全 文 ：［基金项目］国家自然科学基金项目(编号:81202935);湖北省自然科学基金创新群体项目(编号:2013CFA013);武汉市青年科技晨光计划(编号:
2015070404010201)资助 ［作者简介］任永申，男，博士，讲师，硕士生导师，研究方向:中药民族药理论与应用研究，电话:027-67843713，E-mail:godreny@
163． com
一测多评法测定民族药铁包金提取物五种黄酮类成分
任永申，熊慧，沈玉霞，梅之南 (中南民族大学药学院，湖北，武汉 430074)
［摘要］ 目的:建立民族药铁包金提取物中黄酮类成分含量测定的一测多评法，探讨一测多评法在民族药质量控制中的应用。方
法:以儿茶素为内参物，分别建立花旗松素、香橙素、圣草酚和槲皮素与儿茶素的相对校正因子，分别采用外标法和一测多评法计算测
定 5种黄酮的含量，并比较二者结果相对误差。结果:4 种黄酮类成分相对于儿茶素的相对校正因子分别为 f280 nmcatechin/Taxifoli = 1． 229，
f280 nmcatechin/Aromadendrin =1． 145，f
280 nm
catechin/Eriodictyol = 1． 364，f
280 nm
catechin/Quercetin = 0． 897;相对保留时间分别为 ＲTaxifoli /Catechin = 1． 49，ＲAroma dendrin/Catechin = 2． 22，
ＲEridictyol /Catechin =3． 30，ＲQuercetin /Catechin =3． 72;一测多评法的计算结果与外标法的实测值一致，实验所得的相对校正因子可靠、相对保留时
间稳定。结论:建立的一测多评法可作为铁包金提取物中黄酮类成分的含量测定方法，一测多评法为民族药质量控制提供了一个新
的模式与方法。
［关键词］ 一测多评法;民族药;铁包金;相对校正因子;黄酮
［中图分类号］Ｒ927． 2 ［文献标识码］A ［文章编号］1001-5213(2015)12-1099-05 DOI:10． 13286 / j． cnki． chinhosppharmacyj． 2015． 12． 11
Simultaneous determination of five flavones in Berchemia lineata extraction by HPLC-QAMS
ＲEN Yong-shen，XIONG Hui，SHEN Yu-xia，MEI Zhi-nan (College of Pharmacy，South Central University for Nationalities，Hu-
bei Wuhan 430074，China)
ABSTＲACT:OBJECTIVE To simultaneously determine contents of five flavones in ethnic medicine Berchemia lineata extract by quantita-
tive analysis of multiple components with a single-marker (QAMS)，and discuss application of QAMS in quality control of ethnic medicines．
METHODS Catechin was chosen as internal reference substance． Ｒelative correlation factors(ＲCF)of taxifolin，aromadendrin，eriodicty-
ol and quercetin to catechin were calculated and established． Contents of these five flavones were determined by external standard method
(ESM)and QAMS，respectively，and relative error (ＲE)between QAMS and ESM was analyzed to evaluate QAMS method． ＲESULTS
Within linear ranges，values of ＲCF determined at 280 nm were f280 nmcatechin/Taxifoli = 1． 229，f
280 nm
catechin/Aromadendrin = 1． 145，f
280 nm
catechin/Eriodictyol = 1． 364，
