全 文 ：第 27卷 第 1期
2 0 0 9年 1月
中 华 中 医 药 学 刊
CH INESE ARCH IVES OF TRAD IT IONAL CH INESE MED IC INE
Vo.l 27 No. 1
Jan. 2 0 0 9
中
药
研
究
扫
描
中华中医药
学刊
草木犀正丁醇提取物对
NF - JB和血红素氧合酶 1表达的影响
庞 然1,张淑玲 1,赵 雷 1,刘双林2,董继华 1,陶君彦3
( 11华中科技大学同济医学院协和医院,湖北 武汉 430022;
21华中科技大学同济医学院同济医院泌尿外科, 湖北 武汉 430030;
31华中科技大学生命科学与技术学院,湖北 武汉 430072)
摘 要:目的: 探讨草木犀的正丁醇提取物在炎症中的作用。方法: 通过 LPS干预 RAW264. 7细胞系建立炎
症细胞模型,免疫细胞化学法检验 NF -JB的表达及分布变化,实时荧光定量 RT - PCR法检测血红素氧合酶 1
( HO -1)的基因表达, W este rn blot法测定 HO - 1的蛋白表达量。结果: 免疫细胞化学法结果显示药物干预时胞
质被染为棕色, NF -JB多分布在胞质未被激活; 仅有 LPS干预时, 胞核被染为棕色, NF -JB集中分布在细胞核
表达增强。药物提取物干预后 HO -1的 mRNA表达水平明显升高,且呈剂量依赖型关系; W este rn blo t结果显示
药物干预后 HO -1的蛋白表达水平也明显升高。结论: 草木犀的正丁醇提取物通过抑制 NF -JB的激活, 同时
促进 HO -1的释放而发挥一定的抗炎作用。
关键词:草木犀;正丁醇; RAW 26417细胞系; NF -JB, 血红素氧合酶 1
中图分类号: R392; R503 文献标识码: A 文章编号: 1673 - 7717( 2009) 01 - 0201 - 03
Effect o f N-butano l Ex trac t from Melilo tusSuaveolens
Ledeb on NF -JB and HemeOxygenase 1 Express ion
PANG Ran1, ZHANG Shu-ling1, ZHAO Lei1, L IU Shuang-lin2, DONG Ji-hua1, TAO Jun-yan3
( 11Union H ospi tal TongjiMedical Co llege, Huazh ong Un iversity of Science and Techno logy, W uhan 430022, Hub e,i C hina;
21Departm en t ofU rology, Tong jiHospita,l TongjiM edica lCo llege, H uazhong Univers ity of S cien ce and Technology, Wuhan 430030, H ube,i Ch ina;
31C ollege of Life S cien ce and Technology, H uazhong Un iversity of S cience and Technology, Wuhan 430072, H ube,i Ch ina)
Abstrac:tObjective: To study the an ti-inflamm a to ry e ffect o f n-bu tanol ex trac t from me lilo tus suaveo lens ledeb.M eth-
ods: Inflamm ation cellm ode lw as construc ted by LPS acting on the RAW 26417 cell line; the expression and distribu tion of
NF -JB w ere de tec ted through immunocy tochem ica lm e thod; the expression o f mRNA and p ro te in o f H em e oxygenase 1
( HO -1) we re de tected th rough real-tim e PCR andW estern b lo .t Results: The resu lts o f immunocy to chem ica l m e thod
show ed tha t cy toplasm sta ined to b rown presented NF -JB inactiva tion after intervention of the n-butano l ex trac,t ce ll nu-
c leus stained to brow n p resented NF -JB activa tion a fter in te rvention o f LPS only. The exp ression of HO - 1mRNA can
be significan tly enhanced by the ex tract in a do se-dependentm anner, and the expression o fHO - 1 pro tein can be signifi-
cantly enhanced too. Conclus ion: The n-butano l ex tract from m elilotus suaveo lens Ledeb can resist inflamm a tion by inhibi-
ting the ac tivation of pro inflamm atory fac to rNF -JB and by enhancing the expression o f antiinflamm atory fac to rHO - 1.
