全 文 ：大连医科大学学报 2016 年第 38 卷第 3 期(Journal of Dalian Medical University Vol． 38 No． 3，2016) 215
基金项目:国家自然科学基金项目(81101682) ;广东省公益研究与能力建设专项资金项目(2014A020212015)
作者简介:谢闺娥(1981 －) ，女，湖南邵阳人，讲师。E － mail:guier2003@ 126． com
通信作者:徐 霞，教授。E － mail:xux2014@ 126． com
论 著 doi:10． 11724 / jdmu． 2016． 03． 02
扁蒴藤素对人乳腺癌 MCF － 7 细胞生长和
凋亡的影响及机制研究
谢闺娥1，杜晶春1，徐 霞1，董桂兰2
(1．广州医科大学 金域检验学院，广东 广州 510182;2．广州大学 门诊部，广东 广州 510006)
［摘要］ 目的 研究扁蒴藤素对乳腺癌细胞 MCF － 7 生长和凋亡的影响及其机制。方法 用 MTT 法检测扁
蒴藤素对 MCF － 7 细胞细胞生长的影响;用 Annexin V － FITC /PI 双染及 TUNEL 染色检测扁蒴藤素对 MCF － 7
凋亡的诱导作用;用 western blot分析扁蒴藤素作用后，凋亡相关因子 Bcl － 2 和 Bax蛋白的表达变化。结果 扁
蒴藤素对 MCF － 7 细胞的生长有显著的抑制作用，对其作用 48 h 的半数抑制浓度(IC50)为 0． 59 μmol /L。1． 0
μmol /L扁蒴藤素作用后，Annexin V － FITC /PI染色凋亡细胞比率(15． 55 ± 1． 43)%，TUNEL 阳性的MCF － 7 细
胞比率为(35． 59 ± 4． 43)%，较对照组(未经扁朔藤素作用) ［(1． 45 ± 0． 24)%和(0． 85 ± 0． 34)%］明显升高，差
异均有显著性意义，P ＜ 0． 05。Western blot结果显示，扁蒴藤素能下调 Bcl － 2 的表达，上调 Bax的表达。结论
扁蒴藤素素通过调节细胞凋亡相关因子诱导 MCF － 7 细胞凋亡的发生，从而高效抑制 MCF － 7 乳腺癌细胞的生
长。
［关键词］ 扁蒴藤素;乳腺癌;MCF － 7;凋亡
［中图分类号］ Ｒ737． 9 ［文献标志码］ A 文章编号:1671 － 7295(2016)03 － 0215 － 04
［引用本文］ 谢闺娥，杜晶春，徐霞，等． 扁蒴藤素对人乳腺癌 MCF － 7 细胞生长和凋亡的影响及机制研究
［J］．大连医科大学学报，2016，38(3) :215 － 218．
Effect of pristimerin on the growth and apoptosis of MCF － 7
breast cancer cells and the mechanism
XIE Gui － e1，DU Jing － chun1，XU Xia1，DONG Gui － lan2
(1． KingMed School of Laboratory Medicine，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510182，Chi-
na;2． Outpatient Department，Guangzhou University，Guangzhou 510006，China)
［Abstract］Objective To investigate the effect of pristimerin on the growth and apoptosis of MCF － 7 breast cancer
cells and to explore the underlying mechanism． Methods The effect of pristimerin on the growth and of apoptosis
MCF － 7 cells were analyzed by MTT assay and Annexin V － FITC /PI staining，TUNEL staining，respectively． The ex-
