全 文 ：一九九四年六月
天然产物研究与开发
NT A UR AL PR OD U C I
,
R E S E人 R CH A N D O E V E L O P M E N T V o l 。 6
香港地区红树植物资源研究 ( l )
红树植物 L u m n i t z e r a r a e e m o s a (榄李 )抑制
植物真菌有效成分的分离与鉴定
黄梁绮龄 苏美玲
(香港浸会学院 )
陈培榕
(清华大学化学系 北京 2 0 0 0 8 4 )
摘 要 本文对红树植物揽李 ( uL mn j tze ra ra o m . )茎的 95 % 乙醉提取物进行了抑制植
物真菌 ( F usa ir u m 。 戈 y s p o r u m , eH l ln i n bt 佣 op ir u m . sP , s emt hP y止u m
.
)效能的研究 ,并对其抑
菌有效成份进行了分离与鉴定 ,研究结果表明 ,丹宁 ( at n咖8) (来自水相提取物 )是抑菌
的主要活性组份 ,其它还有黄酮类似物 ,脂肪酸等 (来自于抓仿提取物 )也有一些抑菌能
力 .
关键词 红树植物 ,榄李 ,抑菌效能 ,丹宁
榄李是生长在香港西贡三杯酒地区的一种红树植物 !1[ , 树高约 工. s m一 2 . o m , 树叶四片共
生 ,油润 、 厚实 ,茎外有 白皮 ,茎心为红色 ,分布在含盐量较低 、 远离水域靠近陆地的红树林区的
边缘 。
榄李的生物特性和化学组成与其生长地区及环境有着密切的关系 ,因此 ,对本地区的榄李
进行具体研究很有必要 。本文在研究中将生物活性检验与化学分离紧密地结合起来 , 以使化学
分离有可靠的依据 , 生物检验采用 rD y 一 we ihg t 方法〔 2〕 。 研究结果指出 ,单宁 ( at n in n s )是榄李茎
中含量最多的成份 , 同时也是抑制植物真菌最有效的成份 ,其它组分如黄酮类似物 ,长碳链脂
肪酸等也有一定的抑菌效能 。
材料与方法
1
. 样品处理
榄李样 品采集 于香港西贡三杯酒地 区 , 经 H o n s K o n s H e r比 r ia m A s r i e u xt u r e a n d 曰 s h e n e s
eD .tP 鉴定 。
采集榄李后将茎 、 叶分开 ,取其茎在空气中风干 5 天 ,粉 碎 ,颗粒直径为 0 . 2一 0 . s m m , 在
6 0℃烘 48 小时备用 , 以 95 % 乙醇为溶剂 , 浸取温度为 60 ℃ , 时间为 2峨小时 。 在浸取过程中加
强 搅拌以提高浸取效率 , 95 写乙醇量与样品重量之 比为 5 : l ( v /M ) , 共浸取三次 , 合并浸取
收稿 日期 : J 9 9 3 年 8 月 3 0 日
DOI : 10. 16333 /j . 1001 -6880. 1994. 02. 002
V ol
.
6 NO
。
2
液 ,减压浓缩至干 ,得到棕色固体 ,浸取率为 1 .6 5% 。
2
. 植物真菌来源
生物检验所用的真菌共三种 , 其中 F usa ir u m 。 笨y s p o r u m 是从美国购置的菌种 , 其它两种真
菌 eH lm in ht osP or iu m 印
. 及 set m hP y il u m sP . 是由本实验室从致病植物叶子分离而得闭 , 由香港
浸会学院生物系鉴定 。
3
. 培养介质
本研究工作选用 5 . D . A (劝 b o u r au d 珑xt r ose A ga r ) 作为真菌培养介质 ,三种真菌在该种介
质中都能有适当的生长速度 ,且菌丝生长均匀 。
4
. 生物检验方法
实验采用 D yr 一 w ie hg t 方法 ,即通过测量真菌的重量来计算样品抑制菌丝生长的效能 。 将三
种 植物病源真菌分别接种于含有样品的培养介质 A ga r 的表面 (培养皿中 ) , 30 ℃下培养 5 天
(此时真菌处于线性生长阶段 ) , 然后定量地取 出培养皿中带有菌丝的介质 A ga r , 放入沸水中 ,
A sa r 溶于水中 ,真菌菌丝浮于水面 ,取出真菌菌丝 , 用沸水洗数次 以清洁菌丝表面的 A sa r , 烘
干后称重 ,将得到的真菌重量与空 白相对照 , 二者的菌丝重量之比即为样品抑制真菌的效能 。
结果与讨论
1
. 榄李茎 95 %乙醉提取物的分离
为了研究榄李抑制真菌的有效成份 ,首先必需进行化学分离 ,其分离流程见图
植 物 干 粉
95 % 乙醉浸取液
固体 析 出物 棕色固体
有机相 不溶物 水 相
L C
有机相
L C
燕干
固体粉沫
榄李95 % 乙醉浸取物分离流程
V ol
.
