全 文 ：中药头花蓼对幽门螺杆菌 CagA及 VacA表达的影响*
＊
张 雁1，张 姝1，罗昭逊1，孙朝琴2，渠 巍3，熊丽娟4，莫 非2＊＊
(1．贵阳医学院 医学检验学院，贵州 贵阳 550004;2． 贵阳医学院 医学检验学院 临床检验教研室，贵州 贵阳 550004;3．贵阳市妇幼保
健院 检验科，贵州 贵阳 550003;4．贵阳中医学院第二附属医院 检验科，贵州 贵阳 550004)
［摘 要］目的:观察中药头花蓼对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H． pylori)细胞毒素相关蛋白(cytotoxin-asso-
ciated protein，CagA)和空泡毒素(vacuolating cytotoxin，VacA)表达的影响。方法:H． pyloriATCC700392 接种于含
头花蓼的哥伦比亚血平板上为实验组，同批未经药物作用的 H． pyloriATCC700392 为对照组，分别提取两组细菌
的 ＲNA和蛋白，用 Ｒeal-time PCＲ定量检测头花蓼作用后 cagA和 vacA的 mＲNA表达，ELISA检测蛋白表达量。
结果:经头花蓼作用的实验组与对照组相比，H． pylori的 CagA和 VacA蛋白表达水平分别降低了 36． 4%、55． 1%
(P ＜ 0． 05)，cagA和 vacA的 mＲNA表达水平分别降低了 69%、51%(P ＜ 0． 05)。结论:头花蓼可能通过下调 ca-
gA和 vacA的 mＲNA和蛋白的表达来发挥其对 H． pylori的抑制作用。
［关键词］头花蓼;螺杆菌，幽门;细胞毒素相关蛋白;空泡毒素
［中图分类号］Ｒ378;Ｒ961 ［文献标识码］A ［文章编号］1000-2707(2015)05-0455-04
Effect of Chinese Medicine Polygonum capitatum on
Expression of Helicobacter pylori CagA and VacA
ZHANG Yan1，ZHANG Shu1，LUO Zhaoxun1，SUN Chaoqin2，QU Wei3，XIONG Lijuan4，MO Fei2
(1． College of Laboratory，Guiyang Medical College，Guiyang 550004，Guizhou，China;2． Department of Clinical Laboratory，
College of Laboratory，Guiyang Medical College，Guiyang 550004，Guizhou，China;3． Department of Laboratory，Guiyang
Maternal and Child Health-care Hospital，Guiyang 550004，Guizhou，China;4． Department of laboratory，Second
Hospital Affiliated to Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550004，Guizhou，China)
［Abstract］Objective:To study the effect of traditional Chinese medicine Polygonum capitatum on
expression of cagA and vacA of Helicobacter pylori (H． pylori)． Methods:H． pylori ATCC700392
vaccinated in Colombia blood AGAＲ containing Polygonum captitatum was defined as experimental
group，while the same batch H． pylori ATCC700392 without Polygonum captitatum as control group．
After continuous and stable culture，bacterial ＲNA and protein were extracted respectively in two
groups． Ｒeal － Time PCＲ was adopted to detect the mＲNA expression of cagA and vacA，and ELISA
was used to detect the protein expression of CagA and VacA． Ｒesults:Compared with control group，
