基于不同试管中,每管接种100μL菌悬液。
摇匀后于37℃恒温培养箱培养18h,以各个浓度空白稀释
液作对照,将培养后的培养物与空白对照用分光光度计进行
分析。以相同浓度下两者吸光度(OD值)完全相同为准,即
培养基内完全没有细菌生长的浓度作为溪黄草乙醇提取物
溶液的最低抑菌浓度(MIC)[12]。
(2)将提取物浓度高于 MIC(包括 MIC)的各管继续培
养24h,备用。无菌操作下,用灭菌移液管从上述继续培养
的各管中各吸取l mL于灭菌平板上。将冷却至45℃左右
的灭菌营养琼脂培养基倾注入含菌培养皿中,并转动平皿使
其混合均匀,待其冷却凝固后,倒置于37℃恒温培养箱中培
养18h后观察有无菌落生长并加以判断。以无菌落生长的
添加量为该提取物的最低杀菌浓度(MBC)[3]。
2 结果与分析
2.1 溪黄草不同溶剂提取物抑菌活性研究
分别采用70%的乙醇和蒸馏水对溪黄草进行提取,提取
物的抑菌效果见表1。
表1 溪黄草不同溶剂提取物对供试菌的抑菌效果
Table 1 The antibacterial activities of Rabdosia
serra(Maxim.)Haraextracts
抑菌物质
抑菌圈直径/mm
大肠杆菌 枯草芽孢杆菌
醇提物 16.0  19.5
水提物 13.8  14.6
由表1可知:溪黄草蒸馏水提取物和乙醇提取物对2种
供试菌种(革兰氏阳性菌、革兰氏阳性菌)均有抑菌作用,其
中乙醇提取物的抑菌效果更好,可能是由于溪黄草中的抗菌
物质主要为脂溶性的黄酮类物质以及二萜类化合物,更易溶
于有机溶剂中,因此70%的乙醇提取效果好。同时通过测定
抑菌圈的大小可以确定溪黄草提取物对供试菌种的抑菌效
果的强弱顺序为枯草芽孢杆菌>大肠杆菌。
2.2 溪黄草最佳提取单因素试验
2.2.1 提取温度对溪黄草提取物抑菌效果的影响 由图1
可知,随着提取温度的升高,溪黄草中有效成分提取率增大,
因此抑菌圈也相应增大。当温度上升到70℃后抑菌圈反而
缩小,可能是由于温度较高造成有效成分的破坏。因此,最
佳提取温度为50~60℃。





Th
e
di
am
et
er
of
in
hi
bi
tio
n
zo
ne
/m
m
温度
Temperature/℃

20
16
12
8
4
0
70605040 80

枯草芽孢杆菌
大肠杆菌
图1 提取温度对溪黄草提取物抑菌效果的影响
Figure 1 The effect of extraction temperature
onantibacterial activities of Rabdosia
serra(Maxim.)Haraextracts
171
贮藏与保鲜   2013年第4期
2.2.2 乙醇浓度对溪黄草提取物抑菌效果的影响 由图2
可知,随着乙醇浓度增加,提取物的抑菌效果逐渐增强,当乙
醇浓度大于70%以后开始略微下降。说明70%的乙醇水溶
液复合体系,对溪黄草中的抑菌物质(如黄酮类物质)具有良
好的溶解性。





Th
e
di
am
et
er
of
in
hi
bi
tio
n
zo
ne
/m
m
乙醇浓度
The concentration of ethanol/%
20
16
12
8
4
0
70605040 90

枯草芽孢杆菌
大肠杆菌

80
图2 乙醇浓度对溪黄草提取物抑菌效果的影响
Figure 2 The effect of concentration of ethanol on
antibacterial activities of Rabdosia serra
(Maxim.)Haraextracts
2.2.3 料液比对溪黄草提取物抑菌效果的影响 由图3可
知,当料液比为1∶30(m∶V)时抑菌效果最好。当料液比到
1∶30(m∶V)以后抑菌效果没有太大的增加,料液比过大对
提取物浓缩不利,同时也耗费更多的溶剂。





Th
e
di
am
et
er
of
in
hi
bi
tio
n
zo
ne
/m
m
料液比
Solid鄄liquid ratio(m∶V)
20
16
12
8
4
0
1∶40

枯草芽孢杆菌
大肠杆菌

1∶301∶201∶10 1∶50
图3 料液比对溪黄草提取物抑菌效果的影响
Figure 3 The effect of ratio of liquid to material on
antibacterial activities of Rabdosia serra
(Maxim.)Haraextracts
2.2.4 提取时间对溪黄草提取物抑菌效果的影响 由图4
可知,随着提取时间的增加,有利于有效成分的浸出,溪黄草
提取物抑菌效果越好。35min以后抑菌效果略有下降,可能
是提取时间过长会引起抑菌成分的破坏。由图4还可以看
出提取55min与35min抑菌效果差距不大,初步说明溪黄
草种抑菌物质稳定性比较好。考虑到成本问题,提取时间在
15~35min范围内比较好。
2.3 溪黄草最佳提取条件研究
选用超声波辅助提取,设定温度为50℃,功率180W。
根据单因素试验结果,选择乙醇浓度、提取时间及料液比三
因素,设计正交试验,以确定最优提取条件,因素水平设计见
表2,试验结果见表3。





