全 文 ：山乌桕蜂蜜酒酿造酵母的筛选、鉴定及应用
史 莹 张丽珍 曾志将 王子龙 颜伟玉 *
（江西农业大学蜜蜂研究所 南昌 330045）
摘要 目的：从天然蜂蜜中筛选 1 株适合山乌桕蜂蜜酒酿造的酵母，采用分子生物学方法进行鉴定，同时分析
蜂蜜酒香味成分。方法：以自然发酵的陈旧蜂蜜酵母菌进行富集培养和划线分离，通过镜检、杜氏管发酵法进行
初筛，通过产酒精能力、耐性能力、发酵力测试以及凝聚性比较进行复筛。 通过 26S rDNA D1/D2 区序列测定、
系统发育分析，对所筛选的酵母菌进行分子生物学鉴定，并采用气相色谱-质谱法分析山乌桕蜂蜜酒香味成分。
结果：从自然发酵的蜂蜜中分离出 39 株酵母菌，通过复筛得到 1 株适合山乌桕蜂蜜酿酒的优良酵母 S2。 该酵
母菌在 30%（质量分数）糖，20%（体积分数）酒精，200 mg/L NaHSO3，pH 4.0 条件下发酵 7 d，可产酒精 13.12%
（体积百分数），且酒香浓郁。 该酵母菌与季也蒙毕赤酵母（EU177574）和毕赤酵母（FN398021）的遗传距离最近，
相似性均为 99%。从山乌桕蜂蜜酒中鉴定出 55 种香味化合物，占总香味成分的 97.74%。结论：所筛选的酵母菌
S2（JX233487）最适合山乌桕蜂蜜的酿造，该菌株被鉴定为毕赤酵母属。山乌桕蜂蜜酒中的香味成分主要是醇类
和酯类。
关键词 乌桕蜂蜜酒； 酵母； 分离； 鉴定； 香味分析
文章编号 1009-7848（2013）10-0197-08
山乌桕（Sapium discolor）又名野乌桕、山柳、
山杠、红心乌桕，属于大戟科，广泛分布于我国热
带和亚热带地区， 是我国南方各省的主要蜜源植
物之一[1]，在山区分布众多。 山乌桕蜂蜜呈浅琥珀
色，具有轻微的酸气味，润喉性差，结晶粒粗[2]。 虽
然山乌桕蜂蜜产量较大，但产品销售情况不佳。将
山乌桕蜂蜜酿造成酒，可以增加养蜂者的收入，促
进养蜂业的发展。 蜂蜜酒是由蜂蜜经水或是果汁
稀释后发酵而成， 被认为是人类酿造的第一种酒
精饮料，约有 1 万年的历史[3]。 我国的蜂蜜酒研究
始于 20 世纪 80 年代。 黄书青等最早对几种蜂蜜
的酿酒效果进行了比较[4]。近年来有关蜂蜜酒的研
究也较多， 主要是针对蜂蜜酒的发酵菌株和发酵
工艺[5-7]。
作者之前对山乌桕蜂蜜酒的酿造酵母和工艺
进行了研究， 结果发现黄酒酵母较适合用于山乌
桕蜂蜜酒的酿制， 但在驯化过程中酿酒酵母菌株
的优良性状可能部分丧失， 从而影响发酵产品的
质量[8]。 本实验中对天然蜂蜜中分离到的 39 株酵
母进行筛选，以期得到 1 株发酵力强，耐高渗，耐
酒精，产酒率高并适合发酵乌桕蜜酒的酵母菌株，
确定其种属地位，分析山乌桕蜂蜜酒香味成分，旨
在为山乌桕蜂蜜深加工奠定基础。
1 材料
1.1 菌种
菌株分离源：放置数年的乌桕蜜、洋槐蜜、荆
条蜜、 荷树蜜、荔枝蜜、荞麦蜜、紫云英蜜、枣花
蜜、雪脂莲蜜、益母草蜜、野菊花蜜、枸杞蜜、黄芪
蜜、党参蜜、土黄连蜜、野桂花蜜（购买后经常规理
化指标分析 ， 符合蜂蜜国家标准 GB 18796-
2005）。 对照菌株（CK）：湖北安琪酵母有限公司葡
萄酒活性干酵母。
1.2 培养基
沙堡弱培养基：蛋白胨 1 g，琼脂 2.5 g，蒸馏水
100 mL， 葡萄糖 4 g， 煮沸溶解， 高压 115 ℃ 20
min。 麦芽汁液体培养基：氯霉素 0.1 g，麦芽膏粉
130 g，最终 pH 6.0，1 L 水溶解。 麦芽汁琼脂培养
收稿日期： 2012-10-19
资助项目： 江西省教育厅项目（GJJ11406）；国家现代蜂产
业技术体系（No.CARS-45）
作者简介： 史莹，女，1986 年出生，硕士生
通讯作者： 颜伟玉
Vol． 13 No． 10
Oct． 2 0 1 3Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology
中 国 食 品 学 报第 13 卷 第 10 期
2 0 1 3 年 10 月
