全 文 ：Traditional Chinese Drug Research ＆ Clinical Pharmacology，2016 November，Vol． 27 No． 6
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（编辑：宋威）
收稿日期：2016-07-30
作者简介：刁建新，男，实验师，研究方向：中医药防治肝衰竭。Email：jianxindiao@163.com。通信作者：杨运高，博士，教授，主任医师，研
究方向：中医药防治肝衰竭。Email：yangyungao@263.net。
基金项目：国家自然科学基金（81173262）；广东省大学生创新创业训练项目（201512121057）。
铁包金通过APE1调节凋亡相关蛋白防治慢加急性肝衰竭大鼠的作用
刁建新，马文校，戴凤翔，李铭链，张婷婷，陆梓雯，杨运高（南方医科大学中医药学院，广东 广州 510515）
摘要：目的 观察铁包金对慢加急性肝衰竭的作用及其对无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶 1（APE1）、caspase3、bax、
bcl-2的影响。方法 取 SD大鼠 40只，随机分为 4组，每组 10只，分别为正常对照组、模型组、铁包金组
（8 g·kg-1·d-1）和安宫牛黄丸组（0.27 g·kg-1·d-1）。采用四氯化碳（CCL4）联合 D-氨基半乳糖（D-GalN）和脂多
糖（LPS）复制慢加急性肝衰竭模型。观察大鼠 48 h内的病死率。全自动生化仪检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）、
天冬氨酸转移酶（AST）、血清总胆红素（TBIL）的水平。HE染色观察肝脏病理变化。Tunel染色观察肝细胞凋亡
指数（AI）。免疫印迹检测 APE1、caspase3、bax 和 bcl-2蛋白的表达。共聚焦显微镜观察 APE1的原位表达。
结果 正常对照组、模型组、铁包金组和安宫牛黄丸组 48 h 病死率分别为 0 %、50 %、20 %和 20 %。与模
型组比较，铁包金组显著降低 ALT、AST、TBIL、AI、caspase3和 bax的水平，差异有统计学意义（P < 0.05）；
铁包金组可显著提高 APE1、bcl-2的水平，差异有统计学意义（P < 0.05）；铁包金组作用效果与安宫牛黄丸组
相当，差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。结论 铁包金对慢加急性肝衰竭具有一定的防治作用，可能是铁包金
通过 APE1/Ref-1调控凋亡相关蛋白防治慢加急性肝衰竭。
关键词：铁包金；慢加急性肝衰竭；无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶 1；半胱天冬酶 3；bax；bcl-2
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1003-9783（2016）06-0794-06
doi：10.19378/j. issn. 1003-9783. 2016. 06. 011
Preventive and Therapeutic Effects of Radix Berchemiae Lineatae on Acute-on-chronic Liver Failure
Rats Through Regulating APE1 Apoptosis-associated Proteins
DIAOJianxin，MAWenxiao，DAIFengxiang，LIMinglian，ZHANGTingting，LUZiwen，YANG Yungao（Schoolof
TraditionalChineseMedicine，SouthernMedicalUniversity，Guangzhou510115Guangdong，China）
794· ·
中药新药与临床药理 2016年 11月第 27卷第 6期
慢加急性肝衰竭 （acute-on-chronic liver failure，
ACLF） 是在慢性肝病的基础上，出现了急性的肝功
能失代偿，临床表现为黄疸、消化道出血、腹水、
肝性脑病、极度乏力、明显消化道症状[1]。慢加急性
肝衰竭死亡率高，治愈率低。迄今为止，对本病的
治疗均缺乏特效的药物和良好的手段。
铁包金[Berchemia lineate（L.）DC.]为鼠李科植物
老鼠耳的干燥根，具有消肿解毒、止血镇痛、祛风
除湿的功效，是岭南地区民间治疗肿瘤和多种炎症
性疾病的良好药方[2]。研究[3]显示，铁包金对急性肝
损伤具有保肝降酶退黄作用。但是，铁包金对ACLF
的防治作用尚未见报道。本实验旨在研究铁包金对
ACLF 大鼠的防治作用及其对 APE1 和凋亡蛋白的
影响。
1 材料与方法
1.1 动物 SD大鼠40只，8周龄，雌雄各半，体质
量180～220g，由南方医科大学动物中心提供，动物
合格证号：4402102032。大鼠分性别饲养于 SPF 级
环境内，室温（22±2）℃，湿度（60±5）%，自由
