全 文 ： 人心果细胞悬浮培养的初步研究
何　钢1 , 文亚峰2 , 付　杰1 , 谢碧霞2 , 李　樊1 , 韩文军1 , 邢伟一1
(1.中南林学院生命科学与技术学院 ,湖南株洲 412006;2.中南林学院资源与环境学院 ,湖南 长沙 410007)
[ 摘　要] 对人心果愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养结果表明 ,人心果愈伤组织诱导培养基为 MS+6-BA 0.2 mg/ L+NAA 0.1 mg/ L
+2 , 4-D 1.0mg/ L+PVP 3.0 g/ L;继代培养基为MS+6-BA 0.5 mg/ L+NAA 0.1mg/L+2 , 4-D 1.0mg/ L+PVP 3.0 g/ L。最佳的细胞悬浮
培养基为MS+6-BA 0.2～ 0.5mg/L+NAA 0.1 mg/ L+2, 4-D 0.5～ 1.0 mg/ L+蔗糖 30 g/ L。培养液体积为 40mL时 ,以 4～ 6mL的接种
量为宜。悬浮细胞在生长前期 , pH 下降较明显 ,而在细胞对数生长期 , pH 变化不明显。此项研究为进一步选育高产人心果胶细胞株
打下了良好的基础。
[ 关键词] 人心果;培养基;愈伤组织;悬浮细胞
[ 中图分类号] S667.9;S604+.3　　　　[文献标识码] A　　　　[文章编号] 1003-8981(2004)04-0043-04
Primary Research on Suspending Cell Cultivation of Manilkara zapota
HE Gang1 , WEN Ya-Feng1 , FU Jie1 , XIE Bi-Xia2 , LI Fan1 , HAN Wen-Jun1 , XING Wei-Yi1
(1.Life Science and Technology College of CSFU , Zhuzhou , Hunan 412006 , China;
2.Forest Resource and Environment College of CSFU , Changsha , Hunan 410007 , China)
Abstract:The results of inducing callus and cell suspending cultivation showed that the medium for inducing callus is MS +0.2 mg
·L-1 6-BA +0.1 mg·L-1NAA + 1.0 mg·L-12 , 4-D +3.0 g·L-1 PVP;the medium for the second generation is MS +0.5 mg
·L-1 6-BA +0.1 mg·L-1 NAA +1.0 mg·L-1 2 , 4-D +3.0 g·L -1PVP;and the optional medium for suspending cell cultivation
is MS + 0.20.5 mg·L-1 6-BA + 0.1 mg·L-1 NAA + 0.51.0 mg·L-1 2 , 4-D +30 g·L-1 sucrose.
Key words:Manilkara zapota;medium;callus;suspending cell
自20世纪 80年代以来 ,人们对各种植物进行了悬浮培养 ,积累了大量的经验和获得了许多重要成果。陈
志贤等[ 1]利用陆地棉下胚轴诱导愈伤组织建立悬浮细胞系 ,游离出原生质体并培养得到小植株。唐巍[ 2]等建
立了人参悬浮细胞系并对其生长特性进行了研究 。葛台明[ 3]等讨论了高分化潜能小麦胚性悬浮系的建立及保
持。贝丽霞[ 4]等研究了不同培养基以及激素对水稻悬浮细胞生长速率的影响 ,为水稻的悬浮培养奠定了基础 。
余舜武[ 5]等人对快速建立胚性细胞悬浮系的培养程序进行了初探。周春江[ 6]等人研究了草莓悬浮细胞系的建
立及某些影响因素。而李志勇[ 7]等人对高产 SOD大蒜悬浮细胞系的选育进行了大量研究。植物细胞培养的
目的之一就是大规模生产代谢产物 ,一般情况下 ,培养细胞中的次级代谢物含量明显高于原来植物细胞中的含
量 ,而且这种方法还能避免地域和环境的影响 。