the protein expression of CagA and VacA in experimental group decreased 36． 4% and 55． 1%，re-
spectively(P ＜ 0． 05)，while mＲNA expression levels also decreased significantly，69% and 51%，re-
spectively(P ＜ 0． 05)． Conclusion:Polygonum captitatum possibly exerts its inhibitory effect on H．
pylori through inhibiting the expression of cagA and vacA．
［Key words］Polygonum capitatum;Helicobacter pylori;cytotoxin-associated protein;vacuolating cy-
totoxin
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第 40 卷 第 5 期
2015 年 5 月
贵 阳 医 学 院 学 报
JOUＲNAL OF GUIYANG MEDICAL COLLEGE
Vol． 40 No． 5
2015． 5
* *［基金项目］高等学校特色专业建设项目［(2010)15］;贵州省科技厅、贵阳医学院联合基金资助项目［黔科合 LG(2012)054 号］和［黔科合 LG(2012)012
号］;贵州省科技计划课题［黔科合 J 字(2014)2027 号］;贵阳医学院附属医院博士基金(2014) ;贵州省 2014 年大学生创新创业训练计划项目
(201410660014);2014 年地方高校国家级大学生创新创业训练计划项目(201410660014)
＊＊通信作者 E-mail:354406804@ qq． com
网络出版时间:2015 － 05 － 21 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /52． 5012． Ｒ． 20150521． 1248． 016． html
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H． pylori)感染
在世界范围内广泛存在，发展中国家感染率高达
90%，在我国成人 H． pylori 感染率超过 70%［1］。
H． pylori的细胞毒素相关基因(cytotoxin associated
gene，cagA)和空泡毒素基因(vaculating toxin gene，
vacA)及其表达产物与 H． pylori 感染的临床发展有
密切关系［2］。cagA 是 H． pylori 的重要毒力因子，
与慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌等疾病均有密切关
系［3 － 4］。vacA的基因亚型及其表达水平与菌株的
致病性有密切的关系，目前 cagA 和 vacA 基因及其
蛋白已成为 H． pylori 致病机制中的研究热点［5］。
中药头花蓼是贵州苗族民间常用的一种中药材，目
前已通过大量的体内外实验证实其具有抗 H． pylo-
ri的作用，本实验旨在检测头花蓼对 H． pylori 的
cagA和 vacA基因的转录水平及蛋白表达的影响，
探讨头花蓼对 H． pylori的主要毒性因子的作用。
1 材料与方法
1． 1 实验材料
苗药头花蓼浸膏粉，棕色粉末，批号 20010401，
生药含量为 8. 72 g /g，由贵州威门药业股份有限公
司提供;幽门螺杆菌 ATCC700392 国际标准测序
株，购自 ATCC(美国菌种保藏中心)，由本课题组
保存。哥伦比亚血琼脂粉、脑心浸液粉(OXOID) ，
脱纤维灭菌羊血(广州蕊特生物科技有限公司) ，
万古霉素、两性霉素、多粘菌素 B、TMP、冷冻高速
离心机(Sigma) ，触酶、氧化酶(梅里埃公司) ;蛋白
提取试剂、ＲNA反转录试剂盒、荧光定量 PCＲ试剂
盒、Lysozme、DNase、DTT、PMSF(上海生工工程股
份有限公司)，BCA 工作试剂(碧云天有限公司) ，
CagA ELISA KIT、VacA ELISA KIT(大连宝生物公
司)，TE 缓冲液、Trizol(Solarbio) ，三气培养箱
(Thermo) ，酶标仪(BIOＲAD) ，荧光定量 PCＲ 仪
(德国 ＲOCHE)。
1． 2 实验方法
1． 2． 1 细菌培养与鉴定
从 －80 ℃冰箱中取出幽门螺杆菌 ATCC 700392，