饮水和摄食。
1.2 主要试剂和药物 铁包金采于广西，经南方医科大
学中药鉴定教研室陈兴兴教授鉴定为真品，属鼠李
科植物铁包金（Berchemialineata（L）DC.［Rhamnuslineata
L］）的根。安宫牛黄丸，北京同仁公司。D-氨基半乳
糖（D-GalN）、脂多糖（LPS），美国Sigma公司；AST、
ALT、TBIL、Tunel 试剂盒，Roche 有限公司；Actin
鼠多克隆抗体，中杉金桥生物试剂有限公司；APE1
抗体，美国 abcom公司；caspase3、bcl-2、bax兔多
克隆抗体，美国cellsignaling有限公司。总蛋白提取
及定量试剂盒，碧云天试剂有限公司；ECL发光液、
PVDF膜，购于MerckMillipore；荧光二抗Cy3，凯基
生物科技有限公司。
1.3 主要仪器 德国莱卡石蜡切片机；意大利爱康
全自动生化仪（型号：ECHOPLUS）；日本尼康Eoipse
Ti-s荧光倒置显微镜及分析软件；Thermo全波段酶
标仪；美国Bio-Rad公司电泳系统和湿转转膜系统；
柯达2000MM全光谱多功能活体成像系统；日本尼
康激光共聚焦显微镜。
1.4 分组、模型复制及给药 取SD大鼠40只，按性
别随机分为 4组，正常对照组、模型组、铁包金组
和安宫牛黄丸组，每组10只。大鼠在SPF级条件下
适应性饲养l周后，除正常对照组外，其余3组大鼠
以2mL·kg-1腹腔注射40 %四氯化碳（CCL4）花生油
溶液，每周2次，连续10周，建立肝硬化模型。确
认肝硬化形成后，铁包金以8g·kg-1·d-1生药灌胃连
Abstract：Objective Toobservethetherapeuticeffects of Radix Berchemiae Lineatae（Tiebaojin）onacute-on- ronic
liver failure（ACLF）rats，and to investigate its influence on regulating apurinic/apyrimidinic endonuclease 1（APE1），
caspase3，bax，and bcl-2 protein.Methods SD ratswererandomly divided into normal control group，model group，
Tiebaojin group（8 g·kg-1·d-1），andAngong Niuhuang Wan group（0.27g·kg-1·d-1）. Weadopted carbon tetrachloride
（CCL4）combined with D-galactosamine（D-GalN）and lipopolysaccharide（LPS）to establish ACLF rat model，and
observed the rat mortality within 48 h. Automatic biochemical analyzer was used to detect the serum levels of alanine
aminotransferase（ALT），aspartatetransaminase（AST），andtotalbilirubin（TBIL）. HEstainingwasusedtoobservethe
liverpathology.Tunelstainingwasappliedtoobservethelivercellapoptoticindex（AI）. APE1，caspase3，baxandbcl-2
protein expression was examined by Western blotting，and in-situ expression of APE1 was observed by confocal
microscopy.Results The48-hmortalityofnormalcontrolgroup，modelgroup，Tiebaojingroup，andAngo g Niuhuang
Wan group was 0 %，50 %，20 % and 20 % respectively. Compared with the model group，Tiebaojin group had
significanteffectonreducingALT，AST，TBIL，AI，caspase3andbaxlevels（P<0.05），increasingthelevelsofAPE1
and bcl-2（P < 0.05）. The effects ofTiebaojin were similar to those ofAngong Niuhuang Wan（P > 0.05）.Conclusion
Tiebaojin exerts certain preventive and therapeutic effect on ACLF，and the effect is likely to be achieved through
regulatingAPE1/Ref1apoptosis-associatedprotein.
