全 文 ：头花蓼对幽门螺杆菌尿素酶活性及基因表达的影响*
＊
张 岚1，莫 非2＊＊，张 姝2，孙朝琴2，张婉颖2，袁昌增2，陆景润2
(1．铜仁市人民医院 检验科，贵州 铜仁 554300;2．贵州医科大学 医学检验学院，贵州 贵阳 550004)
［摘 要］目的:观察苗药头花蓼对幽门螺杆菌(H． pylori)尿素酶活性及尿素酶编码基因 ureA、ureB表达水平
的影响，探讨头花蓼抑制 H． pylori的可能机制。方法:H． pylori 分为对照组、1 /2 最低抑菌浓度(MIC)、1 /4MIC、
1 /8MIC头花蓼处理组，分别于不含药的 10%脱纤维羊血哥伦比亚血琼脂平板及含 2、1、0. 5 g /L 头花蓼的 10%
脱纤维羊血哥伦比亚血琼脂平板培养 3 代，尿素酶活性比色法定量检测各组 H． pylori 尿素酶活性，Ｒeal-time
PCＲ检测对照组、1 /2MIC头花蓼处理组尿素酶基因 ureA、ureB的 mＲNA水平。结果:头花蓼作用后，处理组 H．
pylori尿素酶活性均显著低于对照组，差异具有统计学意义(P ＜ 0． 05)，且头花蓼的浓度越大，H． pylori尿素酶活
性受抑制的程度也越大;1 /2MIC头花蓼处理后，H． pylori尿素酶编码基因 ureA、ureB mＲNA水平与对照组比较均
显著下调，差异具有统计学意义(P ＜ 0． 05)。结论:苗药头花蓼可通过抑制 H． Pylori尿素酶活性及下调尿素酶
基因 ureA、ureB的表达水平抑制 H． Pylori尿素酶的合成，从而降低 H． Pylori在胃酸环境中的生存能力。
［关键词］苗药;头花蓼;螺杆菌，幽门;尿素酶;基因
［中图分类号］Ｒ965 ［文献标识码］A ［文章编号］1000-2707(2016)10-1204-04
DOI:10． 19367 / j． cnki． 1000-2707． 2016． 10． 019
Effect of Polygonum capitatum on Urease Activity and
Gene Expression of Helicobacter pylori
ZHANG Lan1，MO Fei2，ZHANG Shu2，SUN Zhaoqin2，ZHANG Wanying2，YUAN Changzeng2，LU Jingrun2
(1． Department of Laboratory Science，People＇s Hospital of Tongren，Tongren 554300，Guihou，China;
2． School of Laboratory Science，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，Guizhou，China)
［Abstract］Objective:To observe the effect of Polygonum capitatum on Helicoba-cter pylori (H． py-
lori)urease activity and expression levels of urease gene ureA，ureB，and to discuss the possible
mechanisms． Methods:H． pylori was divided into control group，treatment group by Polygonum capi-
tatum with 1 /2 MIC，1 /4 MIC，1 /8 MIC，cultivated after three generations with defibrinated sheep
blood Columbia blood agar base and same blood agar base contained 2，1，0． 5 g /L Polygonum capita-
tum concentration． Adopting Ｒeal-time PCＲ to detect the mＲNA level of ureA，ureB of 1 /2 MIC and
control group． Ｒesults:After processed by Polygonum capitatum，the H． Pylori urease activity of each
treatment group were significantly lower than that in control group，the difference was statistically sig-