Keyw ords: m elilotus suaveo lens ledeb; n-butano;l RAW2641 7 ce ll line; NF -JB; HO - 1
收稿日期: 2008 - 08 - 15
作者简介:庞然 ( 1982 - ),女,湖北天门人,博士研究生,研究方向:
中药的抗炎退黄及抗病毒机制研究。
通讯作者:张淑玲 ( 1951 - ),女,教授,主任医师, 博士研究生导师,
研究方向:中药的抗炎退黄抗病毒研究。
草木犀,豆科 ( Legum inosae)草木犀属 (M e lilo tus) 一年
生或二年生草本植物, 是临床用于抗炎的一种中草药。然
而,草木犀产生抗炎作用的分子生物学机制还不明确。本
实验拟通过 LPS刺激 RAW 26417小鼠巨噬细胞系建立炎
症细胞模型 [1 ],并采用免疫细胞化学法﹑实时荧光定量 RT
-PCR法﹑ Weste rn b lo t法对草木犀提取物在炎症中的作
用进行的研究。
1 实验材料
RPM I1640、T rizo l购自 Gibico公司; LPS( Esche richia co-
liO111: B4)和 MTT购自 S igm a公司; HO - 1羊抗鼠多克隆
抗体购自 R&D System s公司; 兔抗鼠多克隆抗体 NF - JB
p65 IgG抗体购自 Santa C ruz公司; M -M LV逆转录酶、
dNTP购自 P romega公司; SYBR G reen 购自 B io tium 公司;
O ligo( dT18)及引物由 Invitrogen公司合成。草木犀于 2006
年 8月在陕西陇县采集,经陈科力教授 (湖北中医学院 )鉴
定后保存于湖北中医学院药学部的植物样本库中。小鼠巨
噬细胞系 RAW 2641 7购自中国典型培养物保藏中心。
2 方 法
21 1 草木犀正丁醇提取物的制备 取 50g风干的草木犀
磨成粉末,用 700mL /L乙醇于 85e 提取 3次 ( 1次 500mL,
201
DOI：10.13193/j.archtcm.2009.01.203.pangr.065
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每次 11 5h ), 真空过滤浓缩提取液, 用去离子水稀释至
1g /m L(药材: 水 )浓度。取 5mL浓缩液至 100mL的分液漏
斗中,连续正丁醇提取直至其干重达 21425g。用 RPM I1640
培养基将其稀释成 3种浓度 10m g /L、5mg /L和 1m g /L备
用。
212 细胞培养 小鼠巨噬细胞系 RAW 26417使用 RP-
M I1640培养液 (加入 100U /mL青霉素, 100m g /L链霉素和
100mL /L胎牛血清 ), 50m L /LCO2培养箱中 37e 培养。
213 细胞模型的建立和干涉 LPS处理前 24h将细胞接
种于 6、24或 96孔板上, 24h后细胞贴壁后弃上清, 加入含
LPS10g /L的培养液和不同浓度的提取物, 作用不同时间后
收集细胞,分别使用免疫细胞化学法, 实时荧光定量 RT -
PCR法, W este rn b lo t法检测。
214 实验分组 实验共分 4组。 ( 1)阳性对照组: 地塞米
松 ( DM ) 015g /L作阳性对照; ( 2)阴性对照组: 黄芪多糖
( APS) 100m g /L作为阴性对照; ( 3)空白对照组: 只用 10g /L
的 LPS处理而不加药物干预; ( 4)正常对照组: 不用 LPS处
理也不加药物干预。
215 药物细胞毒性的检测 MTT法, 在终止细胞培养前
4h加入 20LMTT溶液 (浓度 5g /L, pH714) ,终止细胞培养
后每孔加入 150L DMSO, Spec tram ax 250全自动定量绘图酶
标仪测定 A490值。细胞病变效应 ( cy topa th ic e ffec,t CPE)