Keywords：Radix Berchemiae Lineatae（Tiebaojin）；acu e-on-chronic liver failure；apurinic/apyrimidinic endonu-
clease 1（APE1）；caspase 3；bax；bcl-2
795· ·
Traditional Chinese Drug Research ＆ Clinical Pharmacology，2016 November，Vol． 27 No． 6
组别
正常对照组
模型组
铁包金组
安宫牛黄丸组
n
10
5
8
8
剂量/g·kg-1·d-1
-
-
8
0.27
AST
130.40±3.78
913.0±3 .61△△
394.60±4 .48**
395.2± 1.36**
ALT
27.60±1.52
658.00±29.74△△
2 5.24±7.97**
282.54±28.59**
TBIL
2.96±0.53
115.36±6.82△△
43.44±5.74**
44.04±6.57**
续1周，安宫牛黄丸以0.27g·kg-1·d-1连续灌胃1周，
然后，以400mg·k-1D-GalN和10μg·kg-1LPS一次
性腹腔联合注射复制慢加急性肝衰竭模型。急性打
击后正常饲养，观察大鼠的行为活动、记录48h的
死亡情况。48h后用10%水合氯醛以3.5mL·kg-1麻
醉大鼠，腹主动脉采血，3000r·min-1离心，分离血
清置于-80℃保存，取肝组织，部分浸泡于4%多聚
甲醛，部分置于-80℃冰箱保存。
1.5 肝脏功能检测 全自动生化检测仪检测各组大鼠
血清中ALT、AST、TBIL的水平。
1.6 病理形态学观察 切取肝大叶部分组织，用10%
甲醛溶液固定，按照常规脱水，石蜡包埋，切片 4
μm厚度，进行苏木精-伊红染色，每只大鼠组织制
作2 张切片，随机抽取1张在高倍显微镜下随机选
取 5 个视野观察肝细胞炎症浸润、肝细胞结节坏
死或大面积坏死。应用 Nikon Eoipse Ti-s 倒置显微
镜观察图像。
1.7 TUNEL检测肝细胞的凋亡指数（AI） 石蜡组织
切片常规脱蜡及水化，每5minPBS漂洗2次，加入
蛋白酶K工作液37℃反应30min，每 5minPBS漂
洗3次，滴加3%双氧水室温封闭15min，每5min
PBS 漂洗 2 次，吸水纸吸干，滴加 TdT 酶反应液，
加盖玻片37℃避光湿盒中反应60min，每5minPBS
漂洗3次，滴加Streptavidin-HRP工作液，加盖玻片
37℃湿润避光反应30min，每5minPBS漂洗3次，
滴加 DAB 工作液，室温孵育 30 min，每 5 min PBS
漂洗3次，应用NikonEoipseTi-s倒置显微镜观察、
拍照、分析。
1.8 免疫荧光检测 APE1 原位表达 组织切片放置
60℃烘烤60min，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，PBS
洗5min×3次。进行枸橼酸盐微波热修复，室温自
然冷却。1%Triton-100渗透5min，3%H2O2内源性
室温封闭10min，5％BSA外源性封闭30min，滴加
一抗，将切片放置湿盒，4℃孵育过夜。PBS 洗 5
min×3次，滴加二抗（避光）37℃孵育1h。PBS洗5
min×3 次，滴加 DAPI 工作液染核，室温孵育 10
min。PBS洗5min×3次，滴加5~10μL抗荧光衰减
封片剂封片，共聚焦显微镜拍照观察并通过随机软
件进行荧光含量的分析。
1.9 蛋白质免疫印迹（Western blot）检测 APE1/Ref-1，
caspase3，bcl-2，bax蛋白表达 取50mg肝脏组织
进行蛋白裂解，BCA法蛋白定量，10%SDS凝胶电
泳，然后转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。5％的
脱脂牛奶封闭，一抗 APE1/Ref-1（1∶1000 稀释），
caspase3（1∶1000稀释），bcl-2（1∶1000稀释），bax
（1∶1000稀释），4℃孵育过夜。HRP偶联的相应二
抗（1∶1000） 室温孵育60min。用化学发光试剂显影
（ECL），柯达 2000 MM 图像工作站分析蛋白表达情
况，目的蛋白含量与对应内参的比值，代表该目的