nificant(P ＜ 0． 05)． The more concentrated the Polygonum capitatum was，inhibition level of such ac-
tivity was greater;the mＲNA level of urease gene ureA，ureB of 1 /2 MIC Polygonum capitatum was
significantly down regulated compared with control group，the difference was statistically significant(P
＜ 0． 05)． Conclusion:The Polygonum capitatum can decrease the H． pylori viability in acid environ-
ment by inhibiting the urease activity of H． pylori and downregulating the urease gene encoding ureA
and ureB to inhibit urease synthesizing．
［Key words］Miao medicine;Polygonum capitatum;Helicobacter pylori;urease;gene
4021
第 41 卷 第 10 期
2016 年 10 月
贵 州 医 科 大 学 学 报
JOUＲNAL OF GUIZHOU MEDICAL UNIVEＲSITY
Vol． 41 No． 10
2016． 10
* *［基金项目］高等学校特色专业建设点［(2010)15］;贵州省科技计划课题［黔科合 J字(2014)2027 号］;贵阳市科技计划项目［筑科合同(20141001)号］;
2014 年地方高校国家级大学生创新创业训练计划项目(201410660014) ;2014 年贵州大学生创新创业训练计划项目(201410660014)
＊＊通信作者 E-mail:354406804@ qq． com
网络出版时间:2016 － 10 － 17 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /52． 5012． Ｒ． 20161017． 1445． 002． html
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H． pylori)感染
在世界范围广泛存在，全世界感染人口超过 50%，
我国感染率也高达 40% ～ 90%［1］。H． pylori 感染
与消化性溃疡、慢性胃炎、胃癌及胃黏膜相关性淋
巴样组织淋巴瘤等多种胃肠道疾病密切相关［2］，
关于抑制 H． pylori 感染或根除 H． pylori 治疗的研
究具有重要意义。H． pylori 致病的前提是定植，尿
素酶为 H． pylori 的定植提供适宜的微环境，是 H．
pylor可在胃内酸性条件下长期存在的关键因素。
前期的体外研究已证实头花蓼对 H． pylori 具有良
好的抑菌活性［3］，为进一步探讨其机制，本研究旨
在观察头花蓼对 H． pylori 尿素酶活性及其基因表
达的影响，并探讨其可能机制。
1 材料与方法
1． 1 材料
实验菌株 Hp ATCC700392国际标准测序株，购
自 ATCC(美国菌种保藏中心)，由本课题组保存;苗
药头花蓼浸膏粉，棕色粉末，批号为 20010401，由贵
州威门药业股份有限公司提供。试剂:哥伦比亚血
琼脂粉、脑心浸液粉购于 Oxoid，触酶、氧化酶、尿素
酶购自于梅里埃，ＲNA 反转录试剂盒及荧光定量
PCＲ试剂盒均购于 TaKaＲa，细菌活性蛋白提取试
剂盒及尿素酶活性定量检测试剂盒。
1． 2 方法
1． 2． 1 实验分组 实验分为对照组，1 /2 最小抑
菌浓度(MIC)、1 /4MIC、1 /8MIC 头花蓼处理组，1 /
2 MIC、1 /4MIC、1 /8MIC 头花蓼处理组 H． pylori 分
别在含 2、1、0. 5 g /L 头花蓼的 10%脱纤维羊血哥
伦比亚血琼脂平板培养 3 代。对照组 H． pylori 于
无药的 10%脱纤维羊血哥伦比亚血琼脂平板与处
理组平行培养 3 代。
1． 2． 2 H． pylori 的培养与鉴定 H． pylori 接种于
不含药的哥伦比亚血琼脂，37 ℃恒温箱内培养
(5% O2、10% CO2、85% N2，相对湿度 95%)72 h，
观察菌落形态并鉴定。
1． 2． 3 尿素酶活性的检测 刮取鉴定阳性的细菌
于脑心浸液肉汤中制备成浓度为 1 × 108 ～ 9 ×
108 cfu /mL菌悬液，无菌棉签涂布于空白平皿及 2、