检测,细胞在提取液中培养 24h后在显微镜下观察细胞形
态以检测细胞病变。
216 NF -JB的检测 利用免疫细胞化学法 ( SP)检测 NF
-JB的表达及分布变化。将盖玻片置于培养板中, 并将细
胞接种于培养板, 待细胞爬片后, 药物干预细胞 2h。 PBS
洗涤, 4e 丙酮固定 10m in; 30mL /L过氧化氢甲醇溶液孵育
20m in以封闭内源性过氧化物酶; 10mL /L T riton X - 100
37e 5m in, PBS洗涤;加入山羊血清室温孵育 20m in; 然后
加入兔抗鼠多克隆抗体 NF - JB p65 IgG抗体 ( 1B200 ),
4 e 冰箱过夜, PBS洗涤; 加入二抗 (生物素化羊抗兔 IgG,
1B400), 37e 30m in, PBS洗涤; 加入 HRP结合链霉亲合素
( 1B400), 37 e 30m in, PBS洗涤; DAB /H2O 2显色, 苏木素
衬染,常规脱水、透明、封片。
217 血红素加氧酶 1( hem e oxygenase HO -1) mRNA水平
的检测 实时荧光定量 RT - PCR法检测 HO - 1的基因表
达。细胞干预 18h后提取 RNA检测 HO - 1的基因表达
量。细胞总 RNA提取采用 TRIzo l试剂提取法, 具体方法参
照说明书。将 RNA保存在 - 80e 备用。采用 ABI - 7700
序列检测仪。引物序列: Mus -HO - 1: Forw ard: 5c -CACA-
GATGGCGTCACTTCGTC - 3c, Reve rse: 5c - GTGAGGAC-
CCACTGGAGGAG - 3c, M us -B - actin: F orwa rd: 5c-GCTA-
CAGCTTCACCACCACAG - 3c, Reverse: 5c -GGTCTTTACG-
GATGTCAACGTC - 3c。RNA经逆转录反应合成 cDNA, RT
及 PCR反应体系按试剂盒说明书进行。实验结果采用 AB I
- 7700自带软件对数据自动分析后, 用所给 C t值应用公
式 Fo lds= 2- $$C t进行基因表达差异分析 [2 ]。
218 HO - 1蛋白水平的检测 W estern b lo t法检测细胞中
药物干预前后 HO - 1的蛋白表达量的变化。细胞干预 24h
后,冷 PBS洗涤,加入细胞裂解液, 冰上孵育 15m in,细胞刮
刮下并收集裂解液, 10000 r /m in 4e 10m in, 取上清保存于
- 20e 。用 BCA法测定蛋白质浓度, 取相同量蛋白质用
于 100g /L SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳;转移至硝基纤维素膜
50g /L脱脂奶粉溶液 37e 封闭 1h; 羊抗鼠 HO -1多克隆抗
体 ( 1B200), 4e 孵育过夜, 洗膜; 应用辣根过氧化物酶标记
的二抗 ( 1B200)室温孵育 1h,再加入化学发光显色剂显色,
X光片曝光显影, 凝胶成像分析系统扫描, pro31 0软件半
定量分析。
21 9 数据分析 应用 SPSS1210统计分析软件包,采取单
因素方差分析对实验数据进行处理, 以 P < 0105为有统计
学意义。
3 结 果
31 1 药物对细胞的毒性 MTT实验结果显示 3种浓度
( 10m g /L、5m g /L和 1mg /L)药物干预细胞 24h后对细胞活
性没有明显影响。CPE结果亦如此 (图 1)。
A1正常巨噬细胞, B110m g /L药物干预后巨噬细胞
图 1 CPE结果
31 2 药物对 NF -JB的抑制效果 免疫细胞化学法结果
显示:药物干预时, 胞质被染成棕色 (图 2A ~ C ), DM 干预
时,胞质被染成棕色 (图 2D ) ,表示 NF -JB多分布在胞质
未被激活; APS干预时,胞核被染成棕色 (图 2E) ,仅有 LPS