DOI:10.16429/j.1009-7848.2013.10.037
中 国 食 品 学 报 2013 年第 10 期
基：氯霉素 0.1 g，麦芽膏粉 130 g，最终 pH 6.0，琼
脂 15 g，1 L 水溶解，灭菌备用。 山乌桕蜂蜜（糖度
25°Bx，pH 4.0）。
1.3 主要试剂
引物 NL-1 和 NL-4 由 Invitrogen 公司合成。
生理盐水、无水酒精、偏重亚硫酸、醋酸、柠檬酸、
NaOH、邻苯二甲酸氢钾、酚酞、EDTA、氯仿等为分
析纯试剂。 酵母基因组 DNA提取试剂盒、Taq酶、
dNTP等购于 TaKaRa公司。
1.4 主要仪器与设备
凝胶成像仪 （Fine-doX3）、PCR 扩增仪 （ep-
pendorf）、电泳仪，北京六一仪器厂；SPME装置，美
国 Supelco；PDM 萃取头， 美国 Supelco；Trace MS
联用仪，美国 Thermo Finnigan；电子天平、紫外-
可见分光光度计、显微镜、手持测糖仪、精密 pH
计、酒精密度瓶；离心机、培养箱、超净工作台、生
化培养箱、恒温干燥箱、恒温水浴锅、立式压力蒸
汽灭菌器、恒温摇床等。
2 方法
2.1 酵母菌分离纯化
取自然发酵的山乌桕蜂蜜发酵液 1 mL，梯度
稀释至 10-7。 选择 10-3～10-4稀释度， 取稀释的 50
μL 菌液涂布于麦芽汁培养基和沙氏培养基中，28
℃培养 48 h，待长出菌落，挑选整齐的单个菌落，
将单菌落划线分离 2～3 次， 直至菌落形态和菌体
形态基本一致， 经显微镜检验为纯种后转于麦芽
汁琼脂斜面，4 ℃保存 [9]。 菌种用阿拉伯数字 S1，
S2，S3，S4…依次编号。
2.2 酵母菌的初筛
取 10 mL 糖度为 10°Brix 的麦芽汁液体培养
基，灭菌，冷却后接种 8%酵母菌，比较酵母菌在杜
氏管中的产气情况， 筛选产气量大， 起酵时间在
48 h内的酵母菌株。记录发酵时间和产气情况，重
复 3次。活化条件：10 °Brix麦芽汁液体培养基 28
℃震荡 10 h，接种量 8%；发酵条件：13 °Brix 麦芽
汁 28 ℃静止发酵 48 h[10]。
2.3 酵母菌的复筛
2.3.1 高渗耐受性 采用杜氏发酵管法测定酵母
菌耐高渗能力。 将分离菌接种到 40%乌桕蜜试管
中，28 ℃培养 24 h。在 660 nm处测定 OD值。试管
连续培养，观察泡沫产生情况。根据气体产生的速
度和产气量，比较不同酵母菌株的耐高渗能力。
2.3.2 酒精耐受性 从实际生产而言， 要想采用
直接发酵法生产出酒精度较高， 品味良好的蜂蜜
酒，一般要将酵母菌直接置于 25%～30%的蜜汁中
培养[11-12]。酵母发酵能力在很大程度上取决于它对
酒精耐受力的大小 [13]。 本实验中采用 30%蜂蜜、
20%酒精环境下筛选酵母菌。
取已灭菌的试管数支， 以无菌操作将酵母菌
接入体积分数为 20%乙醇和无菌麦芽汁培养基
中， 摇匀，28 ℃培养 7 d， 然后在 660 nm处测 OD
值，同时观察气泡产生的情况。
2.3.3 pH 耐受性 耐酸酵母是指在 pH≤4 的环
境下，可以生长或代谢的酵母[14-15]。 本试验中采用
pH 4.0 的环境培育筛选酵母菌。 将分离菌接种到
pH 4.0 的麦芽汁液体培养基中，培养 24 h，在 660
nm处测 OD值，观察气泡产生情况。
2.3.4 SO2 耐受性 采用添加 200 mg ／ L NaHSO3
的方法，比较 OD值和产气时间。 将酵母菌接入含
200 mg ／ L NaHSO3的麦芽汁培养基中， 在相同条
件下培养，于 660 nm 处测 OD 值。 同时观察杜氏
管中的气泡产生情况（产气时间和产气量），筛选
所需酿造菌株。
2.3.5 发酵性能的测定 将山乌桕蜜起始糖度调
整为 25%，75 ℃灭菌 30 min，冷到 28 ℃左右，加入
0.15%阿米诺酶， 分别接入 5 种活化的优良菌种
（S2、S11、S21、S33、S37） 和 0.2%葡萄酒活性干酵