蛋白的表达量。
1.10 统计学处理方法 采用 SPSS13.0 统计学软件，
数据采用“均数±标准差”表示，多样本均数比较
采用One-WayANOVA方差分析，组间多重比较若符
合方差齐性检验时应用LSD法，若方差不齐时则采
用TamhaneT2法。
2 结果
2.1 大鼠 48 h内的病死率 慢性的基础上急性打击
后，大鼠活动减少，畏缩成团，48h内模型组的病
死率为50%，铁包金组和安宫牛黄丸组病死率分别
为20%和20%。
2.2 肝脏功能检查结果 与正常对照组比较，模型组
大鼠ALT、AST和TBIL的水平明显升高，差异有统
计学意义（P<0.01）；与模型组比较，铁包金组和安
宫牛黄丸组均能降低大鼠 ALT、AST 和 TBIL 的水
平，差异有统计学意义（P < 0.01）；与安宫牛黄丸组
比较，铁包金组大鼠ALT、AST和TBIL的水平基本
相当 差异无统计学意义（P >0.05）。见表1。
表 1 铁包金对慢加急性肝衰竭大鼠血清 AST、ALT、TBIL
的影响（x± s，U·L-1）
Table 1 Effect ofTiebaojin on AST， ALT and TBIL in rats with
ACLF
注：与正常对照组比较，△△P<0.01；与模型组比较，**P<0.01。
2.3 肝脏病理形态观察 HE染色，光镜下正常对照
组肝小叶结构清晰，肝细胞排列规则有序。模型组
肝细胞大块、亚大块坏死，肝索紊乱，小叶结构模
糊不清，肝窦明显扩张充血，小叶内及汇管区炎性
细胞浸润，残存肝细胞水肿变性。铁包金组具有改
善病理损伤的作用，细胞肿胀减轻，坏死肝细胞减
少，结节状也少，安宫牛黄丸组肝细胞坏死面积减
小，肿胀减轻，铁包金组与安宫牛黄丸组作用相当，
见图1。
796· ·
中药新药与临床药理 2016年 11月第 27卷第 6期
2.4 细胞凋亡指数的结果 TUNEL染色的结果显示，
铁包金组、安宫牛黄丸组均能减少肝细胞的凋亡，
与模型组比较，差异有统计学意义（P < 0.01）；铁
包金组与安宫牛黄丸组作用效果相当（P>0.05）。见
图2。
2.5 各组大鼠肝脏组织 APE1、caspase3、bcl-2、bax
蛋白的表达情况 与模型组比较，铁包金、安宫牛
黄丸组均能降低caspase3，bax水平，并促进APE1、
bcl-2的表达水平，差异有统计学意义（P<0.01）。铁
包金与安宫牛黄丸组作用效果相当，差异无统计学
意义（P>0.05）。见图3。
2.6 免疫荧光激光共聚焦显微镜拍摄情况 与模型组
比较，铁包金、安宫牛黄丸组均能增加APE1表达，
差异有统计学意义（P < 0.01）。铁包金与安宫牛黄丸
组效果相当，坏死或凋亡的细胞不表达。见图4。
3 讨论
多功能蛋白APE/Ref-1与凋亡的关系。无嘌呤/无
图 1 各组大鼠肝脏病理组织损伤情况（HE，200×）
Figure 1 Histopathologyoftheliverindifferentgroups（HEstainingmethod，200×）
A B C D
A.正常对照组 B.模型组 C.铁包金组 D.安宫牛黄丸组
注：与正常对照组比较，△△P<0.01；与模型组比较，**P<0.01。
图 2 各组大鼠肝脏细胞凋亡指数（Tunel染色， 200×）
Figure2 Livercellapoptoticindexofratsinvariousgroups（Tunelstainingmethod，200×）
A B C D
A.正常对照组 B.模型组 C.铁包金组 D.安宫牛黄丸组
△△
正
常
对
照
组
A
p
o
p
t
o
n
s
i
s
i
n
d
e
x
（
a
m
o
u
n
t
）
30
20
10
0
安
宫
牛
黄
丸
组
模
型
组
铁
包
金
组
** **
正
常
对
照
组
模
型
组
注：与正常对照组比较，△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05；与安宫牛黄丸组比较，#P>0.05。
图 3 各组大鼠肝脏组织 APE1， caspase3， bcl-2， bax蛋白的表达情况
Figure3 TheexpressionofAPE1，Caspase3，Bcl-2andBaxproteininlivertissuesofratsinvariousgroups