N 6o
.
2
通过化学分离得到了水相提取物 ( A ), 为有光泽的棕 色固体 , 正丁醇提取物 ( B) 以及三氯
甲烷提取物 (C ) ,后两者再经柱层析进一步分离 ,提取物 (B )为棕色固体与 ( A )相似 , 提取物 ( )C
经分离后又得到至少两个以上组份 。
2
. 抑菌能力的检验
( 1) 榄李茎 95 % 乙醇浸取物
称取样品干粉重 。 . 0 7 5 9 及 0 . 7 5 ,分别加到 75 耐 的培养介质 A g ar 中 , 搅拌混溶 ( 目的是
消除 A sa r 一 D if u it on l1[ 带来的影响 ) ,高温灭菌 ,分别倒入三支 中 9 的培养皿中 , 使每支培养皿中
的样品 A g ar 用量为 2 5而 , 以便保持培养皿中真菌生长的介 质有一定的厚度 〔 5〕 , 接种后培养 5
天 , 然后进行生物检验 ,结果列表 1 :
表 1 榄李茎 95 %乙醉浸取物抑菌效能
焦嵘二 F u sa r iu m H e lm i n t h o s OP r i u rn S t e m P h y l l i u mO X y S I洲〕 t U m S p · S p ·` ! ( 8 ) l杯W t ( g ) E此 ( % ) W t ( g ) E f f ( % ) W t (g )1 m g /m l 0 . 0 3 4 7 4 7 . 0 0 . 0 1 2 1 8 8 , 9 0 . 0 0 9 4 8 8 . 3
1 0 m g / m l 0 0 2 2 1 6 6
.
3 0
.
0 0 6 0 9 4
。
5 0
.
0 0 3 9 9 5
.
2
空 白 0 . 0 6 5 5 0 . 0 0 . 1 0 9 2 0 . 0 0 . 0 8 0 4 0 . 0
w t一接种后第五天真菌的重量
E f f ~ (1 一 w t/ w 空 白 ) 又 1 0 0纬为抑菌效能
( 2 ) 水相分离物 ( A )与 ( B )
在化学分离 中 , 为了使水相的组份得到更好的分离 , 又 用等体积的正丁醇与水平衡 . 以使
弱极性的组份分配到正丁醇中 ,将水相和正丁醇相浓缩至干 ,分别得到棕色有光泽的片状物质
( A )和棕色无定形固体 ( B ) ,对分离物 (八 )和 ( B )进行 了生物检验 ,结果列于表 2 :
表 2 水相分离物 ( A )与 (B ) 的抑菌效能
F u sa r i u m H e lm i n th o s po
r i u m S t e m P h y l l i u m
O X y S I〕O f m S p · S P·
W t ( g )
{
一 f ( % ) W t ( g ) E f f ( 环 ) W t ( g ) E f f ( 月 )
分离物 ( A )
1 m g z
产
m l
1 o m 只 /m l
分离物 ( B )
1 m g /m l
1 0 m g / m l
空 白
0
.
0 3 7 4
0
.
0 2 8 1
` 2 . 9 …。 · 。 `刁7
5 7
.
1 一 0 . 0 0 6 5
8 0
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0
.
0 0 9 1 j 8 3
.
7
…。· 。。” 7 1 。 , ,· 。
0
.
0 3 2 5
0
.
0 1 2 3
5 0
. `
{
。 ’ 。 2 2 5
8 1
.
3 1 0
.
0 0 3 8
7 9
。
4
9 6
.
5
0
.
0 0 9 4
0
.
0 0 15
0
.
0 6 5 5 0
.
0 } 0
.
10 9 2 0
.
0 8 0 1
8 8
.
4
9 8
.
1
0
.
0
w t一接种后第五夭真菌的重量
lE f = ( l一 w 叮 w 空白 ) 丫 1 0 0环为抑菌效能
分离物 ( A )与 ( B )对三种真菌皆有明显的抑菌能力 ,二者由于提取过程不同 . 外观有别 、 但
抑菌能 力基本相同 。
V ol
.