母（CK），28 ℃，发酵 7 d，测定蜂蜜酒的酒精度、残
糖、酸度和总酯等理化指标。
酒精度的测定：密度瓶法 [16]；pH 值的测定：采
用 pH 计法；总糖的测定：手持测糖仪；酸度的测
定：滴定中和法[17]；总酯的测定：蒸馏皂化法[18]。
葡萄酒活性干酵母的复水活化：取干酵母，按
1∶20 的比例投放于 2%蔗糖水溶液中， 调制成乳
液，在 36～40 ℃水浴中活化 30 min，摇匀备用。
2.4 酵母菌发酵力测试
采用 CO2失重法[19-20]，将活化好的优选酵母菌
液和 CK 菌液接入已灭菌的麦芽汁培养基中，接
种完毕，称重发酵瓶，28 ℃培养，连续发酵 12 d，然
后每天称重 1次。称重前先摇晃瓶子，除去二氧化
碳。以产生 CO2的量（发酵瓶失重）为纵坐标，发酵
198
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时间为横坐标，绘制发酵速率曲线。
2.5 凝聚性测定
将活化好的菌株和 CK 分别接种于麦芽汁液
体培养基中，28℃培养 5 d。取培养液置离心管中，
3 500 r/min离心 15 min，收集酵母细胞。 用无菌水
洗涤 2～3 次，取酵母泥 1 g，放入 15 mL 离心管中，
加入 10 mL pH 4.5 的醋酸缓冲溶液，摇匀，使其
成悬浮状态，20℃水浴中静置 20 min。将此悬浮液
连续摇动 5 min，让酵母重新悬浮，再静置，记录
10 min 时沉淀酵母的容积， 即酵母细胞沉淀的体
积，本斯值。 凝聚性强弱依据本斯值来确定[21]。
2.6 山乌桕蜂蜜酒酵母菌的分子生物学鉴定
为进一步确定优良酵母的种属地位， 从酵母
菌初筛、 复筛的实验结果中挑选 1 株代谢旺盛的
供试酵母菌，用无菌水洗涤。 用酵母基因组 DNA
试剂盒提取酵母的 DNA。 以扩增酵母菌 26S rD-
NA序列的通用引物设计 PCR 扩增引物， 上游引
物 5’ -GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG -3’，
下 游 引 物 5’ -GGTCCGTGTTTCAAGACGG -3’。
PCR 反应体系 25 μL， 其中 10×PCR Buffer 2.5
μL，dNTP 2.0 μL，10 μmol/L 上、 下游引物各 0.5
μL， 酵母基因组 DNA 1.0 μL，Tag DNA 聚合酶
0.5 μL， 其余为 ddH2O。 反应条件：94 ℃变性 3
min；94 ℃变性 50 s，55 ℃复性 50 s，72 ℃延伸 1.5
min，共 30个循环； 72℃延伸 10 min。扩增产物与
PGEM easy-T 载体连接（美国 Promega），阳性克
隆经酶切鉴定后在 Invitrogen公司测序。所得序列
用 Blast 软件与 GeneBank 中的其它酵母菌 26S
rDNA序列进行比对，找出与其相似性最高的序列
及酵母菌种类， 用 MEGA 4.0 软件采用邻近法
（Neighbor-Jointing） 进行系统进化树的构建与分
析[22]。
2.7 山乌桕蜂蜜酒香味成分的 GC-MS 分析
2.7.1 山乌桕蜂蜜酒的制备 将山乌桕蜜调整为
起始糖度 25%， 接种量 8%，0.15%阿米诺酶，pH
4.0，28℃恒温，发酵 7 d，澄清后备用。
2.7.2 山乌桕蜂蜜酒香气成分分析 采用固相微
萃取技术提取香气成分。量取 8 mL山乌桕蜂蜜酒
样品，加入 15 mL的顶空瓶中，40℃水浴下插入萃
取头，吸附 30 min，取出萃取头，将其插入 GC 进
样口，250 ℃条件下解吸 30 min， 用于 GC-MS 分
析。
气相色谱条件： 色谱柱 PEG，30 m×0.25 mm×
0.25 μm； 程序升温，40 ℃保持 4 min，6 ℃/min 升
至 90 ℃，10 ℃/min 升温至 230 ℃， 保持 5 min；载
气 He，流速 0.80 mL/min，不分流。 质谱条件：EI电