1、0. 5 g /L头花蓼含药平皿上，置于微需氧环境中
37 ℃培养 72 h，同样操作传代于新的平皿，共培养
3 代。分别刮取各组细菌 100 mg 于预冷的无菌
PBS中，5 000 r /min 离心 5 min 收集菌体，按照试
剂盒说明书提取总蛋白，BCA 法测定蛋白质含量，
采用细菌尿素酶活性比色法定量检测试剂盒检测
H． pylori的尿素酶活性。
1． 2． 4 基因表达水平检测 实时荧光定量 PCＲ
检测 H． pylori 基因表达水平。收集在空白平皿及
1 /2MIC(2 g /L)头花蓼含药平皿上传代培养 3 代
的细菌，TＲizol法提取细菌总 ＲNA。用紫外分光光
度计测定 ＲNA纯度及浓度，0. 1%琼脂糖凝胶电泳
检测其完整性，采用逆转录试剂盒对其进行转录。
以对照组和实验组的 cDNA为模板，以 16SrＲNA基
因作为内参，运用 SYBＲ  Premix Ex TaqTMII试剂
盒在 ＲOCHE LightCycler480 荧光定量 PCＲ仪上检
测 ureA、ureB 的表达水平。相关基因引物序列见
表 1。PCＲ反应条件:95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃
20 s，40 个循环。荧光定量 PCＲ 仪采集对照组与
1 /2MIC头花蓼处理组中内参基因 16SrＲNA、尿素
酶基因 ureA、ureB的荧光信号 Ct 值并进行融解曲
线分析，用 EXCEL软件计算 Ct值、ΔΔCt值及相对
表达 量，ΔCT = CT目的基因 － CT内参基因，ΔΔCT =
ΔCT给药组 － ΔCT模型组。
表 1 PCＲ扩增引物序列
Tab． 1 Primers sequence of PCＲ
基因 引物序列(5 to 3 )
16SrＲNA F CCGCCTACGCGCTCTTTAC
16SrＲNA Ｒ CTAACGAATAAGCACCGGCTAAC
ureA F GGTTCAAATCGGCTCACACT
ureA Ｒ CCCGCTCGCAATGTCTAA
ureB F GGTCCTGCTGATGGCACT A
ureB Ｒ GCGTCGTTAGAAGCGTTA CG
1． 3 统计学方法
采用 SPSS 17． 0 软件进行统计学分析，计量资
料用均数 ±标准差(x ± s)表示，两组比较用配对 t
检验，两组间关系采用 Pearson 相关性分析，P ＜
0. 05 为有统计学意义。
2 结果
2． 1 H． pylori尿素酶活性
1 /2MIC、1 /4MIC、1 /8MIC头花蓼处理组 H． py-
lori尿素酶活性与对照组比较均显著降低，差异具
有统计学意义(P ＜ 0. 05)，见表 2。头花蓼的浓度
越大，尿素酶活性受抑制的程度也越大，对药物浓
度与 H． pylori 尿素酶活性进行相关性分析，r =
－ 0. 745，P ＜ 0. 05，表明头花蓼药物浓度与其对 H．
5021
10 期 张 岚等 头花蓼对幽门螺杆菌尿素酶活性及基因表达的影响
pylori尿素酶活性的抑制程度呈剂量相关性。
表 2 头花蓼对 H． Pylori尿素酶
活性的影响(x ± s，n = 6)
Tab． 2 Effect of Polygonum capitatum on
H． Pylori urease activity
组别 尿素酶活性(mU/min)抑制率(%)
1/2MIC头花蓼处理组 191． 25 ± 33． 35(1) 39． 5 ± 9． 7
1/4MIC头花蓼处理组 197． 92 ± 27． 75(1) 37． 4 ± 7． 3
1/8MIC头花蓼处理组 220． 72 ± 24． 76(1) 30． 2 ± 6． 0
对照组 315． 71 ± 9． 71
(1)与对照组比较，P ＜ 0． 05
2． 2 尿素酶基因转录水平
与对照组相比，1 /2MIC 头花蓼处理组尿素酶
基因 ureA、ureB 表达水平分别下调 77%和 73%。
与对照组比较差异有统计学意义，P ＜ 0. 05。见表
3。
表 3 头花蓼对尿素酶基因 ureA、ureB表达
水平的影响(x ± s，n = 6)
Tab． 3 Effect of Polygonum capitatum on the
expression of ureA，ureB gene
组别
2 － ΔΔCT
ureA ureB
对照组 1 1
1 /2MIC头花蓼处理组 0． 228 ± 0． 085(1) 0． 267 ± 0． 031(1)
(1)与对照组比较，P ＜ 0． 05
3 讨论
自 1983 年沃伦和马歇尔［4］首次从慢性胃炎患
者胃黏膜组织中分离培养出 H． pylori以来，H． pylo-