6 N o
.
2
(3 )有机相提取物
三氛甲烷萃取液为亮黄色 ,通过减压浓缩至干 , 得到黄绿色固体 (有粘性 ) , 采用 u n ea r 一
gr o w ht :[] 方法进行生物检验 ,样品在培养介质中的浓度为 10 mg /ml , 生物检验结果列于表 3 :
农 3 有机相提取物抑菌效能疏成勺 F us a r i u m H e h刀 i nt h os P o r iu m S证m P h y 】】lu r nO X y 8 P0 lt 的 即。 叩 。sR (m r 。 ) E汪f ( % ) R , ( m r n ) 王盯 (% ) 釉 ( m m ) fE f (% )三氛甲烷提取物 1 7 . 8 1 7 . 2 2 0 . 1 1 3 . 4 1 7 . 1 8 . 6
空 白 2 1 . 5 0 . 0 2 3 . 2 0 . 0 1 8 。 7 0 . 0
sR一接种后第五天真菌生长半径
瓦 f 一 (l 一 sR /R 空 白 x 1 0 0%为抑菌效能
3
. 成分鉴定
( 1) 水相提取物
由水相和正丁醇相得到的分离物 ( A )和 (B )外观为棕色固体粉末 ,都能溶于水 , 尤其易溶
于热水 , 当其与蛋白质水溶液混合时 , 产生白色环状不溶于水的胶冻状物质 , 当它们的水溶液
遇到三抓化铁时立即生成黑色沉淀 ,当往其水溶液中加少量盐酸并加热时 ,有无定形红色沉淀
生成 , 这些化学特征与单宁的化学特征完全吻合 , 因此鉴定分离物 ( A )与 (B )的成分为单宁困 。
单宁是 一类 多元酚的混 合物 , 常以多聚体的形式存在于 多种 植物中 71[ , 它们的红外光谱在
3 4 5 0 c m 一 `处有一个很强且宽的轻基峰 (由于分子内部轻基缔合 ) ,在 80 0 c m 一 ` 一 82 0 c m 一 `处有
表征含有两个相邻氢原子取代苯环的特征峰 ,这与单宁的基本结构是一致的 , 由于它们具有生
物活性一与蛋 白的结合能力 ,因此是一类十分重要的物质 。
( 2) 有机相提取物
三氧甲烷提取物用柱色谱进行分离 , 色谱柱直径为 褪 c m ,长为 5 0 c m ,填料为硅胶 ( 70 一
23 。 目 A s T M ) ,湿法装柱 ,硅胶层高度为 30 c m ,将 0 . 59 样品 (涂敷在硅胶上 )放在色谱柱的顶
端 , 淋洗剂为三氯 甲烷 ,三氯甲烷 50 % + 乙醇 5邺石, 乙醇 , 乙醇 50 % + 甲醇 50 % 、 甲醇 。
馏分 ( I ) : 由三氯 甲烷 50 % + 乙醇 50 %淋洗蒸发后 ,得到的姜黄色粉末状 固体 , 具有典型
的黄酮反应 , 当黄色粉末的乙醇溶液经过镁粉和浓盐酸的还原反应时 (在水浴中加热几分钟 ) ,
溶液迅速由黄色变为红色 ,继而颜色加深 。 当对馏分 ( I )进行 T L C 分离时 ,得到四个不同 R , 值
的斑点 ,呈色情况见表 4 :
表 4 有机相提取物馏分 ( l) 的 T L C 分离
斑 点 sR 可见光下 紫外光下 氮气处理
可见光下 紫外光下
l 0
。
8 7 黄 桔 红 黄 黄 绿
2 0
.
7 4 黄 黄 紫 黄 黄
3 0
.
5 6 无 强荧光 灰 黄 黄 绿
4 0
.
3 1 黄 灰 暗 棕 黄 暗 黄
展开剂 :正丁醇 : 水 : 醋酸一刁 , 5 , l
固定相 :硅胶板
Vo l
.
6 No
.
