全 文 ：中国人兽共患病学报
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ
２０１６，３２ （８）
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－２６９４．２０１６．０８．０１０
头花蓼对幽门螺杆菌粘附定植的影响
张 姝１，罗昭逊２，莫 非１，何 芸１，孙朝琴２，张婉颖１，曹玉巧１，张 岚１
贵州省科技合作计划基金（Ｎｏ．黔科合ＬＨ（２０１５）７４１７号）；贵州省
卫生计生委科学技术基金（Ｎｏ．ｇｚｗｊｋｊ２０１５－１－００３）
２０１４年地方高校国家级大学生创新创业训练计划项目 （Ｎｏ．
２０１４１０６６００１４）和２０１４年贵州省大学生创新创业训练计划项目
（Ｎｏ．２０１４１０６６００１４）联合资助
通讯作者：罗昭逊，Ｅｍａｉｌ：２８６０３３０２３６＠ｑｑ．ｃｏｍ
作者单位：１．贵州医科大学临床检验教研室，贵阳 ５５０００４；
２．贵州医科大学附属医院检验科，贵阳 ５５０００４
摘 要：目的 观察头花蓼水提物对幽门螺杆菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ，Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）粘附定植的影响。方法 采用尿素酶
活性比色法定量检测头花蓼水提物作用前后幽门螺杆菌尿素酶活性的影响；运用半固体布氏琼脂平板法检测不同浓度头花
蓼对幽门螺杆菌鞭毛运动的影响；利用细胞爬片革兰染色观察不同浓度头花蓼作用后幽门螺杆菌在ＧＥＳ－１细胞表面粘附的
变化并计算各组抑制率；采用Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ技术检测头花蓼作用前后相关基因ｕｒｅＢ、ｕｒｅＥ、ｕｒｅＦ、ｆｌａＡ、ｆｌａＢ、ｂａｂＡ、ａｌｐＡ、
ａｌｐＢ的ｍＲＮＡ转录水平。结果 头花蓼水提物对幽门螺杆菌尿素酶活性具有抑制作用，抑制率为４４．９０±０．２８９。头花蓼浓
度为１／２ＭＩＣ、１／４ＭＩＣ、１／８ＭＩＣ分别作用后幽门螺杆菌菌膜晕圈直径显著小于对照组，分别为（５．６７±０．５５）ｍｍ ，（８．５±
０．５０）ｍｍ，（１１．６７±１．５３）ｍｍ，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；不同浓度头花蓼水提物均能抑制细菌粘附胃上皮细胞，各浓度
组与对照组比较，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。头花蓼作用后，与对照组比较，下调了尿素酶结构基因ｕｒｅＢ，尿素酶活性基
因ｕｒｅＥ、ｕｒｅＦ、鞭毛相关基因ｆｌａＢ、ｆｌａＡ以及粘附素基因ｂａｂＡ、ａｌｐＡ、ａｌｐＢｍＲＮＡ的转录水平，差异均具有统计学意义（Ｐ＜
０．０５）。结论 头花蓼对幽门螺杆菌具有明显的抑制作用，是通过抑制幽门螺杆菌尿素酶活性，减缓幽门螺杆菌的鞭毛动力，
影响幽门螺杆菌对胃粘膜上皮细胞的粘附等方面发挥其抑菌作用。
关键词：幽门螺杆菌；头花蓼；尿素酶；鞭毛；粘附；
中图分类号：Ｒ３７８ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－２６９４（２０１６）０８－０７３４－０７
Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍｃａｐｉｔａｔｕｍｏｎ ｔｈｅ ａｄｈｅｒｅｎｃｙ ａｎｄ
ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ
ＺＨＡＮＧ Ｓｈｕ１，ＬＵＯ Ｚｈａｏ－ｘｕｎ２，ＭＯ Ｆｅｉ １，ＨＥ Ｙｕｎ１，ＳＵＮ Ｃｈａｏ－ｑｉｎ２，
ＺＨＡＮＧ Ｗａｎ－ｙｉｎｇ１，ＣＡＯ Ｙｕ－ｑｉａｏ１，ＺＨＡＮＧ Ｌａｎ１
（１．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｇｕｉｙａｎｇ５５０００４，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ５５０００４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｅ ａｉｍｅｄ ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐ．ｃａｐｉｔａｔｕｍｏｎ ａｄｈｅｒｅｎｃｙ ａｎｄ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ．Ｕｒｅａｓｅ ａｃｔｉｖｅ
ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｗｏｕｌｄ ｂｅ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｏ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ ｕｒｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ｂｅｆｏｒｅ ａｎｄ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ
ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐ．ｃａｐｉｔａｔｕｍ；ｓｅｍｉ－ｓｏｌｉｄ Ｂｒｕｃｅｌａ ａｇａｒ ｐｌａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ ｆｌａｇｅｌａｒ ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ
Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ｂｅｆｏｒｅ ａｎｄ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐ．ｃａｐｉｔａｔｕｍ；Ｇｒａｍ’ｓ ｓｔａｉｎ ｏｆ ｃｅｌ ｓｌｉｄｅｓ ｗｏｕｌｄ ｂｅ ｕｔｉｌｉｚｅｄ ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐ．ｃａｐｉｔａｔｕｍａｎｄ Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ｏｎ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｄｈｅｒｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ＧＥＳ－１ｃｅｌｓ ａｎｄ ｃａｌｃｕｌａｔｅ ｔｈｅ
ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｏｆ ａｌ ｇｒｏｕｐｓ；ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｗｏｕｌｄ ｂｅ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ｏｆ
ｕｒｅＥ，ｕｒｅＦ，ｆｌａＡ，ｆｌａｂ，ｂａｂＡ，ａｌｐＡａｎｄ ａｌｐＢｂｅｆｏｒｅ ａｎｄ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐ．ｃａｐｉｔａｔｕｍ．Ｐ．ｃａｐｉｔａｔｕｍｈａｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ
ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｕｒｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｂｅｉｎｇ ４４．９０±０．２８９．Ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐ．ｃａｐｉｔａｔｕｍｗａｓ ｒｅ－
ｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ １／２ＭＩＣ，１／４ＭＩＣ ａｎｄ １／８ＭＩＣ；ａｆｔｅｒ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ ｏｆ Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ｐｅｌｉｃｌｅ ｈａｌｏ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ
ｓｍａｌｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ（５．６７±０．５５）ｍｍ，（８．５±０．５０）ｍｍ ａｎｄ（１１．６７±１．５３）ｍｍ ｗｉｔｈ ｓｔａｔｉｓｔｉ－
ｃａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜０．０５）；ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐ．
ｃａｐｉｔａｔｕｍｃｏｕｌｄ ａｌ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｏ ａｄｈｅｒｅ ｔｏ ｇａｓｔｒｉｃ
ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｓ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐｓ，ａｌ ｃｏｎ－
ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ｗｉｔｈ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜０．０５）．
Ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐ．ｃａｐｉｔａｔｕｍ，ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ
ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｕｒｅａｓｅ ａｃｔｉｖｅ ｇｅｎｅｓ ｕｒｅＥａｎｄ
ｕｒｅＦ，ｆｌａｇｅｌｉｎ ｇｅｎｅｓ ｆｌａｂ ａｎｄ ｆｌａＡ ａｓ ｗｅｌ ａｓ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｇｅｎｅｓ
ｂａｂＡ，ａｌｐＡａｎｄ ａｌｐＢ ｍＲＮＡ ｗａｓ ｒｅｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜０．０５）．Ｉｔ ｃａｍｅ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ｔｈａｔ Ｐ．
４３７
ｃａｐｉｔａｔｕｍｈａｓ ｏｂｖｉｏｕｓ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ，ｗｈｉｃｈ ｅｘｅｒｔｓ ｉｔｓ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｆｆｅｃｔ ｖｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｕｒｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｈ．
ｐｙｌｏｒｉ，ｓｌｏｗｉｎｇ ｄｏｗｎ ｔｈｅ ｆｌａｇｅｌａ ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ａｎｄ ｉｍｐａｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ａｄｈｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ｔｏ ｇａｓｔｒｉｃ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ，Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｃａｐｉｔａｔｕｍ，ｕｒｅａｓｅｓ，ｆｌａｇｅｌａ；ａｄｈｅｒｅｎｃｅ
Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｆｕｎｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｊｏｉｎｔ Ｆｕｎｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｐｌａｎ Ｆｕｎｄ ｉｎ Ｇｕｉｚｈｏｕ
（Ｎｏ．Ｑｉａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ ＬＨ （２０１５）７４１７），ｔｈｅ Ｊｏｉｎｔ Ｆｕｎｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｆｕｎｄ ａｔ Ｓａｎｉｔａｔｉｏｎ ａｎｄ
Ｆａｍｉｌｙ Ｐｌａｎｎｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｇｕｉｚｈｏｕ（Ｎｏ．ｇｚｗｊｋｊ２０１５－１－００３），ｔｈｅ Ｊｏｉｎｔ Ｆｕｎｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｌａｎ Ｐｒｏｊｅｃｔ
ｉｎ Ｇｕｉｙａｎｇ（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ［Ｎｏ．２０１４１００１］）；ｔｈｅ Ｊｏｉｎｔ Ｆｕｎｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ Ｉｎｎｏｖａ－
ｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｎｔｒｅｐｒｅｎｅｕｒｓｈｉｐ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｐｒｏｇｒａｍ ｉｎ ｌｏｃａｌ ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ ｉｎ ２０１４（Ｎｏ．２０１４１０６６００１４）ｔｈｅ Ｊｏｉｎｔ Ｆｕｎｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉ－
ｔｙ Ｓｔｕｄｅｎｔ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｎｔｒｅｐｒｅｎｅｕｒｓｈｉｐ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｐｒｏｇｒａｍ ｉｎ Ｌｏｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ ｉｎ ２０１４（Ｎｏ．２０１４１０６６００１４）
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：Ｌｕｏ Ｚｈａｏｘｕｎ，Ｅｍａｉｌ：２８６０３３０２３６＠ｑｑ．ｃｏｍ
幽门螺杆菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ，Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）
的发现革命性改变很多胃肠疾病的基本理论，根除
幽门螺杆菌治疗广泛应用于这些疾病的防治。幽门
螺杆菌呈螺旋形，有鞭毛、适应性酶和粘附素，这使
它能在胃腔不利的酸性环境中定植和生存［１］。因
此，成功定植于胃粘膜细胞是整个致病过程中前提
和关键，粘附定植的过程可作为我们根治幽门螺杆
菌感染研究的一个新的靶点。参与整个定植和生存
的因素包括：尿素酶的活性［２－３］、鞭毛动力［４－５］以及粘
附性影响［１］。
本课题组在前期的研究中发现头花蓼水提物在
体外对幽门螺杆菌具有良好的抑菌活性［６］，同时发
现其作用可减少幽门螺杆菌在小鼠胃粘膜上的定植
密度，但具体的机制尚不清楚。因此，本研究在前期
研究的基础上，在体外观察头花蓼水提物作用对幽
门螺杆菌尿素酶活性和鞭毛动力的影响；并以人永
生化胃上皮细胞ＧＥＳ－１为靶细胞，通过细胞爬片实
验观察不同浓度头花蓼水提物对幽门螺杆菌粘附胃
粘膜上皮细胞的粘附能力的影响；Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ
检测头花蓼水提物作用前后粘附定植相关因子基因
的ｍＲＮＡ转录水平，探讨头花蓼水提物抑制幽门螺杆
菌成功定植的作用机制，为头花蓼的进一步开发利
用提供理论依据。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 实验菌株 幽门螺杆菌ＡＴＣＣ７００３９２国际
标准测序株，购自ＡＴＣＣ（美国菌种保藏中心），由本
课题组保管。
１．１．２ 实验药材 水提苗药头花蓼浸膏粉，棕色粉
末，批号为２００１０４０１，由浙江众益药业有限公司提供。
１．１．３ 试剂 布氏肉汤干粉、哥伦比亚血琼脂粉、
脑心浸液粉，Ｏｘｏｉｄ；触酶、氧化酶、尿素酶购自于梅
里埃；细菌活性蛋白提取试剂盒及尿素酶活性定量
检测试剂盒；ＲＮＡ反转录试剂盒及荧光定量ＰＣＲ
试剂盒购于ＴａＫａＲａ。
１．２ 方法
１．２．１ 培养基的制备
１．２．１．１ 固体培养平板的制备按说明书方法，称取
哥伦比亚血琼脂粉３．９ｇ，加入８４ｍＬ去离子水溶
解，高压灭菌（１２１℃，２０ｍｉｎ），待琼脂冷却至５６℃
左右加入无菌脱纤维绵羊血１０ｍＬ，混抗１ｍＬ，实
验组分别加入５ｍＬ浓度为４０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、
１０ｍｇ／ｍＬ头花蓼药液，使其平板浓度分别为１／
２ＭＩＣ（２ ｍｇ／ｍＬ）、１／４ＭＩＣ（１ ｍｇ／ｍＬ）、１／８ＭＩＣ
（０．５ｍｇ／ｍＬ），对照组加无菌去离子水，充分混匀
后倾倒于直径为９０ｍｍ的无菌平皿中，培养基厚度
约为３～４ｍｍ。
１．２．１．２ 半固体琼脂平板的制备 称取布氏肉汤干
粉１．４０５ｇ，哥伦比亚琼脂粉０．４５ｇ于锥形瓶中，加
入去离子水４４．５ｍＬ溶解，此为对照组；实验组则
是加入３９．５ｍＬ水溶解。高压灭菌（１２１℃，２０ｍｉｎ）
处理。待琼脂冷却至５６℃左右时加入无菌脱纤维
绵羊血５ｍＬ，混抗０．５ｍＬ，实验组需再分别加入
５ｍＬ浓度为 ４０ ｍｇ／ｍＬ、２０ ｍｇ／ｍＬ、１０ ｍｇ／ｍＬ、
５ｍｇ／ｍＬ头花蓼液，使其平板浓度分别为４ｍｇ／ｍＬ、
２ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ充分混匀后倾倒
于直径为９０ｍｍ的无菌平皿中，培养基厚度约为
３ｍｍ～４ｍｍ，使其成为含１０％脱纤维羊血的布氏
肉汤半固体培养基。
１．２．２ 尿素酶蛋白活性的检测 刮取对数生长期
幽门螺杆菌于脑心浸液肉汤中制备成浓度为１～９×
１０８ｃｆｕ／ｍＬ菌悬液，无菌棉签涂布于空白平皿及含
２ｍｇ／ｍＬ头花蓼药平皿上，置于微需氧环境中３７℃
５３７８期 张 姝等：头花蓼对幽门螺杆菌粘附定植的影响
培养７２ｈ，同样操作传代于新的平皿，共培养３代
后，分别取１００ｍｇ于预冷的无菌ＰＢＳ中。５ ０００ｇ
离心５ｍｉｎ收集菌体，根据试剂盒说明提取总蛋白。
ＢＣＡ法测定蛋白质含量。参照Ｒｏｋｉｔａ Ｅ推荐的方
法，根据ＧＥＮＭＥＤ细菌尿素酶活性比色法定量检
测试剂盒检测幽门螺杆菌的尿素酶活性。尿素酶活
性的抑制率＝（对照组－实验组）／对照组１００％
１．２．３ 细菌鞭毛动力定量检测 收集培养４８ｈ生
长状态良好的幽门螺杆菌悬于脑心浸液，调整菌液
浓度至３×１０８ＣＦＵ／Ｌ。菌液保存在４℃备用。取
１０μＬ分别穿刺接种于实验组（含头花蓼药液）和对
照组（含等量无菌去离子水）的布氏肉汤半固体琼脂
血平板上，相同浓度的各接种２个，置于３７℃培养
箱中培养５ｄ。分别测量实验组和对照组含药培养
基上幽门螺杆菌菌膜晕圈的直径（直尺量其直径）。
１．２．４ 头花蓼水提物对幽门螺杆菌粘附ＧＥＳ－１细
胞粘附抑制实验
１．２．４．１ 菌液的制备 刮取对数生长期幽门螺杆
菌，对照组：用不含双抗细胞完全培养基调节菌液浓
度为２×１０６ｃｆｕ／ｍＬ，药物组：分别用含药浓度为
１２８μｇ／ｍＬ、６４μｇ／ｍＬ、３２μｇ／ｍＬ、１６μｇ／ｍＬ的无
双抗细胞完全培养基溶液调节菌液浓度为２×
１０６ｃｆｕ／ｍＬ。
１．２．４．２ 细胞的培养 从－８０℃液氮罐中取出冻
存管，迅速置于３７℃水浴箱，轻轻摇动使其尽快融
化。用一次性吸管吸取细胞悬液，注入预加有６ｍＬ
细胞培养基的离心管中，混合后，１ ０００ｒｐｍ／ｍｉｎ，离
心５ ｍｉｎ，去除上清。将细胞接种于 ５ ｍＬ１０％
ＤＭＥＭ完全培养基中，置于３７℃，５％ ＣＯ２ 细胞培
养箱中培养。观察细胞的形态。
１．２．４．３ 爬片实验观察细胞的粘附 按照文献方
法［７－８］，采用对数生长期的ＧＥＳ－１细胞，ＰＢＳ洗涤细
胞３次，胰酶消化，离心收集细胞，用不含双抗细胞
完全培养基调节细胞浓度至２×１０４ 个／ｍＬ，加入到
放置有无菌盖玻片的６孔板中，每孔２ｍＬ，在３７℃
细胞培养箱中培养２４ｈ，待细胞贴壁后，用ＰＢＳ洗
涤两次，实验组分别加入含头花蓼浓度为１２８μｇ／
ｍＬ、６４μｇ／ｍＬ、３２μｇ／ｍＬ、１６μｇ／ｍＬ细胞培养基
配制的２×１０６ｃｆｕ／ｍＬ的菌悬液２ｍＬ，对照组加入
不含药物培养基配制的幽门螺杆菌菌悬液２ｍＬ（设
每个浓度做５个复孔），放入３７℃细胞培养箱中继
续培养２ｈ后，取出用ＰＢＳ洗涤３次，取出盖玻片，
自然干燥、甲醇固定１５ｍｉｎ，ＰＢＳ漂洗一次，以便漂
掉盖玻片上未粘附幽门螺杆菌，然后用革兰染色，油
镜下观察计数每个细胞上粘附的细菌数，每组计数
３０个细胞。计算每个细胞粘附细菌平均数，分析并
计算抑制率。抑制率＝（对照组－实验组）／对照组
１００％。实验重复３次。
１．２．５ 实时荧光定量ＰＣＲ检测幽门螺杆菌粘附定
植相关基因表达水平
１．２．５．１ 幽门螺杆菌总ＲＮＡ提取 在头花蓼水
提物终浓度为２ｍｇ／ｍＬ平板上培养至４８ｈ后的幽
门螺杆菌 ＡＴＣＣ ７００３９２设为实验组，同批未经头
花蓼处理的幽门螺杆菌 ＡＴＣＣ ７００３９２为对照组。
将对照组与实验组标本用脑心浸液肉汤调试细菌悬
液至１～９×１０７ ＣＦＵ／ｍＬ，采用Ｔｒｉｚｏｌ法提取各组
样品的总ＲＮＡ。
１．２．５．２ 实时荧光定量ＰＣＲ：将各组的幽门螺杆
菌ＲＮＡ按照ＴａＫａＲａ试剂盒说明书分别进行反转
录ｃＤＮＡ后，以其为模板，以１６Ｓ ｒＲＮＡ 基因作为
内参，运用ＳＹＢＲ ○Ｒ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭＩＩ试剂盒在
ＲＯＣＨＥ Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ４８０荧光定量ＰＣＲ仪上检测
鞭毛相关基因ｆｌａＡ、ｆｌａＢ，尿素酶活性基因ｕｒｅＥ、
ｕｒｅＦ及粘附素基因ｂａｂＡ、ａｌｐＡ、ａｌｐＢ引物设计采
用的Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ ５．０软件。相关基因引物序列
见表１。引物委托上海生工公司合成。２５μＬ ＰＣＲ
反应体系：目的基因的上下游引物各１μＬ，ｃＤＮＡ