APE1
Bc1-2
Bax
caspase3
cleaved
caspasec3
Actin
C
l
e
a
v
e
d
C
a
s
p
a
s
e
3
1.5
1.0
0.5
0.0
B
c
l
-
2
AP
E1
B
a
x
△△
*
*
** * *
*
*
F
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x
p
r
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s
s
i
o
n
（
I
D
O
）
正常对照组
模型组
铁包金组
安宫牛黄丸组
安
宫
牛
黄
丸
组
铁
包
金
组
△△ △△
△△
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Traditional Chinese Drug Research ＆ Clinical Pharmacology，2016 November，Vol． 27 No． 6
嘧啶核酸内切酶（apurinic/apyrimidine endonuclease，
APE /Ref-1）是一种体内广泛分布的多功能蛋白质，
对生物体的存活起着至关重要的作用，在细胞凋亡、
细胞信号转导、DNA碱基切除修复、转录因子的氧
化还原和活性氧簇（ROS）的调控过程中均发挥着重要
的作用[4]。小鼠敲除APE1基因后不能存活[5]。APE1
蛋白具有两个独立的生物学功能，C-terminus参与DNA
碱基切除修复，N-terminus 调控氧化还原活性[6]。
APE1 可以通过 DNA损伤修复酶和氧化还原调节细
胞转录因子双功能保护低氧诱导的细胞凋亡[7]。结果
显示，CCL4联合 D-GalN和LPS 诱导的慢加急性肝
衰竭模型APE1明显减少，肝细胞凋亡指数的结果表
明，模型组发生了凋亡。铁包金抑制APE1的减少，
保护DNA的损伤，减少细胞凋亡指数。铁包金可能
通过促进APE1的表达，从而保护肝细胞的凋亡。
慢加急性肝衰竭的凋亡机制。研究[8]发现，肝衰
竭不仅存在肝细胞坏死，也存在肝细胞凋亡，且细
胞凋亡是急性肝衰竭更为重要的肝细胞死亡形式。
病毒感染，氧化应激，内毒素血症，细胞因子均可
以导致肝细胞，这些因素激活 NK 细胞，释放 Fas、
TNF相关凋亡诱导配体 TRAIL和 IFN-γ，当死亡因
子FasL与Fas特异结合，引起受体聚集形成死亡
诱导信号复合物（DISC），激活 caspase8 及 Bid 蛋
白，引起线粒体外膜通透性改变，细胞色素 C 释
放入细胞浆，激活 caspese3，导致肝细胞大量凋
亡[9-10]，最终导致肝衰竭。Caspase-3为天冬酰胺特异
酶切的半胱氨酸蛋白酶，由35kD的酶原经酶解作
用生成由 19、17 kD 两个亚单位组成的异二聚体
（cleavedcaspase3），是细胞凋亡早期阶段激活的关键
蛋白酶，在细胞凋亡过程中起中心环节作用，故也
被称为死亡蛋白酶，是目前已知的凋亡最后执行因
子[11-12]，结果显示模型组cleavedcaspase3表达明显升
高，说明肝细胞发生了凋亡，铁包金减少 cleaved
caspase3 的表达，证明铁包金具有抗凋亡的作用。
Bcl-2为凋亡抑制基因，主要通过防止线粒体释放凋
亡因子来发挥抗凋亡作用。bax是一种与Bcl-2相关
的蛋白， 其功能与 bcl-2 相反[13]。结果铁包金减少
bax促进bcl-2蛋白的表达。铁包金可能是促进抑凋
亡蛋白的表达，减少肝细胞凋亡。
综上所述，铁包金具有改善肝功能的作用，促
进多功能蛋白APE1、抑凋亡蛋白bcl-2的表达、降
低细胞凋亡指数、减少 cleaved caspase3、bax 的表
达，最终减少肝细胞的凋亡，铁包金对慢加急性肝
衰竭起到了一定的防治防治作用。可能的机制是铁
包金通过调节多功能蛋白APE1调控凋亡相关蛋白，
减少了肝细胞的凋亡，最终达到防治慢加急性肝衰
竭的作用。
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注：与正常组比较，△△P<0.01；与模型组比较，**P<0.01。
图 4 各组大鼠肝脏组织中 APE1的原位表达情况
Figure4 In-situexpressionofAPE1inlivertissueofratsinvariousgroup
