全 文 ：　文章编号:1007-4961(2007)02-0143-04
青榨槭外植体消毒方法初步研究
赖玉洁 ,路丙社 ,陈书明 ,关　楠 ,白志英
(河北农业大学 园林与旅游学院 ,河北 保定　071000)
摘要:以青榨槭带芽茎段为外植体 ,研究了取材时间 、消毒剂种类以及处理时间对外植体灭菌效果的影响。结
果表明 , 0.1%、0.2%升汞处理 5 min或 7 min的污染率显著低于 1%次氯酸钠处理 20 min 或 30 min;75%酒精
浸 60 s 后 ,用 0.1%的升汞消毒 7 min 和 0.2%的升汞消毒5 min或 7 min的处理间没有显著差异 , 其中 75%酒
精浸 60 s 后用 0.1%的升汞消毒 7 min 的消毒效果最好 , 外植体污染率和存活率分别为 1.9%和 90.4%。4 月
中旬至 7 月中旬取材的外植体污染率均低于 5%, 而存活率均达 90%以上 , 为青榨槭茎段外植体取材的最佳
时期。
关键词:青榨槭;外植体;消毒剂
中图分类号:S 792.35　　　　文献标识码:A
A study on disinfectors for the explants of Acer davidii Franch.
LAI Yu-jie , LU Bing-she , CHEN Shu-ming ,GUAN Nan ,BAI Zhi-ying
(College of Landscape Architecture and Tourism , Agricultural University
of Hebei , Baoding 071000 , China)
Abstract:The effect of different disinfectors and treatments time on Acer davidiit Franch.stems with buds was studied.The
results showed that HgCl2 was more effective than NaClO.There wars no significantly difference on explant survival rate be-
tween 0.1% HgCl2 for 7 min and 0.2%HgCl2 for 5 or 7 min.After treated with 75% alcohol for 60 s and followed by 0.
1% HgCl2 for 7 min , the survival rate and the contamination rate were 1.9% and 90.4% respectively.From the middle
April to July , its survival rate wars more than 90%, and it was the suitable time to collect materials.
Key words:David maple(Acer davidii Franch.);explant;disinfector
收稿日期:2006-12-31;修改稿收期:2007-01-26
作者简介:赖玉洁(1981-),女 ,河北承德人 ,在读硕士生 ,主要从事园林与观赏园艺植物育种方面研究。
通讯作者:路丙社(1965-),男 ,河北新乐人 ,博士 ,副教授 ,主要从事阿月浑子和园林植物引种研究。
　　在植物组织培养过程中 ,外植体消毒是最初的
也是极为重要的步骤 。植物组培的初代培养材料取
自自然生长的植株 ,都带有各种各样的微生物 , 尤
其是木本植物带菌系数更高 ,只有筛选出成功的消
毒方法 , 才能进行进一步的组织培养研究[ 1 ～ 3] 。以
往的研究表明 ,不同灭菌剂和灭菌时间对外植体的
消毒效果存在很大差异 ,判断某种消毒方法适合与
否 ,要综合考察污染率 、死亡率的比例 ,而以存活率
为主要依据[ 4, 5] 。青榨槭(Acer davidii Franch.)树皮
花纹奇特 、树形优美 ,是极具应用前景的园林绿化树
种。目前仅有其形态的简单介绍及抗性生理的初步
研究 ,有关组培的研究尚未见诸报道[ 6, 7] 。本试验对
青榨槭外植体的消毒方法进行了研究 ,以期为青榨
槭再生体系建立及遗传转化提供有益的参考。
1　材料与方法
1.1　试验材料
选取河北农业大学园林树木种质资源圃3 a生
长势良好的青榨槭实生苗植株 ,分别于2006年 4 ～ 9
月份剪取当年生半木质化枝条 ,去除叶片后以 2 ～ 3
cm的带芽茎段作为外植体进行试验 。
1.2　试验方法
1.2.1　材料预处理　流水冲去表面污物※用洗涤
灵浸泡 ,同时搅动 5 ～ 10 min※自来水冲洗 10 ～ 30
第22卷 第2期 河　北　林　果　研　究 Vol.22 No.2
2 0 0 7年 6月 HEBEI JOURNAL OF FORESTRY AND ORCHARD RESEARCH Jun.2007
min※在无菌条件下用 75%酒精表面消毒 60 s※用
