全 文 ：浙 江 农 业 大 学 学 报 1 7 (i ) : 8、 ~88 , 19 91
A e t a A g r ie “ I t u r a e U n iv e r s i t a t i s Z五e j乞a n g e n s i s
雀舌黄杨 ( B 、 。 : ha : la o dl’ l’) 愈伤
组织遗传转化的研究
王 以秀 严 菊强 薛庆中
( 浙江农业大学农学系 , 杭州 3 10 0 29 )
摘 要 利用处在对数生长期的根癌农杆菌 B 。 出 和 T o 7 菌株和雀舌黄杨愈伤组织共 培 养后 ,
在无激素 M S 培养基上获得了转化愈伤组织· 经测定转化的嘎获布组织内存在相应的 冠 瘦 碱 · 结果
证明 T 一D N A 编码的激素合成酶基因和冠瘦碱合成酶基因在转化愈伤组织内实现了转移和表达 .
关 . 词
中圈分类
农杆菌 ; 转化 ; 愈伤组织 ; 雀舌黄杨
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早在本世纪初 s m i lt 等〔 ` 1就发现根癌农杆菌 ( 月岁 ob ac et : iu “ 细 m ej ac i翻 : ) 能感 染 许多
双子叶植物并形成肿瘤 . 19 7 7年 C ih l ot n 等〔 “」首次用分子杂交 方法证明 在这种植物 肿瘤细
&)J 中存在着农杆菌 T ; 质粒的一个片段称转移 D N A 或 T 一 D N A ( ` r r an s f e r r “ d D N A ), 正是
由于 T一 D N A 在植物基因组中的整合和表达导致肿瘤的发生 . T i质粒的这 种向植物细胞传
递外源基因的能力 , 使植物遗传工程研究进入 了飞速发展的时期 . 迄今已有 30 余种外源基因
通过这一载体导入植物细胞并得到表达 .
本文是利用几根癌农杆菌 ( A g功 b ac et , : 。 椒 纽次以ac Zel 枯 ) 的不 一同 菌株离体感染雀舌黄杨幼
茎的愈伤组织细胞 , 促使 T 一 D N A 的转移和表达 . 以便探讨适合本实验 转 化材料的鉴定方
法及其在植物遗传工程中潜在应用价值 . 一 _ -
收稿 }刁期 : 19 9 0 一 0 7一 06
浙 江 农 业 大 学 学 报 」7卷
材料和方法
1
.
1 菌 株
选用根癌农杆菌的 B 。5 3 ( 含 p T ; B 。 5 3 章鱼碱型菌株 ) 和T 3 7 ( 含 p T ; T 3 : 的 胭脂碱型菌株 )
为供试菌株 ( 表 1 ) . 培养细菌用 Y E B 固体培养基 ( 牛肉浸膏 0 . 5 % , 酵 母 粉 0 . 1 % , 聚
蛋白陈 0 . 5 % , M g S O ` · 7 H : 0 2 m m ol , 蔗糖 0 . 5 % , 琼脂 0 . 8 % , p H 接 近 中 性 ) 上进
行繁殖与保持 . 液体悬浮培养时 , 从固体培养基上的菌落取 4环接 于 20 m l Y E B 培 养 液中
(不加琼脂 ) . 放置在摇床上于 26 ~ 28 ℃ , 1 2 o r / m in 的黑暗条件下振荡培养 18 小 时左右 .
1
.
2 离体愈伤组织感染 .
雀舌黄杨幼茎的外植体按常规方法培养 在 3 % 蔗 糖 , 2 I n g 1/ 2 , 4一 D , 0 . 5 m g 1/ K T 的
M S 琼脂培养基上进行两个月愈伤组织繁殖 . 然后转代培养到第八天时 , 取 大 约 0 . 5 9 疏松
愈伤组织 , 接种 于 10 m l 不含琼脂的 M S 继代培养基中 , 并用镊子捣碎成小愈 伤组织团 , 置
26 ℃ , l o o r / im m 的摇床上液体振荡培养至第七天时 , 向各悬浮培养液中分别加入 25 时 曾
在 26 ~ 28 ℃ , 1 20 r /川扭 条件下振荡培养了 18 小时的根癌农杆菌不同菌株的菌 液 ( 培 养前
Y E B 液体培养基 p H 调至 6 . 8 ) , 以不加菌液处理的培养物 为相应对 照 ( C K ) , 其他程序
完全与加菌处理组相 同 . 每处理组重复 2 次 , 混合的悬浮 液在 24 ~ 2 6 ℃ , 80 一 1 0 O r / m im 的
漫射光下共培 育 72 小 时后 , 向每瓶中加入 1 m l 过滤灭菌的含 60 0 件 g /m l 竣节青霉 素 ( C b)
的 M S 培养液 , 使 C b 的最终浓度约 50 0 林g / 11 , 再培养三天后 , 倾去培养基 。 用 3 % 蔗糖
液 ( p H 5 . 8 ) 洗涤 6 次 , 然后再用过滤灭菌的含 5 0 0 拼g il/ , 1 C b的无激素培养液洗涤三次 .