ri一直受到国内外学者的关注。H． pylor 感染不仅
是引起成人类消化性溃疡、慢性胃炎、胃癌及胃黏
膜相关性淋巴组织淋巴瘤等胃肠道疾病的主要因
素，同时还可影响心血管疾病、神经系统疾病、糖尿
病等胃肠外疾病的预后，还是引起儿童生长迟缓的
因素之一［5 － 6］。根除 H． pylori 对于促进消化性溃
疡愈合，降低相关疾病的发生率，提高患者的生活
水平具有重要的意义。中药用于治疗 H． pylori 感
染相关胃肠道疾病由来已久，在抗生素耐药越来越
严重的今天，中药多角度，多环节的作用使得其在
抗 H． pylori治疗方面具有较好的前景。
尿素酶可水解机体代谢产生的废物尿素，产生
氨和 CO2，在许多胃肠道和泌尿系统感染细菌中常
见。H． pylori进入胃内后，可合成大量的尿素酶，
约占菌体总蛋白的 10%，尿素酶分解尿素提供的
氨在菌体周围形成“氨云”保护层为细菌定植提供
微环境。有研究表明尿素酶基因突变导致尿素酶
失活的 H． Pylori突变株不能在低胃酸和正常胃酸
的乳猪胃内定植［7］。H． Pylori 的尿素酶不仅能通
过快速分解尿素产生氨，增加局部 pH 值为细菌生
长提供适宜的微环境，还可激活单核吞噬细胞和刺
激炎症细胞因子的产生，加重局部的炎症反应，介
导细胞形成空泡。这说明 H． Pylori的尿素酶在 H．
pylori的感染过程中具有独特的作用，既是细菌的
定植因子，也是细菌的毒力因子。
H． pylori 尿素酶蛋白由 UreA 和 UreB 组成两
个亚单位组成，基因族共包含 9 个基因，从上游到
下游依次为:ureC、ureD、ureA、ureB、ureI、ureE、
ureF、ureG、ureH，其中 ureA 和 ureB 为结构基因，
ureC和 ureD 位于结构基因之前，ureI、ureE、ureF、
ureG和 ureH为辅助基因，他们一起为尿素酶的活
性表达所必须［8］。本研究中观察到在非致死量头
花蓼药物浓度作用下，尿素酶活性降低，提示苗药
头花蓼对尿素酶活性具有抑制作用，其抑制作用可
能与头花蓼浸膏液中所含的没食子酸、儿茶酚、槲
皮素、黄酮成分对尿素酶的抑制作用有关。头花蓼
中含有没食子酸、儿茶酚、黄酮等成分，各成分在已
有的报道中均具有尿素酶抑制作用。Matsubara S
等［9］报道从绿茶中提取出来的儿茶素类化合物具
有抑制尿素酶活性的作用。彭之云等［10］研究表明
乙基儿茶酚对尿素酶的抑制作用是可逆的，通过与
尿素竞争性结合尿素酶的活性位点使尿素酶活力
受到抑制。而槲皮素等含多酚结构的黄酮类化合
物是尿素酶的非竞争抑制剂，主要通过其多酚结构
与尿素酶活性口袋周围的氨基酸残基结合形成氢
键影响活性口袋上的盖状结构的关闭而表现出对
尿素酶活性的抑制［11］。本实验所用的样本为苗药
头花蓼浸膏，成分多，组分复杂，通过换算后单位体
积内没食子酸和黄酮的含量均不高，头花蓼的尿素
酶抑制活性弱，各浓度药物对 H． pylori尿素酶的抑
制作用都达不到 50%。本实验不能清晰阐述头花
蓼抑制尿素酶活性的机制，后期实验中将头花蓼的
成分进行分离提纯定量后，再进行尿素酶活性抑制
实验，可明确各成分的作用，或可阐明其尿素酶活
性抑制的详细机制。1 /2MIC 头花蓼作用 3 代后，
H． Pylori尿素酶结构蛋白基因 ureA、ureB mＲNA 水
平与平行培养的对照组相比均显著下调。因此推
6021
贵 州 医 科 大 学 学 报 41 卷
测苗药头花蓼还可能通过影响尿素酶基因的转录，
降低 H． Pylori尿素酶的生成量。
综上所述，推测苗药头花蓼除了通过抑制尿素
酶活性降低其催化效率外，还可能通过影响尿素酶
基因的转录，降低 H． Pylori 尿素酶的生成量，进而
降低 H． Pylori在胃内的生存能力。
4 参考文献
［1］张万岱，胡伏莲，萧树东，等． 中国自然人群幽门螺杆
菌感染的流行病学调查［J］． 现代消化及介入诊疗，
2010(5):265 － 270．
［2］Figura N． Extragastric manifestations of Helicobacter pylori
infection［J］． Helicobacter，2010(Suppl 1) :60 － 68．
［3］张姝，罗昭逊，莫非，等．头花蓼对幽门螺杆菌抗菌作用
分析［J］． 中国医院药学杂志，2015(2):113 － 118．
［4］Marshall BJ，Warren JＲ． Unidentified curved bacilli in
the stomach of patients with gastritis and peptic ulceration