干预时, 胞核被染成棕色 (图 2F ), 表示 NF - JB集中分布
在细胞核表达增强, 说明 APS、LPS能诱导其向细胞核转
位,使 NF -JB活化。
31 3 药物干预前后 HO - 1的 mRNA水平 药物提取物干
预后 HO - 1水平明显升高,并且药物浓度越高, HO - 1水
平越高,呈现一个剂量依赖型关系 (图 3)。
31 4 药物干预前后 HO - 1的蛋白水平 W estern b lo t结果
显示药物干预后 HO - 1的蛋白水平明显升高 (图 4), 之间
的差异有统计学意义 (P < 0101)。
4 讨 论
巨噬细胞在炎症的启动过程中起着非常关键的作用,
它通过激活机体的免疫系统,释放细胞因子、具有生物活性
的脂类介质及活性氧等一系列炎症介质参与炎症反应 [3 ]。
根据其对炎症反应的促进或抑制效应的不同, 这些炎症介
质大致上可分为两类:促炎介质和抗炎介质, 两者的比例关
系及动态变化是决定炎症转归的关键因素 [ 4]。当细胞面
临有毒性的化学物质或病原体侵袭的时候,机体的免疫系
统会释放出 NF -JB。NF - JB是调控众多炎症基因表达
的关键转录因子,其通常以非活性状态存在于细胞质中, 当
细胞受到 TNF、弗波脂等刺激时, NF -JB得以活化并从细
胞质易位到细胞核,启动多种炎症基因表达, 使大量的炎性
细胞浸润于炎症部位 [5]。NF -JB发生核转位是一些免疫
和炎症反应的重要步骤, 应用 NF -JB抑制剂以减少炎症
介质的产生成为治疗炎症的新思路。炎症反应过程中, 在
炎症介质产生的同时抗炎因子 HO - 1也被分泌和活化。
HO - 1是催化血红素降解的限速酶,从而生成胆绿素、游
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ABC1分别代表 10 m g /L、5 m g /L、1 m g /L草木犀正丁醇提取物干预后图片,
D1为地塞米松干预后, E1为 APS干预后, F1为只有 LPS干预后, G1为正常对照.
图 2 免疫细胞化学法观察不同组 NF -JB的位置
离铁和 CO。研究表明,它们不仅能清除机体的活性氧,还
能抑制多种促炎介质的产生, 促进多种抗炎介质的表达,并
且拮抗一些炎症介质的细胞毒效应 [6 ]。
本课题组的前期研究已证实, 草木犀正丁醇提取物能
通过抑制促炎介质和细胞因子 TNF - A、IL - 1、IL - 6、NO
的产生发挥抗炎作用。而这些促炎介质和细胞因子都受
NF -JB的调控, 这就提示草木犀正丁醇提取物可能通过
抑制 NF -JB信号通路而抑制 LPS所致巨噬细胞高水平表
达 TNF -A、IL - 1B等发挥抗炎作用。本实验结果显示
LPS刺激细胞后 NF - JB得以活化并向核内转位, 而药物
干预后 NF -JB以非活性状态存在于胞质中未被激活, 进
一步证实了草木犀正丁醇提取物能通过抑制 NF -JB活化
发挥抗炎作用。同时, 草木犀正丁醇提取物也对抗炎介质
产生一定的影响。本实验结果显示草木犀正丁醇提取物能
促进 HO -1的表达和释放, 且该作用呈剂量依赖性。以上
结果表明,草木犀正丁醇提取物能通过抑制 NF -JB活化,
同时,促进 HO - 1的基因表达和释放而发挥抗炎作用。本
实验选用 DM和 APS分别作为阳性和阴性对照。DM是传
统的抗炎药物; APS是临床上用于增强免疫的免疫调节剂,
能够增强促炎因子的释放 [7]。结果显示, 一定浓度的 DM
可以显著降低 NF - JB活化, 而 APS则没有这方面的作
用,这与文献报道的结果基本一致 [ 8- 9 ]。
本研究从分子水平探讨了草木犀正丁醇提取物的体外
抗炎活性及其可能的分子机制。通过本研究发现, 草木犀
正丁醇提取物能抑制促炎介质的表达, 并促进抗炎介质的
表达,使得促炎 /抗炎介质的比例偏向抗炎一方, 从而产生
广泛的抗炎作用。
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