离源，电子能量 70 eV，离子源温度 200℃。
3 结果与分析
3.1 蜂蜜酵母菌的分离纯化
选择分离较好的稀释度平板，初步分离到 39
株酵母菌（见表 1）。 通过沙氏培养基得到酵母 22
株，占筛选总菌数的 56.41%。 由麦芽汁培养基培
养的酵母 17株，占 43.59%。
培养基 颜 色 细胞形状 生殖特征 菌株数
沙氏培养基
白色 椭圆形 两端出芽 8
乳白色 椭圆形 单、多端出芽 9
淡黄色 圆形 两端出芽 5
麦芽汁培养基
乳白色 圆形 多端出芽 9
白色 卵圆形 两端出芽 3
淡黄色 椭圆形 单、多端出芽 3
黄色 椭圆形 两端出芽 2
表 1 酵母菌的分离
Table 1 Isolation of yeast strains
3.2 分离菌的初筛
以起酵时间为指标。从分离的 39株酵母菌中
筛选出起酵时间在 24 h以内的酵母菌。 将分离菌
28℃发酵 48 h，用杜氏管检测，结果有 5 株分离菌
山乌桕蜂蜜酒酿造酵母的筛选、鉴定及应用 199
中 国 食 品 学 报 2013 年第 10 期
产气充满杜氏管，说明这些酵母菌起酵能力较强，
有较好的发酵力和发酵度。 筛选菌产气情况见
表 2。
3.3 分离菌的复筛
3.3.1 耐受力 分离菌的耐性实验结果见表 3。
发酵 24 h 后， 酵母 S2 具有良好的耐性。 S11 在
30%糖含量的山乌桕蜂蜜稀释液培养环境下，产
气量为杜氏小管体积的 2/3；S21 在 20%酒精，200
mg/L NaHSO3条件下， 产气量为杜氏小管体积的
2/3；S33 在 30%糖含量的蜂蜜溶液、pH 4.0 条件
下，产气量为杜氏小管体积的 2/3；S37 在 200 mg/
L NaHSO3培养实验中，产气量为杜氏小管体积的
2/3。经综合分析，S2适合山乌桕蜂蜜酒耐性需求。
3.3.2 发酵性能的测定 将分离的优选菌发酵
7d，其常规指标测定结果见表 4。 S11 酵母发酵液
残糖高；S33 酵母发酵液酒精度低，残糖高，酸度
较高， 总脂低；S21 酵母发酵液残糖低， 总酯低；
S37 酵母发酵液酒精度高，残糖低，总酯较高；S2
发酵 7d 后酒精度最高达 13.12%， 酯含量最高达
2.3%，，其酸度最低。 与葡萄酒活性干酵母（CK）相
比，S2产酒高，酸度低，总酯高，残糖低。 可见葡萄
酒酵母利用较多的糖来生长繁殖， 而不是转化为
酒精，从而降低了酒精转化率。其他 4种酵母的酒
精度均低于葡萄酒活性干酵母。最终选择 S2酵母
作为生产乌桕蜂蜜酒的菌种。
3.4 发酵力测试
发酵力是在一定时间内， 酵母对可发酵性糖
的利用能力，是酵母主要的性能之一[20]。 由图 1可
知， S2 发酵力强，发酵 12 d，发酵力达 11.761 g。
发酵旺盛期是前 4 d， 第 4 天发酵力最高达 2.772
g。 对照葡萄酒活性干酵母的发酵力是 10.289 g。
3.5 凝聚性测定
研究表明， 酵母的凝聚性能对蜂蜜酒酿造十
分重要。 凝聚性适中的酵母不仅有利于优化生产
工艺，而且能改善酒风味。 在酿造过程中，如果凝
聚性太强就可能产生较早的沉降， 从而影响发酵
起酵时间/h 产气情况 菌株数
24 + 3
24 ++ 4
24 +++ 2
48 + 4
48 ++ 7
48 +++ 3
表 2 酵母菌起酵时间
Tab1e 2 Ferment time of yeast strains
注：“+”产气量为杜氏小管体积的 1/3；“++”产气量为杜氏小管体
积的 2/3；“+++”产气量为杜氏小管满体积。
菌株 耐高渗 耐酒精 耐 SO2 耐 pH 值
S2 +++ +++ +++ +++
S11 ++ +++ +++ +++
S21 +++ ++ ++ +++
S33 ++ +++ +++ ++
S37 +++ +++ ++ +++
表 3 分离菌耐性测定结果
Table 3 Tolerance results of yeast strains
注：“+”产气量为杜氏小管体积的 1/3；“++”产气量为杜氏小管体