消毒液消毒※用无菌水清洗 4 ～ 5次备用。
1.2.2　灭菌剂的筛选　分别用 1%的 NaClO 、0.1%
的HgCl2 、0.2%的 HgCl2 按如下设置进行处理外植
体。A:1%的NaClO 消毒 20 min;B:1%的 NaClO 消
毒30 min;C:0.1%的HgCl2 消毒 5 min;D:0.1%的
HgCl2 消毒 7 min;E:0.2%的 HgCl2 消毒 5 min;F:
0.2%的HgCl2消毒 7 min。
1.2.3　处理时间的确定　用 0.1%HgCl2 按以下时
间设置进行消毒处理。G:0.1%HgCl2 消毒 3min;C:
0.1%HgCl2 消毒 5 min;D:0.1%HgCl2 消毒 7 min;
H:0.1%HgCl2 消毒 10 min;I:0.1%HgCl2 消毒 15
min。
1.2.4　外植体取材时间的确定 　分别用 0.1%
HgCl2 消毒7 min 对 4月中旬 、5月中旬 、7月中旬 、8
月中旬和 9月中旬采集的茎段外植体进行处理 ,以
确定最佳采取时期。
1.3　培养条件和结果统计方法
消毒的茎段外植体切去材料与药液接触的伤口
后 ,接种于无菌培养基上。培养基配方为 Ms 培养
基添加 BA 1 mg L ,NAA 0.5 mg L ,琼脂粉7 g L ,25 g
L蔗糖和 0.1 g L 肌醇。培养温度(25±1)℃,空气
相对湿度 50%～ 60%,光照时间每天 14 h ,光照度
1 500 ～ 2 000 Lx 。每处理 20个外植体 ,重复 3次 。
培养20d后 , 统计外植体污染率 , 死亡率 , 存活
率[ 8 , 9] 。
结果统计按肖显华等的方法[ 10] ,并做改动。
污染率%=(污染外植体数 接种外植体总数)
×100%;
死亡率%=(死亡个数 接种外植体总数)×
100%;(外植体不萌动 ,出现芽体变黑视为外植体
死亡);
存活率%=(未污染且萌动个数 接种外植体总
数)×100%。
2　结果与分析
2.1　灭菌剂对外植体消毒效果的影响
灭菌剂对青榨槭外植体消毒效果有很大影响。
消毒效果见表 1。从表中可以看出 , 1%NaClO消毒
20 min和30 min的污染率分别为 48.3%和 24%,存
活率分别为 49.5%和 69%,而处理 0.1%和 0.2%
HgCl2 消毒 5 min和7 min的存活率都保持在 80%以
上;方差分析表明两种灭菌剂间存在显著差异 ,
HgCl2的消毒效果好于次氯酸钠的消毒效果。在
HgCl2 两个浓度处理时 ,随着处理浓度的增大和处理
时间的延长 ,污染率逐渐下降 ,死亡率逐渐提高;对
存活率的方差分析表明 ,处理 D和处理 E间差异不
显著 ,说明是青榨槭茎段外植体较适宜的消毒方法 ,
其中处理 D即 0.1%HgCl2 消毒 7 min的外植体存
活率最高 ,达 90.4%。
表 1　消毒药剂对茎段消毒效果的影响
Table 1　Effects of different disinfectors on the disinfection of David maple stems
处理
Treatment
消毒药剂
Disinfector
消毒时间
Time min
总数量 个
Total number
污染率 %
Contamination rate
死亡率 %
Mortality rate
存活率 %
Survival rate
A 1%NaClO 20 60 48.3 a 2.2 49.5 c
B 1%NaClO 30 60 24 b 7 69 b
C 0.1%HgCl2 5 60 14.1 c 3.8 82.1 ab
D 0.1%HgCl2 7 60 1.9 e 7.7 90.4 a
E 0.2%HgCl2 5 60 7.6 d 5.4 87 a
F 0.2%HgCl2 7 60 1 e 14.7 84.3 ab
　　注:表中不同字母表示 0.05水平上 ,差异显著性。
2.2　处理时间对外植体消毒效果的影响
为进一步确立 HgCl2 的最佳处理时间 ,本试验
分别设置了5个时间处理(见表2)。由表 2可知 ,随
着处理时间的延长 ,外植体污染率逐渐下降 ,死亡率
逐渐升高 ,说明较长时间的 HgCl2 处理会给外植体
造成一定伤害而死亡 。在表 2的 5个时间处理中 ,
处理 I 的外植体污染率虽为 0 ,但外植体的死亡率却
高达31.5%;处理 D和处理H 虽有一定的外植体污
染 ,但外植体死亡率较低 ,其外植体的存活率分别为
90.4%和 83.4%,虽与其他处理间存在显著差异 ,但
处理 D和H 间没有显著差异 ,说明处理 D和处理 H
的消毒效果较好 ,是较适宜的外植体处理时间。
144　　　　　　　　　　　　　　　　　河　北　林　果　研　究　　　　　　　　　　　　　　第 22卷
表 2　处理时间对外植体消毒效果的影响
Table 2　Effects of treatment time on the disinfection of David maple stems
处理