f280 nmcatechin/Quercetin =0． 897，respectively． ＲCF showed good reproducibility with a ＲSD ＜3%． Ｒelative retention times (ＲＲT)were ＲTaxifoli /Catechin =
1． 49，ＲAroma dendrin/Catechin = 2． 22，ＲEridictyol /Catechin = 3． 30 and ＲQuercetin /Catechin = 3． 72． ＲＲT showed good stability with a ＲSD ＜5%． Two methods
did not show significant difference in assay results． CONCLUSION QAMS method is feasible，credible，and can be used to determine
multiple flavones in Berchemia lineata extract． QAMS can be adopted as a novel strategy for quality control of ethnic medicines．
KEY WOＲDS:quantitative analysis of multiple components with a single-marker (QAMS);ethnic medicine;Berchemia lineata;relative
correlation factor (ＲCF);flavones
铁包金，又名狗脚利、老鼠草、鼠乳头、乌金藤、乌
石米、老鼠耳等，始载于《岭南采药录》，是鼠李科植物
细叶勾儿茶Berchemia lineata(L．)DC．的根或藤茎［1］，
主要分布于我国岭南地区，为我国南方民族地区常用
的一味重要的民族药物，具有化淤止血、镇咳止痛、祛
风除湿等作用。
研究发现，铁包金中主要含有黄酮类化学成分［2］，
其总黄酮具有较好的抗炎镇痛、抗肿瘤效果［3］。本文
在前期研究的基础上，利用大孔吸附树脂法［4-6］分离富
集了铁包金总黄酮部位，并分离鉴定了 9种黄酮类成
分，分别为(－)-(1’Ｒ，2’S)- erythro-5- hydroxy-7-
(1’，2’-dihydroxypropyl)-2- methyl- chromone、5-hy-
droxy-7-(2’-hydroxypropyl)-2-methyl-chromone、5，7-di-
hydroxy -2-methyl -chromone、柚皮素、圣草酚、(+)-香
橙素、(+)-花旗松素、(+)-儿茶素、(+)-表没食子儿
茶素。
一测多评法(quanitative analysis of multi-compo-
nents by single-marker，QAMS)利用样品中化学成分的
函数关系和比例关系，在只测定一个成分(内参物，通
常为典型成分且化学对照品可得到者)的情况下，实现
对多个成分(对照品难以得到或难供应)含量的测
定［7］。一测多评法通过严格的方法学考察，建立内参
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物与其他成分间的相对校正因子，并用之计算其他成
分含量，从而有效解决多指标成分质量控制面临的对
照品短缺和检测成本高昂等问题。一测多评法一经提
出即得到了广泛的认可和验证［8］，现已被 2010年版中
国药典(一部)收录，作为黄连药材质量控制的法定标
准［9］。
本文研究对象铁包金是《广西中药材标准》收载品
种［10］，但尚未建立质量标准，其质控状况在民族药物中
具有一定的普遍性，亟需建立或提升质量标准［11-12］，以
满足民族药研究与应用迅速发展的要求。同时，本研
究前期分离鉴定的几种铁包金黄酮类成分色谱行为相
近，且儿茶素含量适宜、对照品价格低廉，可作为内标
物。因此，本文在前期研究的基础上，拟采用一测多评
模式，建立同时测定铁包金药材中儿茶素、花旗松素、
香橙素、圣草酚和槲皮素五种黄酮类成分的方法，建立
铁包金质量标准，并为一测多评方法在民族药质量标
准建立中的应用提供借鉴和参考。
1 材料
1．1 仪器 Agilent 1100 高效液相色谱仪(DAD检测
器，自动进样器，四元梯度泵，柱温箱，Agilent chemsta-
tion色谱工作站);Aglient 1200 高效液相色谱仪(PDA
检测器，自动进样器，四元梯度泵，柱温箱，Agilent
chemstation色谱工作站);Dionex UltiMate 3000戴安液
相色谱仪(DAD检测器，自动进样器，四元梯度泵，柱温