1
.
3 激素自主型愈伤组织的选择
将农杆菌不同菌株处理过的小愈伤组织团转移到含 5 0。 冬`g /m l C b 的无 激 素 M S培养基
上 . 而未处理过的材料 , 部分转入与上述同样培养基 、 部份转入含激素继代 M S 培养基上 ,
在无激素条件下 , 选择能增殖的愈伤组织作为激素自主性生 一长特性的愈伤组织 .
1
.
4 冠澳碱合成酶活性检测
将待测愈伤组织分离成小块转入下列培养基进行预培养三天 :
( 1 ) 1 0 l1 m ol ,l/ 精氨酸 十 5 m m ol 1/ 丙酮酸的 人15 固体培养基 ( 用于 B。 5。 章 鱼 碱型转
化组织测定 ) .
( 2 ) 1 0 m m ol / l精氨酸 十 5 m m ol 1/ a 一 酮戊二酸的 M S固体培养基 ( 用于 T。 7 胭脂碱型
转化组织 的测定 ) .
利用纸电泳 一荧光显色法检测组织中是否具 有章鱼碱合成酶或胭脂碱合成酶 活 性 。 电泳
和显色条件用修改的 O t t c n 方法 〔“ 〕 .
2 结果和讨论
T
* 质粒是位于根癌农杆菌细胞核外的一种双链环状 D N A 分子 , 长 约一 20 0 K b 左右 , 其
中 2 0 、 3 0 K b 转移 D N A ( ` r 一 D N A ) 一可以通过 T , 质粒插入植物墓因组从而转化植物细胞 卜.
lr’ 一 D N A 基因携带植物细胞可识 别的表达调节信号 , 能够依赖植物细胞的 R N A 聚合酶 卫进
行 尸o1 了 ( 工人) 尺入 A 的 转 录 , 每个转录产物各有自己 独 立 的 启动子和转录信号 . 这些信使
1 期 王以秀等 雀舌黄杨 ( 力u x u s h a r 渡a ” d未i ) 愈伤组织遗传转化的研究
R N A 可以在细胞 质 的 核糖 体 上翻译产生
T
一
D N A 的特殊蛋 白 质 。 其中由于激素基
因在植物细胞中的表达 , 产 生 了 过 量的生
长素和细胞分裂素 , 破 坏 了 内源激素的平
衡〔 ` ’ . 因此可以利用转化植物细胞增殖具有
激素自主性 的 生 理 特 性 , 在 无 外 源激素
的 M S 基 本 培 养 基上分离和筛选雀舌黄杨
转化愈伤组织 . T 一 D N A 的 另 一 类 冠瘦碱
( O p in se ) 的产物是氨 基 酸 或糖的含氮衍
生物 , 原是农杆菌赖以生长的砌源和氮源 .
因此可检测冠瘦碱合成酶的活性来鉴定雀舌
黄杨愈伤组织的转化特性 .
