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〔2008-05-21收稿　 2008-10-13修回〕
(编辑　张　铭)
漏芦对慢性肾功能不全大鼠保护机制的研究
张德伟　郑红光 1　(第四军医大学西京医院肾内科 ,陕西　西安　710032)
　　〔摘　要〕　目的　观察漏芦对慢性肾功能不全大鼠肾功能及肾组织TGF-β 1和 CTGF表达的影响。方法　采用改良肾脏 5/6切除术建立大鼠
慢性肾功能不全模型 ,随机分为正常对照组(C组),非治疗组(NT组)和漏芦治疗组(RR组)。 RR组每天予以漏芦(15g/kg)灌胃。治疗 4w后 ,检
测各组大鼠的 24h尿蛋白定量 、血尿素氮 、血肌酐及肾硬化指数 ,通过免疫组化及蛋白印迹观察肾组织 TGF-β 1和 CTGF的表达。结果　NT组大鼠
的 24h尿蛋白定量 、血尿素氮 、血肌酐及肾脏硬化指数较 C组明显增加(P<0.01),而 RR组大鼠 24h尿蛋白定量 、血尿素氮 、血肌酐及肾脏硬化指
数较 NT组减少(P<0.05)。 NT组大鼠肾组织 TGF-β 1、CTGF表达较 C组明显增加(P<0.01), RR组肾组织 TGF-β 1、CTGF表达较 NT组减弱(P<
0.05)。结论　漏芦可降低慢性肾功能不全大鼠 24h尿蛋白 、血尿素氮 、肌酐水平 ,减轻肾组织硬化 ,抑制肾组织TGF-β 1和 CTGF表达。漏芦对慢性
肾功能不全的保护机制可能与降低肾脏 TGF-β 1和 CTGF表达有关。
〔关键词〕　漏芦;慢性肾功能不全;肾大部分切除;转化生长因子-β 1;结缔组织生长因子;大鼠
〔中图分类号〕　R692　　〔文献标识码〕　A　　〔文章编号〕　1005-9202(2009)11-1357-03
1　沈阳军区总医院肾内科
通讯作者:郑红光(1962-),男 ,博士 ,主任医师 , 硕士生导师 ,主要从事
慢性肾脏病防治研究。
第一作者:张德伟(1976-),男 ,在读硕士 , 主治医师 ,主要从事慢性肾脏
病的治疗研究。
　　漏芦(RadixRhapontici)是多年生菊科植物 , 其根入药 , 有
清热解毒 、消痈 、下乳及消筋通脉等功效 , 并有很强的抗脂质过
氧化作用。近年来的研究发现漏芦具有提高细胞免疫功能 、抗
动脉粥样硬化 、抗自由基过氧化 、抗缺氧 、抗炎及抗衰老等作
用。全红梅等 〔1〕观察其对 IgA肾病小鼠有明确治疗作用 , 且已
应用于肾病综合征的临床治疗 〔2〕。但其治疗慢性肾功能不全
的疗效及机制鲜有报道。 本研究观察漏芦对肾大部切除慢性
肾功能不全大鼠尿蛋白排泄 、肾功能的影响及肾组织中转化生
长因子-β 1(TGF-β 1)、结缔组织生长因子 (Connectivetissue
growthfactor, CTGF)的蛋白表达及肾脏病理的变化 , 探讨漏芦
治疗慢性肾功能不全的效果及作用机制。
1　材料与方法
1.1　材料　购买辽宁地产祁州漏芦。 水提取物:漏芦根加水
煎煮 3次 , 做成水煎液 , 浓缩成 1 ml含有中药 3 g。 兔抗 TGF-
β 1、CTGF抗体(武汉博士德生物有限公司);抗体稀释液(DA-
KO公司);EnVision免疫组化试剂盒(广州基因有限公司);
BCA试剂盒(美国 PIERCE)。
1.2　实验动物和分组　健康雄性 SD大鼠 65只(由沈阳军区
总医院实验动物中心提供 , 使用许可证:SYXK(军 2002-019),