室温溶解后倾倒于哥伦比亚血琼脂平皿内，均匀涂
布，37 ℃三气培养箱内培养 72 h(5% O2、10%
CO2、85% N2，相对湿度 95%以上 ) ，观察细菌生
长情况，稳定传代 3 次后进行革兰染色、尿素酶、触
酶和氧化酶的鉴定。
1． 2． 2 实验分组
实验组:生长良好的 H． pyloriATCC700392 接
种于含 1 /2 最低抑菌浓度(MIC)头花蓼含药平板
上连续培养 3 代，72 h /代;对照组:同批未经药物
作用的 H． pyloriATCC700392，连续培养 3 代，72 h /
代。
1． 2． 3 CagA和 VacA蛋白检测
H． pylori 蛋白的提取及定量 将生长良好的每
组细菌刮取于离心管中离心后收集细菌沉淀，按每
100 mg 的菌体加入 0. 5 mL 的提取试剂，吹打均
匀，将其放置摇床上室温震荡 20 min 再次离心后
收集上清液;再加入提取试剂重复提取一次，将两
次提取的上清液合并，配制浓度梯度的标准品，根
据标准曲线计算出蛋白浓度。ELISA 按 CagA
ELISA KIT、VacA ELISA KIT说明书取原倍标准品
依次倍比稀释，同时将样品稀释 2 倍，分别设空白
孔、标准孔、待测样品孔进行操作，450 nm 波长测
量各孔的吸光度(D 值);以样品吸光度值为纵坐
标，浓度为横坐标，用 Excel 表格制作标准曲线;实
验重复 3 次。
1． 2． 4 cagA和 vacA基因检测
1． 2． 4． 1 提取 mＲNA 将两组标本用脑心浸液肉
汤调细菌悬液至 108 CFU /mL，取标本 1 mL 离心，
去上清后用 Trizol法提取标本的 mＲNA，室温干燥
5 min加入 20 μL TE 缓冲液，充分溶解 mＲNA;取
2 μL mＲNA加入 98 μL TE缓冲液稀释 50 倍后在
紫外分光光度仪下检测 ＲNA 浓度及 D260 /D280比
值。
1． 2． 4． 2 Ｒeal-time PCＲ 根据 TaKaＲa 逆转录试
剂盒操作说明将 mＲNA反转录为 cDNA，所有操作
均在冰上进行。应用 SYBＲ  Premix Ex TaqTMII
试剂盒在 ＲOCHE LightCycler480 荧光定量 PCＲ 仪
上检测，以对照组和实验组的 cDNA 为模板，分别
扩增内参基因 gryB(DNA旋转酶 B 亚单位 )与靶
基因 cagA、vacA。引物由上海捷瑞生物工程有限公
司合成(表 1)。
表 1 PCＲ引物序列
Tab． 1 Primer sequences for each genes
基因 引物序列(5 to 3) 产物大小(bp)
gryB F1 CCCTAACGAAGCCAAAATCA
192
gryB Ｒ1 GCACTATCGCCCTCCACTAA
cagA F1 ATAATGCTAAATTAGACAACT
213
cagA Ｒ1 TTAGAATAATCAACAAACATC
vacAF1 ATGCCGCCTTTTTCACAACC
204
vacAＲ1 ACGGCCCATCCACACATTAC
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贵 阳 医 学 院 学 报 40 卷
1． 3 统计处理
采用 SPSS 11． 5 统计软件对数据进行统计处
理，计量资料用均数 ±标准差(x ± s)表示，组间比
较采用 t检验，P ＜ 0. 05 为差异有统计学意义。
2 结果
2． 1 H． pylori菌株的培养与鉴定
H． pylori国际标准测序株 ATCC 700392 在普
通哥伦比亚血平皿上培养 72 h 后，菌落细小呈针
尖状、无色半透明、光滑湿润。涂片革兰氏染色后
镜检，细菌为螺旋状、S形或弧形的革兰氏阴性菌，
生化鉴定试验尿素酶、氧化酶、触酶均为阳性(图
1)。
2． 2 头花蓼对 H． pylori 的 CagA 和 VacA 蛋白水
平的影响
经头花蓼作用后 CagA和 VacA的蛋白表达水
平明显降低，与对照组相比，CagA、VacA 表达量分
别降低了 36. 4%、55. 1%，差异有统计学意义(P ＜
0. 05)。见表 2。
注:A为油镜下 H． pylori形态，B为 H． pylori 触酶试验，C为 H． pylori 氧化酶试验，D为 H． pylori尿素酶试验
图 1 H． pylori菌株的培养与鉴定
Fig． 1 Culture and identification of H． pylori strains
表 2 头花蓼作用后 CagA和 VacA的蛋白表达量
Tab． 2 H． pylori CagA and VacA protein
expression in Polygonum captitatum