模板２μＬ，ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ ＴａｑＴＭⅡ（２Ｘ）１２．５
μＬ，ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄｄＨ２Ｏ ８μＬ，ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ
（５０×）０．５μＬ。反应条件为：９５℃３０ｓ，９５℃５ｓ，
６０℃３０ｓ，４０个循环。每一个样品３个技术重复，
每组做３个生物重复。每次ＰＣＲ反应均设置阴性
对照（ｄｄＨ２Ｏ代替ｃＤＮＡ 模板）。采用比较２－△△ＣＴ
法，对目标基因进行相对定量分析。
１．２．６ 统计学处理 所有实验重复３次，用均数±
标准差（ｘ±ｓ）表示，采用ＳＰＳＳ １７．０软件进行统计
学分析，两组比较用ｔ检验，两组间相关性分析的采
用Ｐｅａｒｓｏｎ相关性分析，Ｐ＜０．０５具有统计学意义。
６３７ 中 国 人 兽 共 患 病 学 报 ２０１６，３２（８）
表１ ＰＣＲ引物序列
Ｔａｂ．１ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＰＣＲ
基因名称
（Ｇｅｎｅ）
引物序列（５′ｔｏ ３′）
（Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
产物长度（ｂｐ）
（Ｐｒｏｄｕｃｔ ｌｅｎｇｔｈ）
１６ＳｒＲＮＡ－Ｆ ＣＣＧＣＣＴＡＣＧＣＧＣＴＣＴＴＴＡＣ １００
１６ＳｒＲＮＡ－Ｒ ＣＴＡＡＣＧＡＡＴＡＡＧＣＡＣＣＧＧＣＴＡＡＣ
ｆｌａＡ－Ｆ ＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＡＧＣＡＧＡＡＧＴＧＡ ９９
ｆｌａＡ－Ｒ ＴＧＡＣＴＧＧＡＣＣＧＣＣＡＣＡＴＣ
ｆｌａＢ－Ｆ ＡＣＡＴＣＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＴＧＴＧＡ ９５
ｆｌａＢ－Ｒ ＧＣＣＣＣＴＡＡＣＣＧＣＴＣＴＣＡＡＡＴ
ｂａｂＡ－Ｆ ＴＧＣＴＣＡＧＧＧＣＡＡＧＧＧＡＡＴＡＡ ９５
ｂａｂＡ－Ｒ ＡＴＣＧＴＧＧＴＧＧＴＴＡＣＧＣＴＴＴＴＧ
ａｌｐＡ－Ｆ ＧＣＡＣＧＡＴＣＧＧＴＡＧＣＣＡＧＡＣＴ ９０
ａｌｐＡ－Ｒ ＡＣＡＣＡＴＴＣＣＣＣＧＣＡＴＴＣＡＡＧ
ａｌｐＢ－Ｆ ＡＣＧＣＴＡＡＧＡＡＡＣＡＧＣＣＣＴＣＡＡＣ ８２
ａｌｐＢ－Ｒ ＴＣＡＴＧＣＧＴＡＡＣＣＣＣＡＣＡＴＣＡ
ｕｒｅＦ Ｆ ＧＧＧＧＣＴＴＧＴＧＧＡＴＡＧＣＡＴＡＡ ２０６
ｕｒｅＦ Ｒ ＣＧＣＡＴＴＣＴＴＴＴＧＧＧＣＴＡＧＡＡ
ｕｒｅＥ Ｆ ＴＣＴＴＧＧＣＴＴＧＧＡＴＧＴＧＡＡＴＧ １８５
ｕｒｅＥＲ ＧＧＡＡＴＧＧＴＴＴＧＡＡＡＣＧＡＧＧＡ
ｕｒｅＢＦ ＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＡＣＴＡ ２３６
ｕｒｅＢＲ ＧＣＧＴＣＧＴＴＡＧＡＡＧＣＧＴＴＡＣＧ
３ 结 果
３．１ 头花蓼水提物对细菌尿素酶活性的影响 采
用尿素酶活性比色法检测实验组和对照组的尿素酶
活性，显示头花蓼作用后幽门螺杆菌尿素酶活性与
对照组相比显著降低，为１８４．７８ｍＩＵ／ｍｉｎ±４．７４
ｍＩＵ／ｍｉｎ，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。实验
组与对照组的尿素酶活性抑制率为４４．９０±０．２８９。
见图１。
图１ 头花蓼对幽门螺杆菌尿素酶活性的影响
Ｆｉｇ．１ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｐ．ｃａｐｉｔａｔｕｍｏｎ Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ｕｒｅ－
ａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
３．２ 苗药头花蓼作用对幽门螺杆菌鞭毛动力的影
响 幽门螺杆菌在半固体培养基上培养５ｄ后，测
量结果显示１／２ＭＩＣ、１／４ＭＩＣ、１／８ＭＩＣ头花蓼作用
后幽门螺杆菌菌膜晕圈直径显著小于对照组，差异
有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。药物浓度的越大，幽门
螺杆菌菌膜晕圈直径越小。表明苗药头花蓼可降低
幽门螺杆菌鞭毛动力，且幽门螺杆菌鞭毛动力的抑
制程度与苗药头花蓼药物浓度呈剂量相关性。见表
２。
表２ 头花蓼作用前后幽门螺杆菌菌膜圈直径的变化
Ｔａｂ．２ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＰＣＲ
组 别
Ｇｒｏｕｐ
菌膜圈直径（ｍｍ）
Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｉｒｃｌｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ
对照组 １６．００±１．００
１／８ＭＩＣ组 １１．６７±１．５３＊
１／４ＭＩＣ组 ８．５０±０．５０＊
１／２ＭＩＣ组 ５．６７±０．５５＊
＊与空白组相比Ｐ＜０．０５
３．３ 不同头花蓼药物浓度对细菌粘附的影响 各
７３７８期 张 姝等：头花蓼对幽门螺杆菌粘附定植的影响
药物浓度作用下，细菌对细胞的粘附情况见图２。Ａ
图为ＧＥＳ－１细胞在低倍镜下的正常形态。油镜下，
对照组可见幽门螺杆菌局灶性粘附 ＧＥＳ－１细胞的
一侧，呈现趋向性。不同浓度（１６μｇ／ｍＬ、３２μｇ／
ｍＬ、６４μｇ／ｍＬ、１２８μｇ／ｍＬ）头花蓼对幽门螺杆菌
粘附ＧＥＳ－１细胞均有抑制作用，细胞上粘附的细菌
数均显著减少，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。
粘附细菌数量随着药物浓度的增加而减少，在１２８
μｇ／ｍＬ头花蓼组粘附的细菌数量最少。粘附呈弥
漫性粘附，无规则地粘附在ＧＥＳ－１细胞表面。见表３。
注：Ａ细胞爬片革兰染色（×１００）；Ｂ对照组（×１ ０００）；Ｃ为１６μｇ／ｍＬ头花蓼处理组（×１ ０００）；Ｄ为３２μｇ／ｍＬ头花蓼处理
组（×１ ０００）；Ｅ为６４μｇ／ｍＬ头花蓼处理组（×１ ０００）；Ｆ为１２８μｇ／ｍＬ头花蓼处理组（×１ ０００）
Ａ：Ｃｅｌ ｓｌｉｄｅ Ｇｒａｍ ｓｔａｉｎ（×１００），Ｂ：Ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ Ａ：ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｇｒｏｕｐ（×１ ０００），
Ｃ：Ｔｈｅ １６μｇ／ｍＬ Ｐ．ｃａｐｉｔａｔｕｍｇｒｏｕｐ（×１ ０００），Ｄ：Ｔｈｅ ３２μｇ／ｍＬ Ｐ．ｃａｐｉｔａｔｕｍｇｒｏｕｐ；（×１ ０００），
Ｅ：Ｔｈｅ ６４μｇ／ｍＬ Ｐ．ｃａｐｉｔａｔｕｍｇｒｏｕｐ（×１ ０００），Ｆ：Ｔｈｅ １２８μｇ／ｍＬ Ｐ．ｃａｐｉｔａｔｕｍｇｒｏｕｐ（×１ ０００）
图２ 不同头花蓼浓度对幽门螺杆菌粘附的影响
Ｆｉｇ．２ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐ．ｃａｐｉｔａｔｕｍｏｎ Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｔｏ ｃｅｌｓ
表３ 不同头花蓼药物浓度对细菌粘附的影响
Ｔａｂ．３ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐ．ｃａｐｉｔａｔｕｍｏｎ Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｔｏ ｃｅｌｓ
头花蓼浓度
Ｐ．ｃａｐｉｔａｔｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
对照组
Ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ
１６μｇ／ｍＬ ３２μｇ／ｍＬ ６４μｇ／ｍＬ １２８μｇ／ｍＬ
粘附细菌数／个Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ
ａｄｈｅｒｅｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ
５８．５±４．５５ ３４．５０±４．５５＊ ２６．４０±２．８１＊ １８．３７±３．８８＊ １３．４±１．９０＊
抑制率Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ — ０．４１ ０．５５ ０．６９ ０．７７
＊Ｐ＜０．０５ｖｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ
８３７ 中 国 人 兽 共 患 病 学 报 ２０１６，３２（８）
３．４ 头花蓼作用对定植相关基因转录水平的影响
以１６ＳｒＲＮＡ 基因作为内参，采用２－ΔΔＣＴ法对头
花蓼对幽门螺杆菌作用后对定植相关基因表达差异
进行分析。在头花蓼作用幽门螺杆菌前后，尿素酶
基因ｕｒｅＢ、ｕｒｅＥ、ｕｒｅＦ，鞭毛相关基因ｆｌａＡ、ｆｌａＢ，
粘附素基因ｂａｂＡ、ａｌｐＡ、ａｌｐＢ均有表达，其中对照
组与实验组相比其表达量有显著差异（Ｐ＜０．０５），
且对照组＞实验组。其中ｂａｂＡ基因变化下调最为