图 1 雀舌黄杨最初的 愈伤 组织
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在离体感染系统中 , 雀舌黄杨的愈伤组织 ( 图 l ) 转代在含激素的 M S 培养液 中培养一
周 , 以便使宿主细胞旺盛地合成 D N A , 有更多的分裂细胞 , 这样有利于整合 外 源 D N A 使
其转化〔 “ ’ 。 同时使用处在对数生长期的菌液具有较强的活力 , 从而可 更 有 效 地 感 染宿主细
胞 。 加菌后的愈伤组织与农杆菌共育 72 小 时 , 使雀舌黄杨细胞和 细菌细胞相互作用 , 促进
T
; 质粒中 T 一 D N A 基因向寄主细胞转移 . 加入抗菌素 C b 是为了抑制细菌过多地繁殖 , 防止
大量细菌对植物细胞生长产生不良影响 . 将感染过的愈伤组织洗去游离的细菌后 , 转入含有
C b 的无激素 M S 培养基上进行培养 , 以便使 T 一 D N A 在宿主细胞 中进行转化和表 达 。 对照
组 ( C K ) , 部分在有激素 M S 培养基上正常增殖 , 部分在无激素 M S 培养基上观察生长反应 。
经 B 。 5 3 和 T 3 7 菌株处理过的愈伤组织大多具有激素自主型生长特 性 ( 图 2 一 A ) , 这种
在无激素条件下能够连续增殖的能力与生长素合成有关的 mt : 基因与细胞分裂素合成有关 mt r
基因协作在转化组织中表达有关 , 而未经转化处理的小愈伤组织难以在无激素 人巧 培养基上
增殖 ( 图2 一 B ) 。
图 2 在无激素M S培养基上生 长四 周的培养物比较
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2 A C o m P a r i s o
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A 一一来 目农杆菌玩 5 3处理过的细胞团生长旺盛 的愈防组织 B — 对照 ( 改 ) 生长不 比
88 浙 江 农 业 大 学 学 手叹 仃卷
不同菌株处理的雀舌黄杨愈伤组织在无
激素培养基上继代培养后 , 分别测定其组织
的冠瘦碱合成酶活性存在与否 , 从而进一步
鉴定出 T 一 D N A 是否稳定地转入宿主细胞 。
根癌农杆菌对多 细 胞 的 愈伤组织感染
时 , 只有少部分细胞发生了转化 , 由于这部
分转化细胞对嵌合愈伤组织 中的其它正常细
表 1 所 用根癌农杆菌质拉特性的比较
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质 粒 ’ 类型 在转化细胞中表现特性
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p T ` T 3 7 }胭脂碱型
具有章鱼碱合成酶活性
具有胭脂碱合成酶活性
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胞的 “ 饲喂 ” 作用 , 导致一团愈伤组织在无激素条件下增殖 , 当待测组织中转化细胞的比例
过小时 ,往往检测不到冠瘦碱合成酶活性 . 如 p T ; B 6 5 3感染过的激素自主性增殖的愈伤组织
测定 14 份样品中仅 2 份表现酶活性 , 则冠瘦碱 合 成酶活性频率 14 . 多% , 而 p T I T 。 , 感染过
的被测样品 15 份 , 有 2份表现酶活性 , 其酶活性频率 为 13 . 3% 。 事实上 , 具冠瘦碱酶活性
的愈伤组织远比具激素自主性生长特性的愈伤组织少得多 . 除了上述转化细胞比例小的原 `因
外 , 据报导有些愈伤组织虽存在 T 一 D N A 但不 产 生冠瘦碱 , 因此检测不出其酶活性也是可
能的 ·
图 3 雀舌 黄杨不 同愈伤组 织萃取
物内章鱼碱和胭脂碱合成酶
活性催化产物的 电泳 图谱
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A— 精氨酸 O— 章单碱 N— 胭 脂碱1— 章鱼碱标准样品 2— 根癌农杆菌B 6 S 3感染 过的愈伤组织 3— 末经根癌农杆菌处理的愈伤组织作对照 ( c k ) 4— 根癌农杆 ,菌 T 3 ,感染过的愈伤组织 5— 胭胎碱标准样品 。
根痛农杆菌转化植物细胞成功与否 , 常依赖其激素自主型和冠瘦碱合成酶活性的检测为
依据〔 “ , . 正如图 3所示 , 雀舌黄杨经转化的激素自主型的愈伤组织显示了冠瘤碱酶活性 , 这
与贾敬芬在矮牵牛上结果类似 〔” . 证明 T 一 D N A 基因在雀舌黄杨愈仿组织中实现了转移 , 而
且在转化细胞 中得到了转录 、 翻译和表达 . 这对植物遗传工程的理 论 和 实践 均 具 有 潜在
意义 。
致 谢 承浙 江农业 大学金伟教授对本工作大力帮助 , 特此致谢 。
今考文献
.G 卡尔 , .J S · 舍尔主编 · 樊梦康 , 徐杏阳等译 , 植物肿瘤分于 生 物 学 · 北京 : 科 学 出版 社 , ” 终
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