全 文 ：铁包金在血清、血浆、尿液及粪便中的 HPLC指纹图谱
彭 梅1， 严志孟2， 杨 娟1， 朱海燕1*
(1． 贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州 贵阳 550002;2． 贵阳医学院，贵州 贵阳 550004)
收稿日期:2015-04-23
基金项目:贵州高层次人才科研条件特助经费项目 (TZJF-2011-55)
作者简介:彭 梅 (1985—) ，女，硕士，助理研究员，从事天然产物分离纯化及活性研究。Tel:15086020961，E-mail:pengmei520@
163． com
* 通信作者:朱海燕 (1978—) ，女，助理研究员，从事天然活性成分研究。Tel: (0851)83804370，E-mail:little_ zhy@ 163． com
摘要:目的 建立铁包金 Berchemia lineata 在血清、血浆、尿液及粪便中的 HPLC 指纹图谱，并进行体内定性分析。
方法 大鼠灌胃铁包金水提物后，建立血清、血浆、尿液、粪便中的 HPLC指纹图谱，并比较其相似度。结果 与给
药前的指纹图谱相比，9 个移行成分以原型入血，7 个入尿，2 个入粪便。结论 铁包金中的大部分成分以原型入血，
然后被肾脏代谢，进入尿液。
关键词:铁包金;HPLC指纹图谱;血清;血浆;尿液;粪便
中图分类号:R284. 1 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2016)02-0356-05
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2016. 02. 027
HPLC fingerprints of Berchemia polyphylla in serum，plasma，urine and stool
PENG Mei1， YAN Zhi-meng2， YANG Juan1， ZHU Hai-yan1*
(1． The Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Provincial and Chinese Academy of Sciences，Guiyang 550002，China，2． Guiyang
Medical College，Guiyang 550004，China)
ABSTRACT:AIM To establish the HPLC fingerprints of Berchemia polyphylla in serum，plasma，urine and
stool for qualitative analysis in vivo． METHODS After rats were intragastrically administrated with B． polyphylla
water extract，the HPLC fingerprints in serum，plasma，urine and stool were established，then their similarities
were compared． RESULTS Compared with the fingerprints before administration，nine prototype constituents
were absorbed into blood，seven constituents were absorbed into urine，and two constituents were absorbed into
stool． CONCLUSION Most constituents in B． polyphylla exist in blood in their original forms，then they are
metabolized by kidney and enter urine．
KEY WORDS:Berchemia polyphylla;HPLC fingerprints;serum，plasma;urine;stool
铁包金 Berchemia lineata 为鼠李科植物，别名
老鼠耳、米拉藤、小叶黄鳝藤，具有祛风利湿、止
咳祛痰、活血止痛等作用［1］，用于跌打损伤、痈
肿疮毒［2］、肿瘤［3］、毒蛇咬伤等［4-5］。由于其作用
成分较多，疗效复杂，因此建立准确简单的定性分
析方法是其体内研究的基础［6-8］。本实验在前期铁
包金体外指纹图谱的基础上，进一步建立其进入血
清、血浆、尿液、粪便的指纹图谱，可对铁包金药
材的体内代谢进行研究，并为其临床给药提供一定