Treatment
消毒时间
Time min
总数量 个
Total number
污染率 %
Contamination rate
死亡率 %
Mortality rate
存活率 %
Survival rate
G 0.1% HgCl2 3 min 60 54.6 a 0 45.4 c
C 0.1% HgCl2 5 min 60 14.1 b 11.8 74.1 b
D 0.1% HgCl2 7 min 60 1.9 c 7.7 90.4 a
H 0.1%HgCl2 10 min 60 0.7 c 15.9 83.4 a
I 0.1%HgCl2 15 min 60 0 c 31.5 68.5 b
　　注:表中字母表示 0.05水平上 ,差异显著性。
2.3　外植体取材时间对消毒效果的影响
试验结果见表 3 ,由表可知 , 4月中旬至 7 月中
旬为外植体取材进行消毒处理的最佳时期 ,存活率
均在 90%以上且差异不显著。此时植物开始进入
生长旺盛的时期且新生枝茎暴露的时间较短带菌较
少 ,因而消毒效果最好。其中 5月末取材的外植体
消毒效果最好高达 91.1%。随着植物生长期的延
长 ,外植体在自然状态下暴露的时间越长 ,带菌量增
多 ,消毒效果明显下降 ,8 、9月份的外植体存活率分
别降低为 66.3%、35.9%。同时 ,进入 8 、9月份后植
株已停止生长甚至进入休眠期 ,外植体启动培养困
难且不易分化 ,不利于青榨槭再生体系的建立 ,因
此 ,青榨槭组培外植体采集的最佳时间为4 ～ 7月 。
表 3　取材时期对外植体消毒效果的影响
Table 3　Effects of season on the disinfection
of David maple stems
取材时间
Date
总数量 个
Total
number
污染率 %
Contamination
rate
死亡率 %
Mortality
rate
存活率 %
Survival
rate
四月中旬 60 1.9c 7.7 90.4a
五月末 60 1.9c 7 91.1a
七月中旬 60 4.7c 5.3 90a
八月中旬 60 30.9b 2.8 66.3b
九月中旬 60 61.9a 2.1 35.9c
　　注:表中字母表示 0.05水平上 ,差异显著性。
3　结论与讨论
灭菌剂种类对外植体消毒效果有不同的影响 。
冯金玲对椎栗外植体和刘进平对木薯外植体消毒的
研究均表明 ,用 HgCl2 处理外植体的消毒效果均显
著好于用次氯酸钠的处理效果[ 5 , 11] 。本试验中 , 1%
NaClO消毒茎段外植体 30 min 的污染率为 24%、存
活率为 69%,而 0.1%的 HgCl2 消毒 7 min与 0.2%
的HgCl2 消毒 5 min和 7 min 的存活率均达 80%以
上 ,显著高于 NaClO消毒的外植体存活率 ,说明升汞
的消毒效果显著优于次氯酸钠 。同时 ,0.1%HgCl2
处理的污染率虽稍高于 0.2%的 HgCl2 处理 ,但外植
体存活率间无显著差异 ,因此 ,从避免环境污染和减
缓对外植体毒害角度来讲 ,选择 0.1%HgCl2 作为消
毒剂较好。
随着消毒时间延长 ,外植体污染率虽逐渐降低 ,
但外植体死亡率会逐渐升高 ,进而导致外植体存活
率下降 ,因此 ,不能靠延长灭菌时间的方法来改善消
毒效果;最佳处理时间确立应在综合考虑污染率 、死
亡率基础上 ,以外植体存活率为最终判定依据[ 4 ,5] 。
本试验中 ,0.1%的 HgCl2 消毒 15 min(处理 I)的外植
体污染率虽为 0 ,但外植体的死亡率却达 31.5%;
0.1%的 HgCl2 消毒 7 min(处理 D)和 0.1%的 HgCl2
消毒 10 min(处理 H)虽有一定的外植体污染 ,但外
植体的存活率分别为 90.4%和 83.4%, 显著高于
0.1%的HgCl2 消毒 15 min的 68.5%,说明 0.1%的
HgCl2消毒 7 min和 10 min是较适宜的青榨槭茎段
处理时间 。其中 , 0.1%HgCl2 消毒 7 min 的存活率
最高达 90.4%,是青榨槭外植体灭菌最理想的消毒
方法。
研究表明 ,外植体生理活性状态和季节环境变
化对外植体灭菌效果亦有显著的影响。春 、夏季植
物生长旺盛 、生命力强 ,加之空气干燥 、光照充足 ,不
利于杂菌滋生 ,采集的外植体带菌量低 ,消毒效果
好;而秋季植物体生理代谢缓慢 、气温高 、湿度大 ,利
于杂菌滋生和蔓延且植物体易受杂菌侵染 ,采集的
外植体带菌量高 ,难以获得理想消毒效果[ 13] 。本试
验结果表明 ,4 ～ 7月份采集的青榨槭外植体污染率
均低于 5%,存活率均高达 91.1%,而 8 、9月份以后
取材外植体污染率显著升高 ,说明4 ～ 7月为青榨槭
茎段外植体取材的最佳时期 。
(下转第 158页)
145　第 2期　　　　　　　　赖玉洁等:青榨槭外植体消毒方法初步研究　　　　　　　　　　　
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