人心果Manilkara zapota 原产墨西哥南部 、西印度群岛一带[ 8] 。20世纪初传入我国 ,广东 、海南和云南等地
有引种或少量栽培。人心果果实 、树皮 、叶片中含乳状汁液 ,汁液中所含的人心果胶是制造环保口香糖胶基的
原料[ 9～ 10] 。人心果胶是人心果的次生代谢产物 。因此 ,建立悬浮细胞系是使其产量提高的有效途径 ,因此 ,进
行人心果悬浮细胞培养研究具有极其重要的现实意义 。
1　材料与方法
经济林研究　2004 , 22(4):43-46
Nonwood　Forest　Research 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
[收稿日期] 2004-09-18
[基金项目] 中南林学院青年基金项目(编号:0190)和国家“ 948”项目(编号:2002-29)。
[作者简介] 何　钢(1965-),男 ,湖南湘潭人 ,教授 ,硕士 ,主要从事经济林和生物技术教学与科研工作。
DOI :10.14067/j.cnki.1003-8981.2004.04.012
1.1　材料
外植体采自海南文昌县的新鲜人心果茎 、叶和果。基本培养基为 MS培养基。培养基的 pH值均调到 5.9
～ 6.0;固体培养基中琼脂 8 g ,蔗糖 30 g 。
1.2　方法
1.2.1　外植体诱导愈伤组织及愈伤组织的继代培养　外植体的灭菌:叶片用酒精浸泡 20 s ,升汞浸泡8 min 30
s灭菌 ,最后用无菌水冲洗8次;茎段用酒精浸泡30 s ,升汞浸泡 12 min灭菌 ,最后用无菌水冲洗 8次;种子先用
酒精浸泡 20 s ,去壳 ,再用酒精浸泡 10 s ,用升汞浸泡8 min灭菌 ,最后用无菌水冲洗 8次 ,用解剖刀剖开种子 ,
去除胚乳 ,再切下成熟胚 。外植体接种的具体操作如下 ,左手拿三角瓶 ,用右手轻轻取下包头纸 。将三角瓶的
口靠近酒精灯火焰 ,瓶口略倾斜。将瓶口在火焰上旋转灼烧 ,然后用镊子将外植体送入瓶中。茎尖茎段等基部
插入固体培养基中 ,叶片通常将叶背面接触培养基 。镊子灼烧后放回支架或浸入消毒酒精中。所有材料接种
完毕 ,包扎好封口膜 ,做好标记。诱导培养基为 R5 ,MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L+2 , 4-D 1.0 mg/L +
PVP 3.0g/L;愈伤组织的继代培养基为R16 ,MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L+2 ,4-D 1.0 mg/L+PVP 3.0 g/
L。
1.2.2　悬浮培养及继代培养　取继代 10 ～ 15 d分散性好的胚性愈伤组织 2 g ,置于无菌的 100 mL 三角瓶中 ,
加入 40 mL 液体培养基 。在 110 r/min(26±1)℃恒温摇床上进行悬浮培养 。根据培养物的生长状况 ,每 5 ～ 10
d继代 1次 。悬浮培养及继代培养时 ,将培养物摇匀 ,静置片刻 ,用吸管吸取培养基中部的培养物(此处细胞团
小而均一 ,细胞浓厚)。在更换培养基时 ,弃去愈伤组织块或大细胞团 ,只保留小细胞团置于瓶内 ,加入新鲜培
养基 。吸取量与新鲜培养基混合的比例为 1∶3。
1.2.3　悬浮细胞生长量测定　方法之一是采用细胞干质量法 ,即悬浮细胞经滤纸过滤 ,烘干(60℃, 10 h)后称
质量 。方法之二是以细胞鲜质量的增长倍数表示 ,即接种时细胞鲜质量与取样时细胞鲜质量之比 。所列实验
结果均为 2次重复平均值。
1.2.4　悬浮培养中 pH 的测定　取不同时期的培养液 ,用 pHS-25型 pH 计测定。
1.2.5　预选悬浮细胞系的获得　选择有代表性的黄色和绿色愈伤组织各 5个 ,夹碎为小细胞团 ,在液体培养
基中加玻璃珠培养 18 d ,然后将分散的小细胞团在 MS固体培养基上进行连续继代培养 ,去杂后转入液体培养
基悬浮培养 ,得到 10个稳定性能较好的细胞系作为预选悬浮细胞系 。
2　结果与分析
2.1　愈伤组织的诱导
将人心果的叶 、茎灭菌后在激素配比为 R5的固体培养基中暗培养 ,共接种 200瓶 。培养 20 d后 ,由于叶