积的 2/3；“+++”产气量为杜氏小管满体积。
菌株
酒精度
（体积分数）/%
残糖/% 酸度/% 总酯/%
S2 13.12 9.0 0.053 2.30
S11 11.50 10.0 0.056 1.84
S21 11.97 9.0 0.057 1.53
S33 9.35 11.5 0.058 1.22
S37 12.66 9.0 0.059 1.92
CK 12.73 9 .6 0.059 1.84
表 4 不同酵母菌对山乌桕蜂蜜酒发酵的影响
Table 4 Effects of different yeast for Sapium discolor
mead fermentation
S2
CK
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
发酵时间/d
图 1 酵母菌 S2 发酵力曲线图
Fig.1 The fermentation capacity curve of yeast S2
失
重
量
/g
200
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度。 若搅拌则会增加动力消耗，影响产品风味[20]。
凝聚性也是酵母菌选种的一项重要指标。酵母菌
S2 凝聚性测定结果见表 5。 S2 的凝聚性较高，略
高于葡萄酒活性干酵母，有利于山乌桕蜂蜜酒的
澄清和沉淀，节约成本。
3.6 酵母菌的分子鉴定
使用引物 NL-1 和 NL-4 对 S2 酵母的 26S
RdnaD1/D2 基因序列进行扩增， 其测序结果如
下：
酵母 本斯值/mL 凝聚性
S2 1.8 较强
CK 1.6 较强
表 5 酵母菌凝聚性能测定结果
Table 5 The flocculability detection results
in Microzyme
注：本斯值大于 2 mL 为凝聚性强，小于 0.5 mL 为凝聚性弱[11]。
1 GGTCCGTGTT TCAAGACGGG CGGTTTGGGA TCATTATGCC AGCATCCTTG
51 ATAAAATCGC AGTCCTCGGT CTAGGCAGGC AGCATCAACG CAGGCTATAA
101 CACTTCACCG AAGTAAAGTC ACATTCCTAC GCCATTATCC TACCGCCCAA
151 ACCGATGCTG GCCCGATAAG CTGCGGGTCA CCCCGCCACG AAGGCAAGGC
201 TCACAAAATA TCGAGTCTGA TCTCAAACCC TTCCCTTTCG ACAATTTCAC
251 GTACTTTTTC ACTCTCTTTT CAAAGTTCTT TTCATCTTTC CATCACTGTA
301 CTTGTTCGCT ATCGGTCTCT CGCCAATATT TAGCTTTAGA TGGAATTTAC
351 CACCCACTTA GAGCTGCATT CCCAAACAAC TCGACTCTTC GAAAGCACCT
401 TACATAGAATT GGGCATCTCA TCGCACGGGA TTCTCACCCT CTGTGACGTC
451 CTGTTCCAAG AAACATAGAC AAGAGCCAAC CCCAAGGTTA CAATCTTCAA
501 ATTACAACTC GGACACCGAA GGCGCCAGAT TTCAAATTTG AGCTTTTGCC
551 GCTTCACTCG CCGCTACTAA GGCAATCCCT GTTGGTTTCT TTTCCTCCGC
601 TTATTGATAT GCA
将所获菌株的 26S rDNA ITS 序列（GenBank
登录号 JX233487） 与 NCBI 中相似性较高的几株
酵母菌的 26S rDNA ITS 序列进行比对， 酵母菌
S2 与已报道的季也蒙毕赤酵母（Pichia-guillier-
mondii）（EU177574）的亲缘关系最近，两者的 26S