SPF级), 8 w龄 ,体重(180±20)g。 适应性饲养 1 w,随机分为
正常组 20只和手术组 45只。术后 10 w将手术组 40只大鼠(4
只死亡 , 1只切口感染 , 其余全部造模成功)随机分为 2组:非
治疗组 20只 ,治疗组 20只。实验期间大鼠自由饮水 、进食。
1.3　肾大部切除模型建立　参照文献 〔3〕。 腹腔注射 10%水
合氯醛(3 ml/kg)麻醉大鼠后 , 取俯卧位 ,固定四肢 , 背部手术
·1357·张德伟等　漏芦对慢性肾功能不全大鼠保护机制的研究　第 11期
区常规备皮 、消毒 、铺巾 , 行左背部(以肋脊角为标志)垂直切
口 , 充分暴露左侧肾脏 , 分离肾周脂肪囊 , 迅速切除左肾上下
极 , 立即以明胶海绵压迫止血 ,复位肾脏 , 缝合各层组织。随后
行右背部垂直切口 , 充分暴露肾脏 , 分离肾周脂肪囊 , 肾蒂手术
缝线结扎后切除右侧肾脏。手术时注意分离 、保留肾上腺并防
止损伤。全部大鼠于术后 10 w以代谢笼留取 24 h尿液 , 眶内
静脉采血 , 测定 24h尿蛋白定量 、血尿素氮 、血肌酐。检测发现
手术大鼠除 4只死亡 , 1只切口感染外全部造模成功。此后治
疗组大鼠每日给予漏芦提取物(15 g/kg)灌胃 , 同时正常组和
非治疗组给予等量生理盐水灌胃。术后 14 w全部大鼠以代谢
笼留取 24h尿液 , 眶内静脉采血 , 测定 24 h尿蛋白定量 、血尿
素氮及肌酐。手术组大鼠处死后取左侧残肾部分肾组织置于
10%中性甲醛固定 , 备用于组织病理学及免疫组织化学测定;
部分肾组织液氮保存用于蛋白印迹杂交(Western印迹)检测蛋
白表达。正常对照组大鼠取左侧肾脏 ,标本留取同手术组。
1.4　检测方法
1.4.1　尿蛋白定量及肾功能测定　用考马斯亮蓝法测定尿蛋
白定量。应用日立 7020生化分析仪测定血尿素氮 、血肌酐。
1.4.2　病理形态学观察　按常规方法固定 、包埋 , 切片厚约
4 μm,行 HE、PAS及 Masson染色。参照 Raij〔4〕等的半定量方
法计算肾小球硬化指数(GlomerulosclerosisIndex, GSI), 评估肾
小球硬化程度。 PAS染色切片用北航医学图像管理系统进行
分析。每张切片在 20倍下至少取 20个完整的肾小球 , 计算肾
小球基质相对面积(肾小球基质 /肾小球面积)。
1.4.3　肾脏免疫组织化学检测　采用二步法 , 4 μm肾组织石
蜡切片梯度脱腊水化后 , 3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶 ,
PBS缓冲液(0.01 mol/L, pH7.4)洗涤 , 正常兔血清封闭 , 依次
加入 TGF-β 1抗体 、EnVision标记 Ⅱ抗 , DAB显色 , 苏木精复
染 , 树脂封片。肾脏 CTGF检测方法同 TGF-β 1。有棕黄色或棕
红色颗粒状物质沉积为阳性细胞。采用 IMP-2000图像分析系
统 , 对图像进行灰度变换 ,使阳性面积与背景分开 ,进行自动测
量。每例标本 400倍镜下随机观察 5个肾小球 , 分别计算每个
肾小球 TGF-β 1和 CTGF的阳性面积比值 ,即阳性面积 /肾小球
面积 , 取其平均值进行统计学分析。
1.4.4　蛋白印迹分析　各组取约 100 mg肾组织置于 1 ml裂
解缓 冲液 (含 蛋白酶 抑制 剂 PMSF 100 μg/μl, aprotinin
1 μg/ml, leupeptin1 μg/ml), 匀浆后冰浴 30 min, 然后 4℃