和茎中存在大量的内生菌无法清除干净 ,所以 200瓶全部污染。随后将人心果种胚灭菌后在激素配比为 R5的
固体培养基中暗培养 ,一段时间后 ,再光培养 。发现97瓶中 37瓶长出芽 ,其中10瓶长势旺盛 ,5瓶污染 。然后
将芽接种到激素配比为 R5的固体培养基中培养 ,很快便长出愈伤组织。这主要是因为胚芽中无内生菌或有
少许内生菌 ,易于诱导愈伤组织。因此要快速的诱导人心果的愈伤组织 ,应选择人心果的种胚 。
2.2　胚性愈伤组织的获得
将人心果的愈伤组织在激素配比为R16的固体培养基中进行继代培养。每20 d继代 1次 ,继代 2次后 ,多
数愈伤组织呈黄色和绿色 ,少量为褐色 。黄色和绿色的愈伤组织即为较好的胚性愈伤组织。因为衰败细胞逐
渐褐化死亡 ,呈黑褐色 ,而生长旺盛 、内含物丰富的细胞呈鲜黄色颗粒状 。每次继代时 ,挑选这种质地致密 、淡
黄色的愈伤组织进行培养即可得到胚性愈伤组织 。
2.3　悬浮细胞培养基的选择
2.3.1　生长调节物质对悬浮细胞系的影响　生长素和细胞分裂素结合使用对培养植物细胞的生长具有协同
增效作用 ,但适合于固体培养的浓度不一定适合于液体悬浮培养 。在固体培养中 ,激素通过扩散与植物材料接
触起作用 ,而在液体培养中是直接接触的 ,故激素浓度要适当降低 。悬浮细胞在含 2 ,4-D(或 NAA)与 6-BA 的
MS液体培养基中继代 ,颗粒逐渐变大 。在不含生长调节物质的培养基中 ,悬浮细胞生长很慢 ,颜色也由淡黄色
变为灰褐色 。因此仍采用胚性愈伤组织继代培养基的 3种生长调节物质 。如表 1 , 由表 1 可知 , NAA 为
0.1 mg/L ,2 ,4-D为 0.5 ～ 1.0 mg/L ,6-BA为 0.2 ～ 0.5 mg/L时 ,悬浮培养细胞生长良好 。这与固体培养时相比
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生长调节物质含量要略有下降 。
表 1　不同激素浓度对人心果悬浮培养细胞生长的影响
序号 NAA/(mg·L-1) 2 , 4-D/(mg·L-1) 6-BA/(mg·L-1) 接种量/mg 收获量/mg 15 d增殖/倍
1 0.1 0.5 0.2 15 85 5.7
2 0.1 0.5 0.5 15 100 6.7
3 0.1 0.5 1.0 15 65 4.3
4 0.1 1.0 0.2 10 70 7.0
5 0.1 1.0 0.5 35 80 2.3
6 0.1 1.0 1.0 10 70 7.0
7 0.1 2.0 0.2 15 60 4.0
8 0.1 2.0 0.5 10 60 6.0
9 0.1 2.0 1.0 10 50 5.0
2.3.2　不同初始蔗糖含量对人心果悬浮
细胞生长的影响　蔗糖是植物细胞培养中
最常用的碳源之一 ,它不仅作为能源物质 ,
还能维持一定的渗透压。初始蔗糖含量采
用0 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L 、50 g/L 、60
g/L 的单因素试验 ,培养基为MS+6-BA 0.
5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+2 ,4-D 1.0 mg/L ,
结果见表 2 ,由表 2可知 ,由 20 g/L的蔗糖
含量增加到30 g/L时 ,细胞增殖有明显增
快 ,而在 30 ～ 60 g/L的蔗糖含量范围内 ,收
获物湿质量未有明显变化 。说明 30g/L 的
蔗糖含量适合人心果细胞的生长。未加蔗糖的对照则基本没有增长 ,这与细胞生长受到抑制和部分细胞褐变
死亡有关 。
表 2　不同初始蔗糖浓度对人心果悬浮细胞生长的影响
处理 蔗糖含量/(g·L-1) 接种量/ mg 收获量/mg 15 d 的增殖/倍数
1 0 25 40 1.6
2 20 25 55 2.2
3 30 20 75 3.8
4 40 25 85 3.4
5 50 25 65 2.6
6 60 20 60 3.0
图 1　初始悬浮细胞液体积与悬浮细胞增殖倍数的关系
图 2　悬浮细胞生长曲线与培养基 pH 变化的关系
通过对激素配比和蔗糖含量的试验分析 ,我们得出最
佳的悬浮细胞培养基为 MS +6-BA 0.2 ～ 0.5 mg/L +NAA