箱，Chromeleon 色谱工作站);AB265-S型电子天平(瑞
士Mettler toledo 公司);KQ-500E超声波清洗器(昆山
市超声仪器有限公司);ASWO-0005-U超纯水系统(重
庆颐洋企业发展有限公司)。Kromasil-C18柱(4． 6 mm
×250 mm，5 μm);Thermo Syncronic-C18柱(4． 6 mm ×
250 mm，5 μm);Waters XBridge-C18柱(4． 6 mm × 250
mm，5 μm)。
1．2 对照品 儿茶素(中国食品药品检定研究院，
供含量测定用，批号 110877-201203)，花旗松素、
香橙素、圣草酚和槲皮素对照品均自制，经 MS、1
H-NMＲ和13 C-NMＲ 确定结构，HPLC 峰面积归一
化法测定纯度均大于 98%;乙腈、甲醇为色谱纯
(美国 Tedia公司)，水为超纯水，其他试剂均为分
析纯。
1． 3 药材来源与鉴定 10 批次铁包金药材采自广
西玉林地区，经中南民族大学药学院万定荣教授鉴
定为鼠李科植物细叶勾儿茶 Berchemia lineata (L．)
DC．的根。
2 方法与结果
2． 1 一测多评方法的建立
2． 1． 1 色谱条件与系统适用性实验 色谱柱:Kro-
masil-C18柱(250 mm × 4． 6 mm，5 μm);流动相:A
(乙腈)-B(0． 3% 冰醋酸溶液)，梯度洗脱:0 ～ 15
min(A:10%→15%)，15 ～ 95 min(A:15%→25%);
流速:1． 0 ml·min －1;检测波长:280 nm;柱温:25 ℃;
进样量:10 μl。儿茶素、花旗松素、香橙素、圣草酚
和槲皮素与相邻色谱峰的分离度均大于 1． 5。色谱
图见图 1。
1-儿茶素;2-花旗松素;3-香橙素;4-圣草酚;5-槲皮素
1-catechin;2-taxifolin;3-aromadendrin;4-eriodictyol;5-quercetin
图 1 混合对照品(A)和铁包金总黄酮部位样品(B)色谱图
Fig 1 Chromatograms of mixed reference substances(A)and samples of
total flavone fraction of B． lineata (B)
2． 1． 2 对照品溶液的制备 精密称取儿茶素9． 80
mg，花旗松素7． 40 mg，香橙素7． 10 mg，圣草酚6． 80
mg，槲皮素4． 88 mg，分别置于 10 ml量瓶中，加甲醇
溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液。精密量取上
述各储备液1． 6 ml，置于 10 ml 量瓶中，加甲醇稀释
至刻度，经0． 45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得
混合对照品溶液(每 1 ml 含儿茶素0． 156 80 mg，花
旗松素0． 118 40 mg，香橙素0． 113 60 mg，圣草酚
0． 108 80 mg，槲皮素0． 078 08 mg)。
2． 1． 3 供试品溶液的制备 称取铁包金药材适
量，粉碎，用 30 倍量 95%乙醇回流提取 3 次，每次
1． 5 h，合并提取液，滤过，减压回收溶剂至无醇味，
加甲醇稀释成一定浓度的样品溶液。过 HP-20 大
孔吸附树脂柱，水洗，10%，30%，50%，70%，
100%乙醇洗脱，合并 30%，50%，70% 乙醇洗脱
液，减压回收，干燥，即得总黄酮。精密称取总黄
酮部位约 8 mg，置于 10 ml量瓶中，加甲醇溶解并
定容至刻度，摇匀，经0． 45 μm 微孔滤膜滤过，取
续滤液，即得。
2． 1． 4 线性关系考察 精密吸取“2． 1． 2”项下混
合对照品溶液 1，2，4，8，10 μl 注入液相色谱仪，按
上述色谱条件，测定峰面积。以峰面积积分值(Y )
为纵坐标，进样量(X)为横坐标进行线性回归，结果
表明，儿茶素、花旗松素、香橙素、圣草酚和槲皮素在
进样范围内与各自的峰面积积分值呈良好的线性关
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系。见表 1。
表 1 铁包金提取物黄酮类成分的线性方程和范围
Tab 1 Linear equation and range of five flavonoids in
Berchemia lineata extract
对照品 线性方程 r值 线性范围 /μg
儿茶素 Y =1 488． 5X +7． 4753 r =0． 999 4 0． 156 80 ～ 1． 568 0