2
馏分 (I) 甲醇溶液的紫外光谱在 3 70纳米 , 3 5 纳米 (第一吸收带 )及 2 4 纳米 (第二吸收
带 ) 处有深度吸收 , 这与黄酮类似物基本结构相一致闭 , 因此 , 初步认为馏分 ( I )是黄酮类似
物 。 由于取代基的数目和位置有所不 同 , 致使上述各斑点 (或组份 )有不同的 R , 值或呈现不同
的颜色 。
馏分 ( I ) 由乙醇 50 % + 甲醇 50 %淋洗蒸发后得到白色固体 ,它的质谱图特征是 由一系列
峰簇组成 ,峰簇之间差 14 个 质量单位 , 分子离子峰为 m e/ ~ 28 4 , 基峰 m e/ 一 73 , 其它 为 2 5 ,
2 4 1
,
2 2 7
,
2 13
, 一9 9 , 18 5 , 1 7 1 , 1 5 7 , 1 4 3 , 1 2 9 , 1 1 5 , 1 0 1 , 8 7 等 。 分子离子峰的强度较大 , m / e = 2 5 5
的峰是由分 子离子峰 M 十 一 29 得到的 ,这是直链烷基的标志 。 m e/ 一 73 , 1 29 , 1 85 , 2 41 的峰明显
的强 , 它 们对应于 ( C H Z )n C o o H + 中 n ~ 2 , 6 , 10 , 14 的碎 片离 子 。 馏 分 ( I ) 的红外谱 图在
1 7 6 o m 一 ` , 1 72 c0 m 一 `处各有一吸引峰 , 7 2 c0 m 一 `处有长碳链 (CH Z ) 。 的特征峰 , 通过以上谱图的分
析认为此馏分为长碳链脂肪酸 9j[ l[ 。〕 , 以十八碳酸 , 十六碳酸为主 。
研究结果表明 . 榄李茎 95 % 乙醇提取物中的水溶性组份有较强的抑制真菌的效能 。 抗菌
的有效成分为单宁 , 均占提取物重量的 80 % , 可认为榄李是丰富的单宁源 。 由于含单宁 ,可使
红树林带的表土呈微酸性 , 因此 ,可起到抗菌保值的作用 。 另外 ,在榄李茎 95 % 乙醇提取物中
除单宁以外 , 还有黄酮类似物 , 长碳链脂肪酸等组份 ,对三种植物真菌也表现出一定的抑制能
力 。
参 考 文 献
广东省植物研究所编 (广东植被 ) , 1 0 6一 1 2 2页 ( 一9 7 6 )
E l i a be t h m伪 r e 一加 n d eC k e r · ( F u n da m e n at l s o f th e F u n 沙) . P 11 7一 1 5 2 , ( 19 7 2 )
G 即 r g e N , A g r i o s , ( P l a n t P a t h o l o g y ) · T h i r d dE i t i o n . p 2 7 6一 2 8 0 ( 19 8 8 )
V y鸽 · S u b h a s h e · ( S y s t e m i e f u n s i e id e s ) . p 3 2 1一 3 2 3 , ( 1 9 8刁)
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G r 迁 f in , ( F u n g al P h y s i o l o s y ) . p 1 0 2一 1 1 4 , ( 19 8 1 )
林启寿编 (中草药成分化学 ) . 167 一 1 73 页 ( ! 9 7 7)
F e n g
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姚新生 、 陈英杰等编 (有机化合物波谱分析 ) . :l5 一 3 8 页 ( 198 1)
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F r a n e i s
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( P h y toc h
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N C O S TI TU EN TS IN H ON G K ON G M AN GR V O EPL AN T
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C h e n P e i r o n g
(肠脚 : t , n e o t o f 曰如 n is ` ; 梦 ,几 i、 g h u a U , i , ,即 s 艺乙万 ,肠 i j io g 1 0 0 0 8 ,生)
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T h e f u n g i e h os e n w e r e F u泌r i u m o x y sOP ru m , H e lm i n t h% P o r i u m s P . , eS m Ph y ll iu m SP .
Iso l a it o n a n d i d e n t i f i e a ti o n o f C o m op u n d s i n L u m n i t z e r a r a e e m叹 w e r e ep r f o rm e d . T h e at n n in g
t h a t i s o l a ct d f r o m t h e w a t e r e x t r a e t w a s th e m i n e a c t i v e e o n s it t u e n t
·
T h
e fl a v on of d a n d l
o n g e h a i n f a t t y
a e id th a t w e r e i s o la t c d f r o m th e e h l o r o f o r m e x t r a e t h a v e a n t if u n s a l a e t i v i t y a l i t t le
.
K e y w o r d s M a n g r o v
e
P l a n t ; L u m n i tZ e r a r a e e m osa
; A n it f u n g a l a e it v i ty ; T a n n i n g