组别 样本数 CagA(ng /L) VacA(μg /L)
对照组 3 29． 077 ± 0． 232 28． 896 ± 0． 970
实验组 3 18． 497 ± 0． 288(1) 12． 982 ± 0． 541(1)
(1)与对照组相比，P ＜ 0． 05
2． 3 头花蓼对 H． pylori 的 cagA 和 vacA mＲNA 水
平的影响
Ｒeal-timePCＲ显示 gryB 和 cagA、vacA 融解曲
线均为单峰，表明 PCＲ 扩增为特异性扩增。经头
花蓼作用后 cagA和 vacA的 mＲNA表达水平下降，
与对照组相比，cagA、vacA 表达量分别降低了 69%
和 51%(P ＜ 0. 05)。见表 3。
表 3 头花蓼作用后 cagA和 vacA 基因表达
Tab． 3 H． pylori cagA and vacA gene expression
in Polygonum captitatum
基因 样本数 对照组 实验组 2 －△△CT
gryB 3 17． 69 ± 0． 05 18． 43 ± 0． 09 1
cagA 3 21． 23 ± 0． 33 22． 49 ± 0． 07 0． 69(1)
vacA 3 21． 87 ± 0． 22 23． 59 ± 0． 04 0． 51(1)
(1)与对照组相比，P ＜ 0． 05
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5 期 张 雁等 中药头花蓼对幽门螺杆菌 CagA及 VacA表达的影响
3 讨论
头花蓼具有清热利湿、解毒止痛、和血散瘀、利
尿通淋等功效，其主要成分黄酮类化合物(FVD)
有调节多药耐药、抗肿瘤、抗炎、抗微生物等多种活
性;头花蓼的另一种主要成分为没食子酸，可能通
过特异性地凝固细菌蛋白、破坏细菌细胞膜结构
等，从而改变细菌生理状态达到抗菌作用［6］。本
研究小组体外抗菌活性实验研究证实头花蓼水提
物对幽门螺杆菌 ATCC700392 有较好的抗菌活性，
MIC为 4 g /L。与已研究的传统单味中药比较发
现，头花蓼抗 H． pylori 的活性优于田基黄提取物、
苦参、金银花等。
CagA阳性菌与胃炎的严重程度有关联，与胃
癌的风险高度相关，在胃炎发展成胃癌过程中起着
重要作用［7 － 8］。CagA 被注入胃黏膜细胞内，通过
多个途径从多方面引起黏膜细胞的损伤。比如细
胞极性改变，骨架重组，它还能使细胞从 G1 期转
向 S期，引起细胞增殖异常、转化等［9］。VacA可使
胃黏膜上皮发生空泡样变性，坏死;此外，VacA 还
能特异地抑制细胞的增殖，使胃溃疡的愈合延迟，
并使其愈合后的斑痕较差［10］。有研究显示 CagA
和 VacA具有高度相似的分子系统发育树，并且所
有 H． pylori菌株在系统发育树中具有相同的分布
特点，因此 cagA和 vacA基因可能具有共进化的遗
传关系［11］。
本实验结果显示头花蓼作用 H． pylori 后 cagA
和 vacA在基因转录及蛋白表达水平方面均发生显
著下调(P ＜ 0. 05)，但 cagA 和 vacA 的 mＲNA 表达
水平比 CagA和 VacA的蛋白表达水平下调幅度明
显。推测中药头花蓼抑制 H． pylori 生长的机制可
能是通过下调其 cagA和 vacA的 mＲNA转录水平，
由转录下调而引起 CagA 和 VacA 的蛋白水平下
调，从而达到对 H． pylori 进行抑制，也可能是头花
蓼分别下调 cagA、vacA 的基因转录和 CagA、VacA
的蛋白翻译过程，从两个调控水平分别对 H． pylori
起抑菌作用。H． pylori 感染后能引起慢性胃炎，有
部分感染者终生携带该菌，细菌的毒力和宿主的免
疫力处于一种动态平衡状态。中药头花蓼下调 H．
pylori主要毒力因子 CagA 和 VacA 的表达，在细菌
和宿主的平衡中间接地支持宿主一方，虽不能彻底
消灭细菌，但对抗菌、减轻细菌对宿主的损害起到
重要作用。目前的研究多以西药体内抑制 H． pylo-
ri为主，药物对 H． pylori主要毒力因子的抑制方面
探索较少，而用中药去抑制 H． pylori的两个主要毒
力因子 CagA和 VacA 的研究未见报道，因此该研
究或能够为中药抗 H． pylori 的机理提供了有价值
的线索。
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(2015－03－02 收稿，2015－05－01 修回)
中文编辑:周 凌;英文编辑:刘 华
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