花旗松素 Y =1 863． 5X －41． 817 r =0． 999 6 0． 118 40 ～ 1． 184 0
香橙素 Y =1 788． 3X －77． 791 r =0． 999 1 0． 113 60 ～ 1． 136 0
圣草酚 Y =2 082． 4X －56． 798 r =0． 999 1 0． 108 00 ～ 1． 088 0
槲皮素 Y =1 425． 6X －63． 216 r =0． 999 9 0． 078 08 ～ 0． 780 8
2． 1． 5 精密度试验 精密吸取“2． 1． 2”项下混合
对照品溶液 10 μl，按上述色谱条件，一天内连续测
定 6 次，记录峰面积，ＲSD 分别为 0． 4%，0． 6%，
0． 6%，1． 0%，1． 0%，表明日内精密度良好。每隔一
天(3 次)每天连续测定 6 次，记录峰面积，ＲSD分别
为0． 5%，0． 5%，0． 8%，1． 8%，1． 4%，表明日间精密
度良好。
2． 1． 6 稳定性试验 精密吸取“2． 1． 3”项下供试
品溶液 10 μl，分别于 0，2，4，6，8，12，24 h 后注入液
相色谱仪，测定峰面积，ＲSD 分别为1． 2%，1． 1%，
0． 5%，1． 0%，1． 3%，结果表明供试品溶液在 24 h
内稳定性良好。
2． 1． 7 重复性试验 取同一批总黄酮部位 6 份，
每份约 8 mg，按“2． 1． 3”项下的方法制备供试品溶
液，按上述色谱条件，测定峰面积，进样量均为 10
μl，计算含量，儿茶素、花旗松素、香橙素、圣草酚和
槲皮素的平均含量分别为18． 7%，11． 5%，11． 3%，
11． 4%，8． 1%，ＲSD 分别为 1． 2%，1． 1%，0． 5%，
1． 0%，1． 3%，结果表明重复性良好。
2． 1． 8 加样回收率试验 称取已知含量的同一批
总黄酮部位 6 份，每份约 4 mg，各置于 10 ml 量瓶
中，加甲醇溶解，分别精密加入“2． 1． 2”项下的混合
对照品储备液1． 0 ml，加甲醇稀释至刻度，按上述色
谱条件进行测定，进样量均为 10 μl，测定峰面积，计
算加样回收率。儿茶素的平均加样回收率为
100． 9%，ＲSD为1． 0%;花旗松素的平均加样回收率
为100． 9%，ＲSD 为3． 6%;香橙素的平均加样回收
率为102． 1%，ＲSD为1． 4%;圣草酚的平均加样回收
率为98． 6%，ＲSD为0． 8%;槲皮素的平均加样回收
率为101． 2%，ＲSD为1． 8%。
2． 2 相对校正因子的确定
2． 2． 1 铁包金黄酮相对校正因子的测定 取
“2． 1． 2”项下的混合对照品溶液，分别进样 1，2，4，
6，8，10，12 μl，平行测定 2 次，根据相对校正因子的
计算公式 fkm = fk / fm = Wk /Wm ×(Am /Ak)
［13］，分别计
算各待评价成分花旗松素、香橙素、圣草酚和槲皮素
与内参物儿茶素间的相对校正因子。结果
f280 nmcatechin /Taxifoli = 1． 217， f
280 nm
catechin /Aromadendrin = 1． 140，
f280 nmcatechin /Eriodictyol = 1． 352，f
280 nm
catechin /Quercetin = 0． 892，ＲSD 分别
为1． 33%，1． 51%，1． 12%，2． 18%。
2． 2． 2 相对校正因子的重复性考察 按“2． 1． 2”
项下对照品溶液的制备方法，平行制备 6 份混合对
照溶液，分别进样 1，2，4，6，8，10，12 μl，测定峰面
积，计算花旗松素、香橙素、圣草酚和槲皮素与内参
物儿茶素间的相对校正因子。结果 f280 nmcatechin /Taxifoli =
1． 222，f280 nmcatechin /Aromadendrin = 1． 148，f
280 nm
catechin /Eriodictyol = 1． 365，
f280 nmcatechin /Quercetin = 0． 906，ＲSD 分别为1． 36%，1． 44%，
1． 17%，2． 23%，表明校正因子的重复性良好。
2． 2． 3 不同液相系统对相对校正因子的影响 采
用 Kromasil-C18柱(250 mm × 4． 6 mm，5 μm)色谱
柱，分别考察了不同 HPLC 系统对儿茶素相对校正
因子的影响，结果 ＲSD 分别为 1． 82%，1． 73%，
1． 21%，2． 20%，表明对各成分间的相对校正因子无
显著影响。见表 2。
2． 2． 4 不同色谱柱对相对校正因子的影响 采用
Agilent 1100HPLC系统，分别考察了不同品牌色谱