［J］． The Lancet，1984(16) :1311 － 1315．
［5］敬柏清，石玲． 生长迟缓儿童幽门螺杆菌感染情况调
查［J］． 检验医学与临床，2014(14):1929 － 1930．
［6］Afifi ＲA，Ali DK，Shaheen IA． A localized case-control
study of extra-gastric manifestations of Helicobacter pylori
infection in children［J］． Indian J Pediatr，2011(4) :
418 － 422．
［7］Eaton KA，Krakowka S． Effect of gastric pH on urease-
dependent colonization of gnotobiotic piglets by Helico-
bacter pylori［J］． Infect Immun，1994(9) :3604 － 3607．
［8］Mobley HL，Island MD，Hausinger ＲP． Molecular biolo-
gy of microbial ureases［J］． Microbiol Ｒev，1995(3) :
451 － 480．
［9］Matsubara S，Shibata H，Ishikawa F，et． al． Suppression
of Helicobacter pylori-induced gastritis by green tea extract
in Mongolian gerbils［J］． Biochemical and Biophysical
Ｒesearch Communications，2003 (3) :715 － 719．
［10］彭知云，王旭东，冯玉婷，等． 4 － 4_羟基苯基-乙基儿
茶酚作为尿素酶抑制剂的机理［J］． 吉首大学学报，
2012(6):85 － 88．
［11］Xiao ZP，Wang XD． Molecular docking，kinetics study
and structure-activity relationship analysis of quercetin
and its analogous as Helicobacter pylori urease inhibitors
［J］． J Agric Food Chem，2012(42) :10572 － 10577．
(2016－07－30 收稿，2016－09－25 修回)
中文编辑:周 凌;英文编辑:赵

毅
(上接第 1203 页)
［13］Palmer GD，Steinert A，Pascher A，et al． Gene-induced
chondrogenesis of primary mesenchymal stem cells in
vitro［J］． Mol Ther，2005(2):219 － 228．
［14］Kawamura K，Chu CＲ，Sobajima S，et al． Adenoviral-
mediated transfer of TGF-beta1 but not IGF-1 induces
chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem
cells in pellet cultures［J］． Exp Hematol，2005(8) :865
－ 872．
［15］Murphy MK，Huey DJ，Hu JC，et al． TGF-β1，GDF-5，
and BMP-2 stimulation induces chondrogenesis in ex-
panded human articular chondrocytes and marrow-derived
stromal cells［J］． Stem Cells，2015(3) :762 － 773．
［16］Tian HT，Zhang B，Tian Q，et al． Construction of self-
assembled cartilage tissue from bone marrow mesenchymal
stem cells induced by hypoxia combined with GDF-5［J］．
J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2013(5) :700
－ 706．
(2016－08－28 收稿，2016－09－25 修回)
中文编辑:刘 平;英文编辑:刘 华
7021
10 期 张 岚等 头花蓼对幽门螺杆菌尿素酶活性及基因表达的影响