明显，为１７．３倍。见图４。
图４ 头花蓼对幽门螺杆菌粘附定植相关基因ｍＲ－
ＮＡ转录的影响
Ｆｉｇ．４ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｐ．ｃａｐｉｔａｔｕｍｏｎ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ
ｇｅｎｅｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ
４ 讨 论
幽门螺杆菌的致病机制包括诸多环节，其中定
植是致病的关键，而粘附是定植的前提，幽门螺杆菌
之所以能够在胃肠蠕动是不会与食物一起驱除的原
因是幽门螺杆菌的动力比其他菌种强，这使幽门螺
杆菌能够快速穿过胃腔的酸性环境达到中性的粘液
层中，并穿过粘稠的粘液层，定植与胃黏膜上，幽门
螺杆菌可产生大量的尿素酶，约占菌体总蛋白的
１０％［９］。尿素酶是幽门螺杆菌产生的一种能将尿素
水解为氨和二氧化碳的酶，在菌体周围形成“氨云”，
使ｐＨ值升高引起的低酸可降低黏液中黏蛋白的含
量，破坏黏液的离子完整性，削弱胃黏膜屏障功能，
使细菌能够顺利穿过胃黏液层到达胃黏膜表
面［１０－１１］。他对于幽门螺杆菌的定植和生存起着重要
的作用。抗溃疡药物依卡倍特可通过抑制幽门螺杆
菌的尿素酶活性抑制幽门螺杆菌定植而达到辅助治
疗幽门螺杆菌慢性胃炎等消化性疾病 ［１２］。幽门螺
杆菌尿素酶基因族共包含九个基因，其中ｕｒｅＥ、
ｕｒｅＦ为尿素酶活性基因，他们一起为尿素酶的活性
表达所必须［１３］。本研究采用比色法检测实验组与
对照组的尿素酶活性，观察到在头花蓼的作用下，尿
素酶活性降低。同时检测幽门螺杆菌尿素酶活性蛋
白基因ｕｒｅＥ、ｕｒｅＦｍＲＮＡ水平与平行培养的对照
组相比分别下调３．７７倍和５．０９倍。因此推测苗药
头花蓼除了通过抑制尿素酶活性降低其催化效率
外，还通过影响尿素酶基因的转录，降低幽门螺杆菌
尿素酶的生成量降低幽门螺杆菌对尿素酶的催化效
率，进而降低幽门螺杆菌在胃的生存能力。
当幽门螺杆菌进入胃后，在尿素酶提供的微环
境前提下，鞭毛的摆动使细菌作旋转前进，穿透覆盖
于胃粘膜上皮细胞的粘液层。故认为鞭毛的动力可
直接影响菌株在宿主的定植及生存能力。菌株动力
性与其在宿主的感染率成正比，动力极强的菌株感
染率可达１００％，无鞭毛菌株或鞭毛突变株则不能
成功定植于胃黏膜。幽门螺杆菌的鞭毛蛋白由２个
鞭毛素基因ｆａｌＡ 和ｆｌａＢ 编码的ＦａｌＡ、ＦｌａＢ蛋白
多聚体组成。这两种鞭毛蛋白对于细菌的运动均是
必须的。本研究中，幽门螺杆菌含苗药头花蓼水提
取的半固体琼脂平板上的游泳运动能力明显小于对
照组，说明其可降低细菌的游泳动力。荧光定量
ＰＣＲ检测结果显示头花廖可显著下调ｆｌａＡ、ｆｌａＢ
基因的表达。推测苗药头花蓼作用可能通过影响幽
门螺杆菌鞭毛相关基因ｆａｌＡ、ｆｌａＢ影响其编码Ｆａ－
ｌＡ、ＦｌａＢ鞭毛蛋白的从而抑制幽门螺杆菌的运动
能力。
在尿素酶提供的微环境和鞭毛提供动力下，幽
门螺杆菌顺利到达相对中性的胃粘膜表面，此时幽
门螺杆菌通过粘附素特异性的直接与宿主细胞、粘
蛋白等结合使幽门螺杆菌能在宿主体内长期生存。
幽门螺杆菌这种特异性的粘附反映了它存在粘附因
子，其中最为重要是ＢａｂＡ，ＡｌｐＡ 和ＡｌｐＢ。ＢａｂＡ
是血型抗原结合性粘附素，介导幽门螺杆菌的初始
粘附［１４］。ＡｌｐＡ和 ＡｌｐＢ由高度同源的基因ａｌｐＡ
和ａｌｐＢ 编码，ａｌｐＡ、ａｌｐＢ 主要与宿主的黏连蛋白
层结合介导细菌与胃粘膜组织的粘附，当ａｌｐＡ 和
ａｌｐＢ 缺失情况下，可以减少幽门螺杆菌在动物的定
植量［１５］在体外细胞爬片实验中观察，头花蓼作用后
幽门螺杆菌对ＧＥＳ－１细胞的粘附数量减少，表明头
花蓼可以抑制幽门螺杆菌对 ＧＥＳ－１细胞的粘附。
荧光定量ＰＣＲ检测头花蓼作用前后粘附素ＢａｂＡ、
ＡｌｐＡ、ＡｌｐＢ 的基因水平，头花蓼作用后粘附素
ＢａｂＡ、ＡｌｐＡ、ＡｌｐＢ的 ｍＲＮＡ水平均下调，差异均
具有统计学意义。推测当苗药头花蓼作用通过抑制
ｂａｂＡ基因表达影响幽门螺杆菌表面粘附素ＢａｂＡ
的生成量，由ＢａｂＡ介导的细菌初始粘附能力降低。
同时等位基因编码的ａｌｐＡ、ａｌｐＢ粘附素基因表达
同样受到抑制，ａｌｐＡ、ａｌｐＢ的抑制可降低细菌在胃
粘膜的定植量。
９３７８期 张 姝等：头花蓼对幽门螺杆菌粘附定植的影响
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收稿日期：２０１６－０２－２１；修回日期：２０１６－０４－２０
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０４７ 中 国 人 兽 共 患 病 学 报 ２０１６，３２（８）