柱对儿茶素相对影响因子的影响，结果 ＲSD分别为
2． 33%，1． 41%，1． 72%，2． 39%，表明对各成分间的
相对校正因子无显著影响。见表 2。
表 2 不同液相系统、不同色谱柱对相对校正因子的影响
Tab 2 Effects on relative correction factor of different HPLC
systems and columns
仪器 色谱柱 f280mC/T f
280m
C/Ar f
280m
C/Er f
280m
C/Qu
Agilent 1100 Kromasil-C18 1． 216 1． 153 1． 345 0． 912
Agilent 1100 Syncronic-C18 1． 257 1． 159 1． 378 0． 873
Agilent 1100 XBridge-C18 1． 221 1． 122 1． 362 0． 897
平均值 1． 231 1． 145 1． 362 0． 894
ＲSD /% 1． 82 1． 73 1． 21 2． 20
Agilent 1100 Kromasil-C18 1． 213 1． 146 1． 342 0． 908
Aglient 1200 Kromasil-C18 1． 262 1． 159 1． 365 0． 873
UltiMate 3000 Kromasil-C18 1． 212 1． 127 1． 389 0． 912
平均值 1． 229 1． 144 1． 365 0． 898
ＲSD /% 2． 33 1． 41 1． 72 2． 39
2． 2． 5 不同流速对相对校正因子的影响 采用
Agilent 1100HPLC系统和 Kromasil-C18柱色谱柱，分
别考察了不同流速(0． 9，1． 0，1． 1 ml·min －1)对儿茶
素相对影响因子的影响，结果 ＲSD 分别为1． 52%，
1． 34%，1． 14%，1． 87%，表明对各成分间的相对校
正因子无显著影响。
2． 2． 6 不同柱温对相对校正因子的影响 采用
Agilent 1100HPLC系统和 Kromasil-C18柱色谱柱，分
别考察了不同柱温(20，25，30，35 ℃)对儿茶素相对
影响因子的影响，结果 ＲSD 分别为1． 68%，1． 33%，
1． 24%，1． 97%，表明对各成分间的相对校正因子无
显著影响。
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2． 2． 7 相对校正因子的确定 综合上述实验结果，
取各影响因素结果的平均值，最终确定花旗松素、香
橙素、圣草酚和槲皮素与内参物儿茶素间的相对校正
因子，分别为 f280 nmcatechin /Taxifoli = 1． 229，f
280 nm
catechin /Aromadendrin =
1． 145，f280 nmcatechin /Eriodictyol =1． 364，f
280 nm
catechin /Quercetin = 0． 897，ＲSD
分别为1． 42%，1． 06%，1． 08%，2． 17%。
2． 3 一测多评法待测色谱峰的定位 利用相对保
留值法 Ｒm/k = tＲ(m)/ tＲ(k)考察各色谱峰在不同品牌仪
器和不同品牌 C18色谱柱中的重现性。结果相对保
留值的波动相对较小(ＲSD ＜3%)，因此可采用相对
保留值法辅以化合物的紫外光谱进行黄酮类待测成
分色谱峰定位，相对保留时间分别为 ＲTaxifoli /Catechin =
1． 49，ＲAromadendrin /Catechin = 2． 22，ＲEriodictyol /Catechin = 3． 30，
ＲQuercetin /Catechin = 3． 72。
2． 4 一测多评法与外标法测定结果的比较 分别
精密称定 10 批样品，按“2． 1． 3”项下的方法制备供
试品溶液，按上述色谱条件进行测定，进样量均为
10 μl，测定峰面积，采用外标法计算铁包金提取物
中的 5 种黄酮类含量，再用建立的一测多评法对其
含量进行计算，计算公式为 Wm = Wk × Am /(fkm ×
Ak)
［13］，并将 2 种方法所得结果进行比较，以验证一
测多评法用于铁包金黄酮类成分多指标质量评价的
表 3 一测多评法与外标法测定铁包金提取物中黄酮成分含量对比(%)
Tab 3 Comparisons of contents of 5 flavonoids in Berchemia lineata extract determined by ESM and QAMS(%)
批次
儿茶素 花旗松素 香橙素 圣草酚 槲皮素