的指导依据。
1 仪器及材料
Agilent 1100 高效液相色谱仪 (美国 Agilent 公
司) ;Millipore-0026 超纯水机 (美国 Millipore 公
司) ;JA2003 精密电子天平 (上海恒平科技有限公
司) ;TGL-16B离心机 (上海安亭科技有限公司)。
乙腈为色谱纯 (德国 Merck 公司) ;甲醇为色谱纯
(美国 Tedia公司)。芦丁、槲皮素 (中国药品检验
所) ;肝素钠 (北京鼎国昌盛生物技术有限责任公
司，批号 0BC10650)。
铁包金药材采自贵州贵阳，经贵阳中医学院孙
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庆文副教授鉴定。Wistar 大鼠，雌雄各半，由重庆
腾鑫实验动物中心提供，合格证号 SCXK (渝)
2012-0006，体质量 180 ～ 240 g。
2 方法与结果
2. 1 样品的制备
2. 1. 1 标准品及铁包金体外样品的制备 精密称
取槲皮素标准品 2. 5 mg、芦丁标准品 2. 0 mg，甲
醇溶解，定容至 10 mL量瓶中，制成 0. 25 mg /mL、
0. 20 mg /mL的对照品溶液。
2. 1. 2 铁包金供试品溶液的配制 称取铁包金药
材 5. 0 g，加入 30 倍量蒸馏水，猛火煮沸后文火煎
煮 45 min，过滤后浓缩滤液，滤渣再按上述方法煎
煮 2 次，合 并 提 取 液，浓 缩 至 干，加 入 甲
醇 ∶ 乙腈 ∶ 水 (8 ∶ 7 ∶ 15)的混合溶剂，定容至
25 mL，0. 45 μm微孔滤膜滤过，即得。
2. 1. 3 铁包金样品灌胃液配制及分组 将铁包金
药材粉碎称重后，加入 30 倍量水，按 “2. 1. 2”
项下方法煎煮制备成铁包金浸膏，再用 CMC-Na 配
制成含生药 125 mg /mL 的混悬液，即得灌胃液。
然后，将 12 只 Wistar大鼠 (雌雄各半)分为血清
组和血浆组，置于代谢笼中适应性饲养 7 d，采集
空白血清、血浆、尿液、粪便后开始给药。每只大
鼠给药 10 mL /kg，每天 2 次，连续 7 d。
2. 1. 4 血样供试品的制备［9-10］ 大鼠适应性饲养
7 d后，血清组眼静脉采血 0. 6 mL，4 ℃放置过夜，
4 500 r /min 离心 15 min，分离血清，取 250 μL，
加入 2 倍量甲醇-乙腈 (8 ∶ 7)混合溶剂，涡旋振
荡 30 s 后 8 000 r /min 离心 30 min，分离上清液，
即得空白血清供试品。然后，连续给药 7 d，末次
给药前 12 h 禁食不禁水，给药后眼静脉采血
0. 6 mL，按空白血清供试品制备方法得含药血清
供试品;血浆组眼静脉采血 0. 6 mL，加入 1%肝素
抗凝管中，4 500 r /min离心 15 min，分离上清液，
取 250 μL，加入 2 倍量甲醇-乙腈 (8 ∶ 7)混合溶
剂，涡旋振荡 30 s后 8 000 r /min 离心 30 min，分
离上清液，即得空白血浆供试品。然后，连续给药
7 d，末次给药前 12 h 禁食不禁水，给药后在设定
时间眼静脉采血 0. 6 mL，按空白血浆供试品制备
方法得含药血浆供试品。
2. 1. 5 空白尿液及粪便的制备［11-12］ 大鼠适应性饲
养7 d后，收集空白尿液，每只1 mL，4 500 r /min离
心 15 min，取上清液 500 μL，加入 2 倍量甲醇-乙
腈 (8 ∶ 7) ，涡旋振荡 30 s 后 8 000 r /min 离心
30 min，分离上清液，即得空白尿液供试品。另
外，每只大鼠取粪便 0. 8 g，加入 5 倍量甲醇 ∶ 乙
腈混合溶液，浸泡 1 h 后超声提取 20 min，过滤，
滤液 4 500 r /min 离心 10 min，静置 10 min 后再
4 500 r /min离心 10 min，分离上清液，即得空白
粪便供试品。大鼠连续给药 7 d，末次给药前24 h
禁食不禁水，给药后在设定时间收集大鼠尿液及粪
便，按空白尿液及粪便供试品制备方法得给药尿液
及粪便供试品。
2. 2 色谱条件 Boston C18色谱柱 (250 mm ×
4. 6 mm，5 μm) ;流动相甲醇 (A)-0. 1% 磷酸
(B)-乙腈 (C) ，梯度洗脱 (0 ～ 17 min，10% ～
22% A，90% ～ 78% B;17 ～ 35 min，35% A，
60% B，5% C;35 ～ 45 min，75% B，25% C;
45 ～ 55 min，35% C，65% B;55 ～ 65 min，35%
C，65% B;65 ～75 min，20% A，60% B，20% C;