rDNA 相似性为 99% ； 与已发表的毕赤酵母
（Pichia） （FN398021） 的 26S rDNA 相似性也为
99%。 据此可认为 S2 菌株属于酵母属的毕赤酵母
属（Pichia）。 用 Mega 4.0软件构建系统进化树，如
图 2 所示。
季也蒙毕赤酵母（EU177574）
S2（JX233487）
毕赤酵母（FN398021）
子囊菌（Uncultured-ascomycete）（AJ876778）
果生假丝酵母（Candida-carpophila）（FM180531）
甘蔗毕赤酵母（Pichia-caribbica）（EF063131）
假鲁氏结合酵母（Zygosaccharomyces-pseudorouxii）（AM947681）
鲁氏结合酵母（Zygosaccharomyces）（AM943656）
结合酵母（Zygosaccharomyces）（AM911009）
0.02
70
66
99
67
图 2 不同酵母菌株的 26S rDNA 系统发育进化树
Fig.2 The phylogenetic tree for 26S rDNA System of different yeast strains
山乌桕蜂蜜酒酿造酵母的筛选、鉴定及应用 201
中 国 食 品 学 报 2013 年第 10 期
3.7 山乌桕蜂蜜酒香味成分的 GC-MS 分析
山乌桕蜂蜜酒主要香味成分的 GC-MS 分析
总离子流图见图 3。 共检出 65 种香味成分物质，
这些香味物质的质谱图与 NIST 标准谱的匹配度
均在 80%以上。
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0 5 10 15 20 25 30
保留时间/min
图 3 山乌桕蜂蜜酒香味成分的 GC-MS 分析总离子流图
Fig.3 GC/MS total ion ehromatogram of aroma components in Sopium discotor honey mead
相
对
丰
度
表 6 列出检出的山乌桕蜂蜜酒中的香味成
分。 其中检出保留时间及峰面积的有 61 种，确定
化合物成分的 55 种 ， 其含量占挥发性成分的
97.74%，包括醇类化合物 21 种，占 22.83%；酯类
化合物 17 种 ，占 14.88%；醛类化合物 4 种 ，占
2.32%；烃类化合物 5 种，占 0.92%；酚类化合物 4
种，占 0.79%；酮类化合物 2 种，占 0.37%；酸类化
合物 1 种，占 0.07%。 超过 1%保留峰面积的主要
香气成分 9 种，占总体香气成分的 89.01%，主要
为乙醇 （41.93% ）、异戊醇 （21.37% ）、苯乙醇
（8.86%）、乙酸乙酯（7.97%）、异丁醇（3.22%）、苯
甲醛（1.87%）、乙酸异戊酯（1.48%）和辛酸乙酯（1.27%）。
序号 时间/min 香味成分 相对含量/% 序号 时间/min 香味成分 相对含量/%
1 11.93 异戊醇 21.37 28 8.84 乙酸异戊酯 1.48
2 4.51 乙醇 41.93 29 10.44 丙烯酸丁酯 0.13
3 6.86 丙醇 0.15 30 11.81 丙酸异戊酯 0.1
4 8.68 异丁醇 3.22 31 12.18 己酸乙酯 1.04
5 10.17 丁醇 0.07 32 13.22 2-羰基丙酸乙酯 0.09
6 22.69 苯乙醇 8.86 33 14.9 乳酸乙酯 0.24
7 16.87 庚醇 0.21 34 16.44 辛酸乙酯 1.27
8 17.11 氧化芳樟醇 0.34 36 17.78 2-羟基-4-甲基戊酸乙酯 0.22
9 17.38 2-乙基-1-己醇 0.34 37 19.38 癸酸乙酯 0.35
10 14.1 4-戊烯-1-醇 0.01 38 19.89 丁二酸二乙酯 0.24
11 19.69 壬醇 0.22 39 21.45 4-羟基丁酸乙酯 0.17