12 000 r/min离心 20 min。提取蛋白后用 BCA法测量蛋白浓
度。取等量蛋白质进行 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,半干法转移
至聚氟乙烯膜上 , 封闭液封闭 , 加入 1∶200稀释的 TGF-β 1抗
体 , 4℃过夜。 0.05%TBST洗膜 3次 , ECL显影。用 ScionImage
分析软件测定各条带灰度值 , 取其均值进行统计学分析。肾组
织 CTGF分析方法同 TGF-β 1。
1.5　统计学处理　计量资料采用 x±s表示 , 数据用 SPSS
11.5软件包进行统计学处理。各组间均数比较采用单因素方
差分析。
2　结　果
2.1　尿蛋白定量变化　非治疗组和治疗组大鼠尿蛋白排泄明
显高于正常组(P<0.01);治疗组大鼠尿蛋白定量与非治疗组
比较有所降低(P<0.05), 见表 1。
2.2　血清生化指标变化　非治疗组和治疗组大鼠血肌酐明显
高于正常组(P<0.01);治疗组大鼠血肌酐及尿素氮与非治疗
组比较有所降低(P<0.05)见表 1。
表 1　各组大鼠尿蛋白定量 、血尿素氮 、肌酐水平(x±s)
组别 n 尿蛋白(mg/d) 尿素氮(mmol/L) 肌酐(μmol/L)
正常组 20 8.35±2.11 7.26±1.03 41.62±8.51
非治疗组 20 121.85±24.871) 18.55±3.471) 90.45±12.401)
治疗组 20 78.1±19.841)2) 14.71±2.541)2) 80.64±13.851)2)
　与正常组相比:1)P<0.01,与非治疗组相比:2)P<0.05,下表同
2.3　组织病理学改变和半定量分析　在 HE染色中 ,非治疗
组大鼠可见明显的肾小球增生 、肥大 , 系膜增殖 , 局灶节段性肾
小球硬化 , 肾小球毛细血管部分塌陷 , 球囊黏连 , 部分肾小球完
全硬化 , 间质有炎细胞浸润 , 部分肾小管已萎缩 、塌陷 ,部分肾
小管内可见蛋白管型 , 系膜外基质显著增加 , 见图 1。 Masson、
PAS染色可见明显的肾小球硬化 、肾间质纤维化。治疗组与非
治疗组比较 , 系膜增生 、肾小球损伤 、硬化较轻 , 肾间质炎细胞
浸润少 , 肾间质面积少 , 间质纤维化改变轻。治疗组和非治疗
组较正常组肾小球基质相对面积 、GSI明显增高(P<0.01),但
治疗组较非治疗组明显降低 , 两组差异有统计学意义(P<
0.05), 见表 2。
图 1　各组大鼠 HE染色结果(×400)
表 2　各组大鼠肾小球基质 /肾小球面积和 GSI(x±s)
组别 n 基质 /肾小球面积 GSI
正常组 20 0.031 9±0.007 2 0.87±0.27
非治疗组 20 0.152 1±0.008 71) 54.93±10.181)
治疗组 20 0.121 6±0.006 91)2) 38.07±6.431)2)
　与正常组相比:1)P<0.01,与非治疗组相比:2)P<0.05
2.4　肾组织免疫组织化学结果　TGF-β 1和 CTGF在正常组
的肾小球上皮细胞和肾小管上皮细胞有少量表达;在治疗组和
非治疗组肾小球系膜细胞 、上皮细胞 、系膜区和肾小管上皮细
胞均有表达。非治疗组大鼠 TGF-β 1和 CTGF与正常组相比表
达均明显增加(P<0.01), 治疗组与非治疗组比较 TGF-β 1和
CTGF表达减弱(P<0.05)。见图 2,表 3。