pression of Bcl － 2 and Bax was determined by western blotting analysis． Ｒesults Pristimerin exhibited a marked inhibi-
tion on the survival of MCF － 7 cells，and the half maximal inhibitory concentration (IC50)value was 0． 59 μmol /L．
The numbers of apoptotic MCF － 7 cells，as revealed by Annexin V binding and TUNEL assay，increased upon pristim-
erin treatment． Pristimerin treatment resulted in a decrease of Bcl － 2 and an increase of Bax expression． Conclusion
Our results demonstrated that pristimerin suppressed the proliferation of MCF － 7 cells，and that these effects occurred
through increasing apoptosis by regulation of apoptotic effectors．
［Key words］pristimerin;breast cancer;MCF － 7;apoptosis
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，发病率呈缓慢
上升趋势，在许多西方国家中，乳腺癌的发病率占女
性癌肿的首位［1］。化疗是治疗乳腺癌的重要辅助
性手段，化疗能够明显降低乳腺癌的术后复发率，对
晚期乳腺癌失去根治机会者采用化疗也有明显的缓
解率。但是，多药耐药性的产生往往限制了常用化
疗药物的使用［2］。
南蛇藤(Celastrus orbiculatus Thunb．) ，又名过山
216 谢闺娥，等:扁蒴藤素对人乳腺癌 MCF － 7 细胞生长和凋亡的影响及机制研究
风、黄藤、降龙草、金银柳、穷搅藤、苦树皮、七寸麻、过
山龙、地南蛇、老牛筋等，是卫矛科南蛇藤属植物。扁
蒴藤素(Pristimerin)主要存在于南蛇藤的根皮中，研
究表明其具有广谱抗肿瘤［3 － 8］、抗炎［8］、抗氧化［9］及
其它多种药理活性。2008年扁蒴藤素被进一步证实，
可通过抑制蛋白酶体活性而发挥抗肿瘤作用，是新型
的蛋白酶体抑制剂［10］。其对乳腺癌的作用及其机制
尚未完全明确。本研究以最常用的乳腺癌细胞系
MCF －7为模型，探讨扁蒴藤素对 MCF － 7 生长的影
响及其可能的作用机制，以期为探索新的乳腺癌高效
化疗药物提供实验依据。
1 材料和方法
1． 1 主要材料与试剂
人乳腺癌 MCF －7细胞系购自 ATCC，扁蒴藤素、
二甲基亚砜(DMSO)、碘化丙啶 (PI)购自美国 Sigma
公司;胎牛血清(FBS)为美国 Hyclone 公司产品;
DMEM培养基、胰蛋白酶为美国 Gibco 公司产品;
MTT购自美国 Genview 公司;Annexin V － FITC /PI
细胞凋亡检测试剂盒、DeadEndTM Fluorometric
TUNEL试剂盒购自美国 Ｒoche 公司;BCA 蛋白定量
试剂盒、ECL 化学发光液购自美国 Pierce 公司;Bax
和 Bcl －2 抗体购自美国 Cell Signaling 公司;鼠抗人
GAPDH购自 Sigma公司;HＲP标记抗鼠二抗和 HＲP
标记抗兔二抗为 Pierce公司产品。
1． 2 细胞培养
人乳腺癌细胞株 MCF － 7 于含 10% FBS、100
IU /mL青霉素和 100 μg /mL 链霉素的 DMEM 完全
培养基中，37 ℃，5%CO2 饱和湿度孵箱内培养。传
代用含 0． 02% EDTA 的 0． 05%胰酶消化，以 DMEM
完全培养基终止消化。
1． 3 MTT比色法
取对数生长期的细胞，胰酶消化，制成单细胞悬
液，调整细胞浓度为 5 × 104 个 /mL;每孔种 200 μL
细胞悬液于 96 孔培养板内，培养 24 h，吸去旧培养
液，加入含不同浓度扁蒴藤素(设 7 个不同浓度:
0． 1、0． 5、1、2． 5、5、10 和 20 μmol /L)的培养基，同时
设立对照组，正常培养基，每组均设 3 个平行孔培
养;48 h，每孔加 MTT(5 mg /mL)20 μL，培养 4 h;小
心吸弃培养基，加入 100 μL DMSO置摇床上低速振
荡 10 min;酶联免疫检测仪在 570 nm波长处测定其
吸光度(OD)值，按下述公式计算生长抑制率:抑制
率(%)=(1 － OD加药组 / OD对照组)× 100%，并
用 Bliss＇s软件计算半数抑制浓度(IC50)值
［11］。
1． 4 Annexin V － FITC /PI染色
取对数生长期的人乳腺癌细胞 MCF － 7，实验
组加入扁蒴藤素终浓度为 1． 0 μmol /L的培养基，对
照组加入正常培养基，培养 8 h，用不含 EDTA的胰
蛋白酶消化，制成单细胞悬液，1 × binding buffer 悬
浮细胞至 1 × 106 个 /mL，取 100 μL细胞悬液加入 5
μL Annexin V － FITC 和 10 μL PI，混匀，室温避光反
应 15 min;加入 400 μL 1 × binding buffer充分混合，
流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
1． 5 TUNEL染色
将 MCF － 7 细胞消化后计数，按每孔 1． 0 × 105
个细胞分别接种至已铺有盖玻片的 24 孔细胞培养
板中，培养过夜;实验组加入终浓度为 1． 0 μmol /L
的扁蒴藤素，对照组正常培养，培养 24 h，弃去培养
基，加入 4%多聚甲醛，4 ℃固定细胞 25 min;PBS
洗涤 3 次，每次 5 min;用 0． 2% Triton X － 100 处理
5 min;PBS洗涤 3 次，每次 5 min;尽量吸去多余液
体，滴加 100 μL 平衡缓冲液覆盖细胞，平衡 5 ～ 10
min;配制 rTdT 反应缓冲液(45 μL Equilibration
Buffer + 5 μL Nucleotide Mix + 1 μL rTdT Enzyme)/
每孔;吸弃平衡缓冲液，将 50 μL rTdT 反应缓冲液
滴加至细胞上，将 24 孔板放入湿盒中反应，37 ℃孵
育 1 h，注意避光(以下步骤均需) ;吸弃反应液，加
入 2 × SSC 室温作用 15 min 以终止反应;室温下，
PBS洗涤 3 次，每次 5 min;加入 1 μg /mL PI 室温下
避光作用 15 min;PBS洗涤 3 次，每次 5 min;吸尽多
余的水分，将盖玻片上的细胞避光干燥过夜，次日加
Anti － Fade封片;在荧光显微镜下进行观察，TUNEL
染色阳性荧光信号呈绿色，PI荧光信号呈红色。
1． 6 Western blot实验
分别收集 1． 0 μmol /L 的扁蒴藤素处理组和对
照组 MCF － 7 细胞，PBS 洗涤后加入细胞裂解液提
取细胞总蛋白，经 BCA 法蛋白定量后，western blot
法检测 Bcl-2 和 Bax 蛋白表达水平。制备 SDS －
PAGE胶，电泳，转膜。5%脱脂奶粉对 PVDF 膜进
行封闭后，一抗 4 ℃孵育过夜，洗涤后用 HＲP 标记
的二抗室温孵育 1 h，再次洗涤后以 ECL 试剂盒发
光、X线胶片感光显影后观察结果。GAPDH为内参
照。
1． 7 统计学方法
采用 SPSS 13． 0 进行数据处理及统计分析。数
据均以均值 ±标准差表示，两组间的比较采用 t 检
验，P ＜0． 05为差异有统计学意义。
2 结 果
2． 1 扁蒴藤素对 MCF －7 细胞生长的影响
大连医科大学学报 2016 年第 38 卷第 3 期(Journal of Dalian Medical University Vol． 38 No． 3，2016) 217
MTT比色结果表明，扁蒴藤素对 MCF － 7 细胞
的生长有显著的抑制作用，当药物浓度为 1． 0
μmol /L 时，对 MCF － 7 细胞的生长抑制率为
73． 88%，48 h的 IC50为 0． 59 μmol /L。见图 1。
图 1 扁蒴藤素对 MCF － 7 细胞生长抑制曲线
Fig 1 Dose － response curve of pristimerin on the growth of