75 ～80 min，10% A，90% B) ;检测波长 260 nm;
柱温 37 ℃;进样量 20 μL;体积流量 1 mL /min。
2. 3 最佳收集时间考察 取 Wistar 大鼠 (雌雄各
半) ，连续给药 7 d，于末次给药后 0. 5、1、2、
3. 5、5 h 眼 眶 取 血，收 集 尿 液、粪 便，按
“2. 1. 3”项下方法制备含药血清和血浆供试品，
按“2. 1. 4”项下方法制备含药尿液和粪便供试
品，在“2. 2”项色谱条件下进行测定，结果见图
1 ～ 4。
图 1 血清 HPLC色谱图
Fig. 1 HPLC chromatograms of serum
图 2 血浆 HPLC色谱图
Fig. 2 HPLC chromatograms of plasma
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图 3 尿液 HPLC色谱图
Fig. 3 HPLC chromatograms of urine
图 4 粪便 HPLC色谱图
Fig. 4 HPLC chromatograms of stool
由图可知，给药 1 h 后，血清、血浆及尿液中
铁包金样品的移行成分最多，响应值最高，故以给
药后 1 h为样品采集时间。另外，粪便中由于铁包
金样品的移行成分较少，而且内源性成分复杂，代
谢随时间的变化不明显，故也以给药后 1 h 为采集
时间。
2. 4 精密度、重复性试验 取同一份含药血清、
血浆、尿液、粪便样品，在 “2. 2”项条件下连续
进样 6 次，记录 80 min 色谱图，然后以血清中 11
号峰、血浆中 13 号峰、尿液中 11 号峰、粪便中 9
号峰为参比峰，计算各样品中主要共有色谱峰的相
对保留时间和相对峰面积。结果显示，血清样品各
共有峰的相对保留时间 RSD 均小于 0. 06%，相对
峰面积 RSD均小于 3. 16%;血浆样品各共有峰的
相对保留时间 RSD 均小于 0. 04%，相对峰面积
RSD均小于 2. 88%;尿液样品各共有峰的相对保
留时间 RSD 均小于 0. 1%，相对峰面积 RSD 均小
于 4. 89%;粪便样品各共有峰的相对保留时间
RSD 均小于 0. 97%，相对峰面积 RSD 均小于
4. 59%，说明仪器精密度良好。
取给药后 1 h 每组大鼠的血清、血浆、尿液及
粪便 6 份，在 “2. 2”项条件下连续进样，记录
80 min色谱图，然后以血清中 11 号峰、血浆中 13
号峰、尿液中 11 号峰、粪便中 9 号峰为参比峰，
进行计算。结果，血清样品中主要共有色谱峰的相
对保留时间 RSD 均 ＜ 0. 02%，相对峰面积 RSD ＜
2. 26%;血浆样品各共有峰的相对保留时间 RSD ＜
0. 03%，相对峰面积 RSD ＜1. 87%;尿液各共有峰
的相对保留时间 RSD ＜0. 15%，相对峰面积 RSD ＜
3. 73%;粪便样品各共有峰的相对保留时间 RSD ＜
0. 77%，相对峰面积 RSD ＜4. 45%，说明该方法重
复性良好。
2. 5 含药血清指纹图谱建立 图 5 是空白血清、
原药材及含药血清的指纹图谱，原药材中含有 14
个成分，其中 11 号峰鉴定为芦丁，13 号峰鉴定为
槲皮素。空白血清中有 6 个成分，扣除血清中内源
性成分，初步判定原药材中有 1、2、3、4、7、
11、13 这 6 个成分以原型进入血清，其余 3 个成
分可能为原型成分的代谢物。
图 5 药材、含药血清、空白血清的 HPLC色谱图
Fig. 5 HPLC chromatograms of samples，medicated
serum and blank serum
图 6 是 6 个批次的血清指纹图谱，将其导入
“中药色谱指纹图谱相似度评价系统 (2004 年 A
版)”计算相似度，设置中位数法生成对照图谱，
时间窗 0. 4 min，系统自动匹配，以 11 号峰为内参
比峰。结果，各共有峰的相对保留时间 RSD ＜
0. 69%，各共有峰的相对峰面积 RSD ＜ 4. 23%，6
个批次铁包金含药血清指纹图谱相似度均 0. 85 以
上。另外，各共有峰的相对保留时间相差不大，但
各共有峰的相对峰面积存在差异，说明铁包金样品
在大鼠体内的吸收存在个体差异。
2. 6 含药血浆指纹图谱的建立 图 7 是空白血浆、
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图 6 6 批血清样品中铁包金的 HPLC色谱图
Fig. 6 HPLC chromatograms of Berchemia polyphylla