·1358· 中国老年学杂志 2009年 6月第 29卷
图 2　各组大鼠肾组织 TGF-β 1、CTGF
免疫组化结果(×400)
2.5　肾组织 TGF-β 1和 CTGF蛋白印迹方法检测结果　治疗
组和非治疗组大鼠 TGF-β 1和 CTGF与正常组相比表达均明显
上调(P<0.01), 治疗组 TGF-β 1和 CTGF表达较非治疗组明显
下调(P<0.05)。见图 3,表 4。
表 3　免疫组化检测各组大鼠 TGF-β1和
CTGF蛋白表达结果(x±s, %)
组别 n TGF-β 1 CTGF
正常组 20 3.15±0.51 2.47±0.33
非治疗组 20 15.43±2.581) 18.18±2.461)
治疗组 20 9.79±2.021)2) 11.94±2.631)2)
　与正常组相比:1)P<0.01,与非治疗组相比:2)P<0.05
图 3　Western印迹检测各组大鼠肾组织 TGF-β 1、CTGF表达
表 4　Western印迹检测各组大鼠 TGF-β 1和
CTGF蛋白表达结果(x±s, %)
组别 n TGF-β 1 CTGF
正常组 20 107.29±5.16 117.83±4.18
非治疗组 20 155.37±4.861) 199.79±6.971)
治疗组 20 136.43±6.421)2) 162.34±4.381)2)
　与正常组相比:1)P<0.01,与非治疗组相比:2)P<0.05。
3　讨　论
　　慢性肾功能不全是所有肾脏疾病进展的共同结局 , 病理表
现为肾小球硬化和肾小管间质纤维化 , 严重威胁人类健康 , 目
前缺乏控制其进展的有效药物。研究表明 , 慢性肾功能不全进
展与许多因素有关 , 蛋白尿是慢性肾功能不全进行性恶化的重
要危险因素 〔5〕 , TGF-β 1和 CTGF是慢性肾功能不全进展的两
个重要的细胞因子。
　　TGF-β 1是目前发现最强的促肾脏纤维化因子 , 已被公认
是肾小球硬化治疗的靶标 ,在肾小球硬化及肾小管间质纤维化
发生 、发展的多个环节起作用。 TGF-β 1可调节炎症反应 , 其过
度表达可促进细胞外基质(ECM)的合成和沉积 , 促进系膜细胞
(MC)的过度增殖 ,减少 ECM的降解 , 引起肾小球硬化。 CTGF
是导致肾脏纤维化的重要细胞因子之一 , 可以促进成纤维细胞
增生和 ECM合成 , 还可以促使肾小球系膜细胞和肾小管上皮
细胞发生转分化 , 由正常时的静止表型转分化为活跃增生的肌
成纤维细胞表型 , 增加 ECM的分泌。目前研究发现 CTGF作用
机制较复杂 , 其中之一是可能作为 TGF-β 1发挥作用的下游因
子 〔6〕 ,是 TGF-β 1活性的重要调节者 。正常情况下 CTGF表达
很低或无 , 在 TGF-β 1的诱导下 , CTGF表达显著增加是增生性
或纤维化性肾脏病变中的普遍现象。
　　本实验显示漏芦可减少肾大部切除慢性肾功能不全大鼠
的尿蛋白排泄 , 降低血尿素氮及血肌酐;可以下调肾组织中
TGF-β 1及 CTGF的表达 ,抑制肾小球肥大 , 减轻肾小球硬化面
积 , 减轻肾间质炎细胞浸润 、肾间质纤维化及肾小管萎缩 , 减轻
慢性肾功能不全大鼠肾组织的病理改变 ,起到肾脏保护作用。
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(编辑　曲　莉)
·1359·张德伟等　漏芦对慢性肾功能不全大鼠保护机制的研究　第 11期