12 20.19 萜品醇 0.06 40 21.6 对乙基苯甲酸苯乙酯 0.88
13 20.46 甲硫基丙醇 0.13 41 17.85 苯甲醛 1.87
14 20.97 香茅醇 0.36 42 24.04 肉桂醛 0.24
15 21.51 异香叶醇 0.27 43 15.72 壬醛 0.2
表 6 山乌桕蜂蜜酒香味成分
Table 6 Aroma components of Sapium discolour mead
202
第 13 卷 第 10 期
17 18.36 辛醇 0.15 45 17.94 2H-2-甲基-3【2H】-噻酮 0.12
18 18.64 2，3-丁二醇 0.09 46 13.6 3-羟基-2-丁酮 0.25
19 23.91 橙花醇 0.09 47 24.51 2-甲氧基-4-乙烯基苯酚 0.11
20 26.11 2，3-二氢法尼醇 0.11 48 23.61 苯酚 0.08
21 24.88 柏木脑 0.1 49 26.34 对特丁基苯酚 0.09
22 15.12 己醇 0.07 50 26.48 2，4-二特丁基苯酚 0.51
23 3.41 乙酸乙酯 7.97 51 16.21 四甲苯 0.14
24 5.93 乙酸异丁酯 0.3 52 15.2 1-乙基-2，3-二甲基苯 0.15
25 6.56 丁酸乙酯 0.1 53 17.47 4-甲基茚 0.17
26 7.53 乙酸丁酯 0.01 54 20.75 萘 0.06
27 25.98 棕榈酸乙酯 0.29 55 22.91 辛酸 0.07
16 18.15 芳樟醇 0.24 44 7.73 己醛 0.01
序号 时间/min 香味成分 相对含量/% 序号 时间/min 香味成分 相对含量/%
（续表 6）
4 结论与讨论
从陈旧蜂蜜中分离出 39 株酵母菌， 通过镜
检、杜氏管发酵法进行初筛，得到 5 株酵母菌。 通
过产酒精能力测、耐性能力、发酵力测试以及凝聚
性比较，进行复筛，得到 1 株适合山乌桕蜂蜜酿酒
的优良酵母 S2。 采用 26S rDNA D1 ／D2区序列分
析，对优选的酵母菌株进行分子生物学鉴定，结果
该酵母菌 S2 与季也蒙毕赤酵母（Pichia-guillier-
mondii）（EU177574）的遗传距离最近，两者的同源
性位 99%，经鉴定为毕赤酵母属（Pichia）。
由实验分离筛选的酿酒酵母均来自自然发酵
的蜂蜜， 与葡萄酒活性干酵母相比， 起酵时间较
早，在工业生产上可大大缩短主发酵时间。在山乌
桕蜂蜜起始糖度 25%， 接种量 8%，0.15%阿米诺
酶，pH 4.0，28 ℃条件下发酵 7 d， 结果酒精度为
13.12％，残糖量为 9.0 g/L，达到国家标准（GB15037-
2006葡萄酒产酒精度 7.0 以上）的要求，所酿制的
蜂蜜酒具有独特的蜂蜜和酒香味。
蜂蜜酒香气是评判酒品质的一个重要的感官
指标。芳香物质是构成蜂蜜和蜂蜜酒的重要成分。
通过 GC-MS技术分析山乌桕蜂蜜酒香气成分，结
果表明醇类和酯类含量最高，共鉴定出 55 种香味
化合物， 占总香气成分的 97.74%， 包括酯类、醇
类、醛类、烃类、酚类和酸类。其中酯类和醇类含量
高，主要赋予山乌桕蜂蜜酒的酒香味。影响山乌桕
蜂蜜酒香气形成的因素主要有：蜂蜜原料、菌种和
发酵工艺条件等， 其中工艺条件和菌种是影响山
乌桕蜂蜜酒香气的决定因素。 感官特征由香气成
分的数量、感觉阈值、种类及各成分间相互协调作
用决定 [23]。 本研究仅在特定菌种和发酵水平条件
下分析山乌桕蜂蜜酒香气成分， 其主要差异是部
分醇酯类、绝大多数的醛酮和萜烯类物质的差别。
己酸乙酯（1.48%）具有较强的新鲜果香和蜂蜜香
气[24]，可构成山乌柏蜂蜜酒典型香气成分。 在酿制
时把握香气成分形成的关键点， 对山乌桕蜂蜜酒
的生产有着重要的意义。
参 考 文 献
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Isolation， Identification of Honey Yeast for Sapium Discolor Mead and Application