in six batches of serum samples
药材、含药血浆的指纹图谱。由图可知，扣除空白
血浆中的 5 个内源性成分后，血浆中共含有 15 个
成分，通过与原药材中成分的保留时间及相似度比
较，初步推断其中 9 个移行成分以原型入血，其余
5 个成分可能为原药材的代谢成分。
图 7 药材、含药血浆、空白血浆的 HPLC色谱图
Fig. 7 HPLC chromatograms of samples，medica-
ted plasma and blank plasma
图 8 是 6 个批次大鼠血浆的指纹图谱，将其
导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统 (2004
年 A 版)”计算相似度，以 13 号峰为参比峰。结
果，各共有峰的相对保留时间 RSD ＜0. 91%，相对
峰面积 RSD ＜3. 45%，相似度在 0. 95 以上。
2. 7 尿液中指纹图谱的建立 图 9 是铁包金药材、
含药尿液、空白尿液的指纹图谱，其尿液中内源性
成分有 3 个，扣除后共有 19 个峰。其中，有 7 个
成分与原药的保留时间及相似度初步判定，以原型
图 8 6 批血浆样品中铁包金的 HPLC色谱图
Fig. 8 HPLC chromatograms of Berchemia polyphylla
in six batches of plasma samples
图 9 药材、含药尿液、空白尿液的 HPLC色谱图
Fig. 9 HPLC chromatograms of samples，medicated
urine and blank urine
进入尿液;有 11 个峰初步判定为其原药材的代谢
成分。
图 10 是 6 个批次的尿液指纹图谱，将其导入
“中药色谱指纹图谱相似度评价统 (2004 年 A
版)”计算相似度，以 11 号峰为参比峰。结果，
各共有峰的相对保留时间 RSD ＜ 0. 89%，相对峰
面积 RSD ＜ 4. 47%，相似度在 0. 87 以上。另外，
各共有峰相对保留时间的差异不大，但相对峰面
积有明显的差异，说明铁包金各成分在大鼠体内
代谢的时间基本一致，但吸收和被代谢有明显
差异。
2. 8 粪便中指纹图谱的建立 图 11 是铁包金样
品、含药粪便、空白粪便指纹图谱。由图可知，粪
便中的成分比较复杂，扣去内源性成分，共有 6 个
峰，其中 9 号和 12 号峰初步判定为原药材中的原
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图 10 6 批尿液样品中铁包金的 HPLC色谱图
Fig. 10 HPLC chromatograms of Berchemia polyphylla
in six batches of urine samples
图 11 药材、含药粪便、空白粪便的 HPLC色谱图
Fig. 11 HPLC chromatograms of samples，medicated
stool and blank stool
型成分，其余 4 个成分可能为原型成分的代谢
产物。
图 12 是 6 个批次的大鼠粪便指纹图谱，将其
导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统 (2004
年 A版)”计算相似度，以 9 号峰为参照峰，其各
共有峰的相对保留时间 RSD ＜0. 16%，相对峰面积
RSD ＜5. 17%，相似度在 0. 85 以上。
3 讨论
在处理血清、血浆中的蛋白质时，曾采用甲醇
或乙腈单独处理，发现其中铁包金样品的移行成分
减少，杂质较多，处理效果较差，而甲醇和乙腈混
合溶剂的效果较理想。另外，还比较了铁包金样品
在血清、血浆、尿液及粪便中吸收及代谢的 HPLC
指纹图谱，可初步判定其在血浆中被吸收的成分比
在血清中多。而且，大部分成分在尿液中被检测
到，说明铁包金样品中的大部分成分以原型成分进
入血液，并被肾脏代谢，进入尿液。
本实验建立了血清、血浆、尿液及粪便样品中
图 12 6 批粪便样品中铁包金的 HPLC色谱图
Fig. 12 HPLC chromatograms of Berchemia polyphylla
in six batches of stool samples
铁包金的 HPLC指纹图谱，其各共有峰的相对保留
时间 RSD ＜ 0. 90%，相对峰面积 RSD ＜ 5. 0%，6
批血清、血浆、尿液及粪便样品指纹图谱的相似度
均在 0. 85 以上，说明该图谱相对稳定、准确，可
以用于体内成分的定性分析。
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