ESM ESM QAMS ＲE ESM QAMS ＲE ESM QAMS ＲE ESM QAMS ＲE
1 18． 7 11． 5 11． 9 3． 7 11． 3 11． 3 － 0． 3 11． 4 11． 2 － 1． 9 8． 4 8． 2 － 2． 2
2 18． 6 11． 4 11． 2 － 1． 4 11． 2 11． 0 － 2． 0 11． 3 11． 0 － 2． 3 8． 5 8． 4 － 1． 1
3 18． 7 11． 6 12． 0 3． 5 11． 4 11． 8 3． 5 11． 4 11． 9 4． 2 8． 4 8． 3 － 0． 8
4 18． 8 11． 8 11． 6 － 2． 1 11． 2 11． 3 0． 6 11． 7 11． 4 － 2． 4 8． 2 8． 3 1． 6
5 18． 9 11． 4 11． 6 1． 4 11． 3 11． 4 0． 8 11． 2 11． 4 2． 5 8． 4 8． 5 1． 4
6 19． 1 11． 3 11． 7 3． 4 11． 5 11． 5 0． 2 11． 5 11． 6 1． 1 8． 5 8． 6 0． 2
7 18． 0 11． 2 11． 0 － 1． 5 11． 0 10． 9 － 1． 1 10． 8 10． 9 0． 8 8． 3 8． 2 － 1． 6
8 18． 5 11． 6 11． 4 － 2． 1 11． 5 11． 7 1． 8 11． 3 11． 1 － 1． 3 8． 3 8． 3 0． 5
9 18． 1 11． 4 11． 5 0． 9 11． 1 10． 9 － 1． 6 10． 8 10． 9 1． 2 8． 4 8． 1 － 3． 9
10 18． 4 11． 3 11． 3 0． 4 11． 2 11． 1 － 0． 8 11． 5 11． 1 － 2． 9 8． 2 8． 2 0． 7
注:ESM:外标法，external standard method;QAMS:一测多评法，quantitative analysis of multi-components with a single-marker;ＲE:相对误差，rela-
tive error，ＲE (%) = (QAMS-ESM)/ QAMS × 100%
准确性。结果表明，2 种方法测得的黄酮类成分含
量没有显著差异，相对误差 ＜ 5%，提示建立的一测
多评法具有较高的可信度。见表 3。
3 讨论
一测多评法形成于中药多成分含量测定质量控
制模式，其采用一个标准物质作为内参物、根据各色
谱峰相对保留时间和峰形等因素确定各目标物的准
确位置，从而实现在同一色谱条件、仅用一种化学对
照品，实现对多种化学成分含量的测定，已经成为多
指标定量的一种重要方法，已经开始应用于中国药
典收载品种的质量控制［14-15］。一测多评法对多成
分含量测定中化学对照品供应紧张、部分化学对照
品性质不稳定价格较高、检测成本较高等问题给出
了可行的解决方案。
本研究选用儿茶素作为内参物，建立了其与花
旗松素、香橙素、圣草酚、槲皮素的相对校正因子
fkm，并考察了不同仪器、不同色谱柱、不同液相条
件、不同进样浓度对 fkm的影响，结果表明在上述考
察条件下 fkm的 ＲSD 均小于 3%，表明方法稳定可
控，具有较好的耐受性和可重现性，可用于铁包金提
取物的质量控制。研究同时比较了一测多评法与外
标法计算结果，二者之间没有显著差异，说明得到的
fkm有很好的可信度;研究采用相对保留时间 fkm可以
用于目标峰定位，ＲSD ＜5%，具有较好的稳定性。
民族药是我国传统医药资源的宝库，更是天然
化合物的宝库，随着现代天然药物成分分离与鉴定
技术的进步，越来越多研究投向了民族药物，并分离
得到大量的新化合物或特征化合物，阐明了民族药
化学物质基础，可以作为建立质量标准的依据，而实
际工作中却面临着化学对照品短缺等问题，而一测
多评法的引入则为化学成分多样、对照品供应不充
分的民族药质量标准的建立与提升工作提供了可行
的解决手段。本研究在前期化学物质基础研究的前
提下，建立了一测多评法的民族药铁包金提取物中
儿茶素、花旗松素、香橙素、圣草酚、槲皮素 5 种黄酮
类成分含量测定方法，方法简便准确可靠，可用于建
立铁包金的质量标准，并可为其他民族药多成分含
量测定质控方法的建立提供技术参考。
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［收稿日期］2015-02-04
·3011·中国医院药学杂志 2015 年 6 月第 35 卷第 12 期 Chin Hosp Pharm J，Jun 2015，Vol 35，No． 12