A.正常对照组 B.模型组 C.铁包金组 D.安宫牛黄组
150
100
50
0
*
*
A
P
E
1
e
x
p
r
e
s
s
i
o
n
（
I
O
D
）
正
常
对
照
组
模
型
组
铁
包
金
组
安
宫
牛
黄
丸
组
△△
798· ·
中药新药与临床药理 2016年 11月第 27卷第 6期
收稿日期：2016-08-22
作者简介：曾绘域，女，硕士研究生，研究方向：经方辨治糖尿病及其并发症。Email：huiyu_1990@sina.com。通信作者：朱章志，男，博士，教
授，研究方向：经方辨治糖尿病及其并发症。Email：zhuangi@vip.sina.com。
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（编辑：宋威）
降糖三黄片对糖尿病肾病大鼠TLR4/NF-κB通路的影响
曾绘域 1，朱章志 2，廖华君 1，许 帅 1（1.广州中医药大学，广东 广州 510405；2.广州中医药大学第一附属
医院，广东 广州 510405）
摘要：目的 观察降糖三黄片对糖尿病肾病大鼠肾组织 Toll 样受体 4（TLR4）/ 核因子-κB（NF-κB）通路及单核
细胞趋化蛋白-1（MCP-1）表达的影响，探讨降糖三黄片对糖尿病肾病的保护作用及其机制。方法 将 80只 SD
大鼠随机分为正常组 10只，模型组 70只。模型组大鼠予腹腔内注射链脲佐菌素（STZ）复制模型，成模大鼠随
机分为模型组，降糖三黄片低、中、高剂量组（675，1350，2700 mg·kg-1·d-1），厄贝沙坦组（13.5 mg·kg-1·d-1），
正常组和模型组灌服等剂量蒸馏水。给药 8周后腹主动脉采血测空腹血糖，收集 24 h尿液测定尿蛋白，免疫
组化法检测各组肾组织中 MCP-1蛋白的分布，Western blot 法检测各组肾组织中 TLR4、NF-κB（P-p65）蛋白
的表达。结果 与正常组比较，模型组的空腹血糖、24 h尿蛋白及肾组织 TLR4、NF-κB（P-p65）、MCP-1蛋
白表达均显著升高，差异有统计学意义（P < 0.01）。与模型组比较，降糖三黄片低、中、高剂量组空腹血糖
均显著降低，差异有统计学意义（P < 0.01）。与模型组比较，降糖三黄片低、中、高剂量组及厄贝沙坦组肾组
织 TLR4、NF-κB（P-p65）、MCP-1蛋白表达显著降低、尿蛋白排出显著减少，差异均有统计学意义（P < 0.05，
P < 0.01）。结论 降糖三黄片通过抑制 TLR4/NF-κB通路，下调 MCP-1的表达，起到减少尿蛋白排出，延缓
DN进展的作用。
关键词：降糖三黄片；糖尿病肾病；Toll 样受体 4；核因子-κB；单核细胞趋化蛋白-1
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1003-9783（2016）06-0799-06
doi：10.19378/j. issn. 1003-9783. 2016. 06. 012
Effect of Jiangtang Sanhuang Tablets on TLR4/NF-κB Pathway of Diabetic Nephropathy Rats
ZENG Huiyu1，ZHU Zhangzhi2，LIAO Huajun1，XU Shuai1（1.GuangzhouUniversityofChineseMedicine，Guangzhou
510405 Guangdong，China；2. The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou
510405Guangdong，China）
Abstract：Objective To observe the effect ofJiangtang Sanhuang tablets（JTSH）on Toll-like receptor 4（TLR4）
/nuclear factor-κB（NF-κB）pathway and the expression of monocyte chemoattractant protein-1（MCP-1）of diabetic
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