Shi Ying Zhang Lizhen Zeng Zhijiang Wang Zilong Yan Weiyu*
（Honeybee Research Institute， Jiangxi Agricultural University， Nanchang 330045）
Abstract Objective： The super yeast for Sapium discolor mead were screened from natural honey and identified by
molecular biology， and analyzed the components of aroma in mead. Methods： The yeast strains were isolated from natural
fermentation old honey by enrichment culturing and lineation separating， and screened preliminarily by microscopy and
Du’s small pipe fermentation. The yeast strains were secondary screened by alcoholic yield test，tolerance test，fermentation
capacity and floeculability comparison， then was identified by 26S rDNA Dl/D2 domain sequences and phylogenetic den-
drogram construction. Aroma components of Sapium discolor mead was analyzed by gas chromatography-mass spectrometry
（GC-MS）. Results： 39 yeast were isolated form natural fermented honey.1 yeast strains had been screened and labeled
S2 as optimal yeast. 7d fermentation of yeast strain S2 in the 30% sugar concentration， 20% alcohol， 200 mg/L SO2 and
pH 4.0 conditions， ethanol concentration was 13.12% ， the mead had typical flavor. Yeast S2 had the nearest heredity
distance with Pichia-guilliermondii and Pichia， and their gene sequence homology comparison were 99%. 55 compounds
were identified form Sapium discolor mead and the relative contents of aroma components were 97.74%. Conclusions： The
screened yeast S2 was the most suitable strain for mead，and it was identified as Pichia. The most aroma components of
the mead were alcohols and esters.
Key words Sapium discolor mead； yeast； isolation； identification； aroma analysis
204