0.1 mg/L+2 ,4-D 0.5 ～ 1.0 mg/L+蔗糖30 g/L。
2.4　初始接种量对悬浮细胞系生长的影响
细胞生长需要有一个最低接种密度 ,若低于此密度 ,细
胞生长速率就降低或根本不生长。而细胞干重一般是随接
种量增加而增加的。但与细胞的增殖相比 ,次生产物的产
生更易受到接种量的影响 ,接种量对产物积累的有利影响
是有其上限的。从稳定的悬浮细胞系中分别吸取 2 mL 、4
mL 、6 mL 、8 mL 、10 mL 悬浮细胞进行培养 , 7d继代 1次 ,继
代培养基为 MS+6-BA 0.5 mg/L +NAA 0.1 mg/L+2 ,4-D
1.0 mg/L+蔗糖 30 g/L ,培养液均为 40 mL ,2次继代后将
悬浮细胞烘干称质量 ,结果如图 1 ,从图 1可以看出 ,初始
悬浮细胞的量过多或过少 ,在 15 d的培养过程中 ,细胞增
殖倍数都较小。4 ～ 6 mL 的接种量增殖可达 5 ～ 6 倍。随
着初始接种量的增加 ,培养液变得较为浑浊 ,细胞颜色也有
变褐的趋势。因此 ,培养液体积为 40 mL 时 ,以 4 ～ 6 mL的
接种量为宜。
2.5　培养过程中悬浮细胞系的生长速率及 pH值的变化
从稳定的悬浮细胞系中吸取 5 mL 悬浮细胞至无菌的
150 mL 三角瓶中 ,加入 40 mL液体培养基 ,每 3 d测定 1次
悬浮细胞干质量及 pH 值的变化 ,结果见图 2 ,从图 2可以
看出 ,在 15 d的培养周期中 ,悬浮细胞的干质量在继代 6 d
左右就可以增加 1倍 ,6 ～ 9 d时达到对数生长期 ,15 d时则
增加 5.9 倍。从培养基的 pH 值变化来看 ,继代培养 6 d
后 ,培养基的 pH 值由 5.90迅速下降至 4.14 ,此时细胞处
于缓慢增殖时期 ,生长相对迟缓。在随后的几天内 ,细胞干
质量呈增加趋势 。培养基的 pH值缓慢下降至 3.92后开始
上升 ,细胞的增殖也随之明显加快 ,正是细胞对数生长期。继续培养时 ,pH 值保持相对稳定。人心果悬浮细胞
系生长率与培养基 pH 变化之间的这种关系 ,在改进悬浮细胞系的培养条件中值得考虑 。
45第 4 期 　　　　　　　　　　　　　　　何　钢等:人心果细胞悬浮培养的初步研究　　　　　　　　　　　　　　　
3　结　论
从人心果愈伤组织的诱导到悬浮细胞 ,其中愈伤组织诱导及继代时采用的激素配比是实验前期筛选的较
好的两种培养基 ,即诱导培养基为 R5 ,MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1mg/L+2 ,4-D 1.0 mg/L+PVP 3.0 g/L;愈
伤组织的继代培养基为 R16 ,MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+2 ,4-D 1.0 mg/L+PVP 3.0 g/L。实验对人
心果的外植体选择进行了研究 ,结果表明要快速的诱导人心果的愈伤组织 ,应选择人心果的胚作为外植体。悬
浮细胞培养基选择方面 ,分别对不同激素配比和不同蔗糖含量的MS 培养基进行了对比 ,初步确定了最佳的悬
浮细胞培养基为 MS+6-BA 0.2 ～ 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+2 ,4-D 0.5 ～ 1.0mg/L+蔗糖 30 g/L。悬浮细胞接
种的量过多或过少 ,在15 d的培养过程中 ,细胞增殖倍数都较小 ,培养液体积为 40 mL时 ,以 4 ～ 6 mL的接种量
为宜。悬浮细胞在生长前期 ,pH下降较明显 ,而在细胞对数生长期 ,pH变化不明显 。此次实验只对人心果悬
浮细胞培养的培养基 、初始接种量和悬浮细胞的生长状况进行了初步研究 ,对于要得到高产人心果胶细胞株 ,
还有许多工作要做。例如不同蔗糖含量对人心果胶含量的影响 ,各个人心果悬浮细胞系最大胶含量及出现时
间的确定 ,高产胶悬浮细胞系的筛选以及高产胶悬浮细胞系的细胞生长和胶含量的测定以及愈伤组织固体培
养时继代的次数对悬浮细胞的生长 、胶含量的影响等等 ,都有待于进一步研究。
[参　考　文　献]
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