MCF － 7 cells
2． 2 扁蒴藤素对 MCF －7 细胞凋亡的影响
Annexin V － FITC /PI双染法结果显示，MCF － 7
细胞经扁蒴藤素作用 8 h 后，凋亡细胞比率
(15． 55 ± 1． 43)%较对照组(1． 45 ± 0． 24)%明显升
高，差异有显著性意义，P ＜ 0． 05。见图 2。
TUNEL结果显示，未经扁蒴藤素作用的对照组
几乎未见 TUNEL 染色阳性细胞;经扁蒴藤素作用
24 h后，TUNEL染色阳性细胞率(35． 59 ± 4． 43)%
较对照组(0． 85 ± 0． 34)%明显增加，差异有显著性
意义，P ＜ 0． 05。见图 3。
2． 3 扁蒴藤素对细胞凋亡相关因子的调节
Werstern blot 分析表明，扁蒴藤素能够下调
Bcl － 2的表达，上调 Bax的表达。见图 4。
图 2 Annexin V － FITC /PI染色检测扁蒴藤素对 MCF － 7 细胞的凋亡诱导作用
Fig 2 Annexin V － FITC /PI staining of MCF － 7 cells treated with pristimerin
A:Annexin V － FITC /PI染色流式细胞分析图;B:凋亡细胞比率统计图。* 与对照组比较，P ＜ 0． 05
图 3 TUNEL染色检测扁蒴藤素对 MCF － 7 细胞的凋亡诱导作用
Fig 3 TUNEL assay of MCF － 7 breast cancer cells treated with pristimerin
A:TUNEL荧光染色图(× 200) ;B:TUNEL染色阳性细胞比率统计图。* 与对照组比较，P ＜ 0． 05
图 4 扁蒴藤素对 MCF － 7 细胞 Bcl － 2 和 Bax蛋白的影响
Fig 4 Effect of pristimerin on the expression of Bcl － 2 and Bax
in MCF － 7 cells
3 讨 论
作为发病率占女性癌肿首位的恶性肿瘤，乳腺
癌严重威胁着女性的健康。临床上使用化疗药物进
行治疗时，肿瘤对化疗药物的耐药性严重影响了治
疗效果［2］。
作为药用南蛇藤的重要活性成分，扁蒴藤素能
够抑制多种肿瘤细胞的恶性增殖［3 － 8］。而本实验研
究了扁蒴藤素对乳腺癌 MCF －7 细胞生长和凋亡的
218 谢闺娥，等:扁蒴藤素对人乳腺癌 MCF － 7 细胞生长和凋亡的影响及机制研究
影响，结果表明扁蒴藤素对 MCF － 7 细胞的生长也
具有很强的抑制作用。经扁蒴藤素作用后，Annexin
V － FITC 染色和 TUNEL 染色阳性的 MCF － 7 细胞
比例均增高，表明扁蒴藤素能诱导 MCF － 7 细胞凋
亡的发生。
为进一步探讨扁蒴藤素对肿瘤细胞可能的作用
机制，对细胞凋亡相关因子的表达进行了检测。
Werstern blot显示，扁蒴藤素显著减少了 Bcl － 2 的
表达，增加 Bax的表达。Bcl － 2、Bax 都定位于线粒
体膜上，Bcl － 2 基因家族与线粒体在细胞凋亡中的
作用密切相关［12］;Bax 是参与细胞凋亡的一个成
员，可以直接促使细胞色素 C 在外膜未被破坏的情
况下通过某种通道释放至胞浆，同时激发 PT 通道
的开放，降低线粒体膜电位［13］。而 Bcl － 2 蛋白则
通过稳定线粒体膜电位，阻止线粒体细胞色素 C 的
释放而发挥抗凋亡作用。此外，Bcl － 2 的过度表达
可引起细胞核谷胱甘肽的积聚，导致核内氧化还原
平衡的改变，从而降低了 Caspase 的活性。因此，扁
蒴藤素对抗凋亡蛋白 Bcl － 2 的下调和对促凋亡蛋
白 Bax 的上调作用可以部分解释扁蒴藤素诱导
MCF －7 细胞凋亡的机制。
扁蒴藤素能够下调Bcl － 2、上调 Bax 的表达，从
而激活细胞内凋亡途径，最终高效抑制MCF － 7 的
生长。本研究扩充了对扁蒴藤素抗乳腺癌作用及其
机制的新认识，也将为新的抗乳腺癌化疗药物的研
发提供实验依据。
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(收稿日期:2016 － 01 － 13;修回日期:2016 － 05 － 20
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