Th
e
di
am
et
er
of
in
hi
bi
tio
n
zo
ne
/m
m
时间
Time/min
20
16
12
8
4
0
35

枯草芽孢杆菌
大肠杆菌
25155 55

45
图4 提取时间对溪黄草提取物抑菌效果的影响
Figure 4 The effect of extraction time on
antibacterial activities of Rabdosia
serra(Maxim.)Haraextracts
表2 因素水平表
Table 2 Factors and level table
水平 A乙醇浓度/% B提取时间/min  C料液比 (m∶V)
1  50  15  1∶10
2  70  25  1∶20
3  90  35  1∶30
表3 正交试验结果
Table 3 The results of orthogonal design
试验

A  B  C

(空列)
枯草芽孢杆菌
抑菌圈直径
D1/mm
大肠杆菌抑
菌圈直径
D2/mm
1  1  1  1  1  14.6  14.6
2  1  2  2  2  17.6  16.0
3  1  3  3  3  14.0  14.6
4  2  1  2  3  16.1  14.9
5  2  2  3  1  19.5  16.7
6  2  3  1  2  14.2  14.7
7  3  1  3  2  15.2  14.0
8  3  2  1  3  16.9  15.3
9  3  3  2  1  15.4  14.6
KD1-1 46.2 45.9 47.0  49.5

KD1-2 49.8 54.0 47.0  47.0
KD1-3 47.5 43.6 49.5  47.0
RD1 3.6 10.4  2.6  2.5 最优A2B2C3
KD2-1 44.7 43.6 44.2  45.9
KD2-2 46.3 48.0 44.7  44.8
KD2-3 43.9 43.3 46.0  44.7
RD2 2.4  4.7  1.8  1.2 最优A2B2C3
271
第29卷第4期 叶光斌等:溪黄草提取条件的优化及抑菌活性研究  
  由表3对于2种供试菌的抑菌试验结果可知,溪黄草中
抑菌物质的最佳提取条件是 A2B2C3,即以70%乙醇作为浸
提剂、超声波提取25min、料液比1∶30(m∶V),此时获得的
提取物对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径为19.5mm,对大肠杆
菌的抑菌圈直径为16.7mm。通过极差R 分析,3种因素对
溪黄草中抑菌物质提取的影响力为时间>乙醇浓度>料
液比。
2.4 低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定
本试验采用了液体比浊法来测定溪黄草提取物对细菌
的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度,结果见表4。
表4 溪黄草醇提液最低抑菌浓度和最低杀菌浓度
Table 4 The minimum inhibition concentration(MIC)
and minimum bactericidal concentration
(MBC)of ethanol-extraction liquid
供试菌种 最低抑菌浓度/% 最低杀菌浓度/%
枯草芽孢杆菌 4.8  5.6
大肠杆菌   5.0  6.2
由表4可知:溪黄草提取物对细菌的最低杀菌浓度均大
于最低抑菌浓度,可见溪黄草的乙醇提取液对大肠杆菌和枯
草芽孢杆菌均具有良好的抑制效果,且在较低浓度时已表现
明显的抑菌作用,且进一步证明溪黄草乙醇提取液对枯草芽
孢杆菌比对大肠杆菌的抑制效果好。综上所述,溪黄草乙醇
提取液对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌皆具有较明显的抑
菌活性。
3 讨论
本试验从研究溪黄草的提取条件以及抑菌活性着手,试
验得知:乙醇为溪黄草中抑菌物质的优选浸提剂;确定了超
声波提取的最佳条件为70%乙醇,时间25min,料液比
1∶30(m∶V);确定了溪黄草提取液对大肠杆菌的最低抑菌
浓度和最低杀菌浓度分别为5.0%和6.2%,对枯草芽孢杆
菌的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度分别为4.8%和5.6%。
试验在选择溪黄草抑菌物质提取的最优工艺条件时,打
破传统,选用了超声波辅助提取方法。此方法较以前的回流
提取有提取率高、提取温度低、提取时间短的独特优势。本
试验选择了大肠杆菌、枯草芽孢杆菌2种典型菌株,证明了
溪黄草提取物具有较为广泛的抑菌活性。但试验选择的菌
种较少,不具有普遍性,在以后的试验中应当对更多菌属进
行试验,尤其是食品工业中的常见致病菌,以进一步了解溪
黄草提取物的抑菌活性,为溪黄草提取物在防腐方面的应用
提供理论与数据支持。
参考文献
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贮藏与保鲜   2013年第4期