全 文 ：第 13卷 第 2 期
12 9 9年 9月
热 带 作 物 学 报
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9 9 12
余甘子果汁超氧化物歧化酶的研究
刘凤书 侯开卫 李绍家 杨 臣武 赵 苹
(中国林业科学研究院资源昆虫研究所 , 云南昆明 65 02 1 6 )
摘要 采用连苯三酚自氧化法测定的结果表明 , 在余甘子果汁中 , 含有超氧化物 歧 化 酶 , 每 毫
升鲜果汁含有的酶活力为 96 4 . 28 国际单位 。 对 15 位老年人进行的临床试验结果证明 , 在服用余 甘
子果汁 2个月后 , 人体血液红细胞超氧化物歧化酶的活性明显提高 , 血浆中脂质过氧化物的含量降
低 。 这说明 , 余甘子果汁具有抗衰老作用 。
关健词 余甘子果汁 超氧化物歧化酶 酶活性测定 临床试验
中图法分类号 5 6 6了 . 9
超氧化物歧 化酶 ( S O D ) 是超氧化物活性的降解酶 , 能增强有机体的免疫力和抗 衰力 。
近年来 , 它在药学和医学上的作用 已越来越受到有关学者的注意 。
超氧 化物歧 化酶存在于动 、 植物体中 。 余甘子果实在我国民间作为鲜食 和药用水果 已有
很长的历史 。 ,扫国林科院资源 昆虫研究所近年通过体外模拟试验 、 动物试验和人体试验 , 发
现余甘子果实除含有多种对人体有益的成份外 , 尚含有其他未知成份 〔 i 一 3 〕 。
为了进一步研究余甘 子果实的食用价值 , 给开发和利用提供 依据 , 我们开展了有关余甘
子呆汁超氧 化物歧化酶的研究 。
1 试验方法
川 酶液的制备
将余甘子果实洗净去核 , 进行常规压榨取汁 。 吸取 50 m l原汁装入透析袋中 , 用 2 . 5 m 。 1/ L
p H 7
.
8磷酸缓 冲液进行动态透析 6 h 。 透析液冷冻后经 4 0 0。: / m in 离心 2￡m i n , 弃沉淀 物 将
上清液再用聚乙二醇一 6 0 0 。浓缩 , 最后定容至 50 m l , 即为余甘子果汁粗提液 。
1
.
2 50 0的测定
用硝基蓝四哩 ( N B T )光 化还原法和肾上腺素自氧化法测定余甘子果汁是 否含有 s 0 D 。
根据 G i a n n o p l i t i s等 〔 4 〕 的方法 , 以含有 1 · 3 X l o一 。 m o l / L核黄素 、 i 3 x i o 一 “ m 。 z / L 甲硫
氨酸 、 6 3 x 1 0 “ “ m o l/ L N B T 、 。 . 05 m o l/ L p H 7 · 8磷酸缓冲液的3m l反应混合液测定 , 利用
核黄素光敏之后产生的阴离子自由基 ( · 0 夏)与 N B T作用生成蓝色的甲月替在 5 6 O n m处有 最大
光吸收 , 当反应液 中有 S O D 时 , 则 S O D与 N B T竞争 · O豆, 从而 抑 制 N B T 转 化 为 蓝色 的
甲卫替。
取 20 支试管 , 每管各加入 3 m 1N B T反应液 , 其中10 支为有酶液管 , 每管加 30 闪余甘 子
果汁透析液 ; 10 支为空白管 , 每管加 30 时磷酸缓冲液。 在 30 ℃下同时用 40 o ol x 荧光 光 照 50
m i n
, 每 隔 5 m in 取 1 次反应液在分光光度计 5 6 0 n m处测定光密度O D 值。
肾上腺素在碱性条件下可以发生自氧化作用 , 这种自氧化属于 游 离 基 链 反 应 , 即 以
收稿 日期 : 19 9 工~ 0 2 一 2 2 。
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作 物 学 报 1 3卷
肾上腺索自权化试脸
试 管 号
1 伙 4 3汽 67 8
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05 nz o l/L Na ZC O 3( m l)
0
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l/L D E T( m A l)
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4 m o l/L 肾上腺素 ( m ) l
。 . 3m / olL 肾上腺素 ( m D
0
。
Zm ol/L 肾上腺素 ( m l)
o
.
lm o l/L 肾上腺素 ( m ) l
余甘 子果 汁透析 液 ( 川 )
重蒸水 ( 件 l)
·
O
: 一
l’ t为反应链的延 一长剂 。 当反应液中有 SO D时 , 肾上腺素的自氧化作用受到抑 制 〔” 〕 。
又因肾上腺素的氧化产物在 4 8 o n m处表现特征吸收 , 故可用于 S O D的分析 。
取 8 支试管 , 按表 l 的用量加入试剂 。
各管加入上述各试剂后 , 在 30 ℃下反应 5 m i n , 立即 在分光光度 i卜4 8 o n m处 测 光 密 变
O D 值 。
1
.
3 5 0 0酶活性测定
酶活性测定是利用 S O D 抑制连苯三酚的 自功氧化方法 〔 6 〕 。 于 4 . 5 m l p H S . 2 50 m ol / L
三经甲基氨基甲烷一 H CI 缓冲反应 液中 , 加入 10 间 80 m m ol / L 连苯三酚溶 液 , 再加入 4 川
酶液后在分光光度计 3 2 5 n m处每隔 o . s m i n测 l 次光密度O D值 。 以重燕馏水代替酶 液作空 自
对照 。 酶活 比单位采用 1 m l反应液中每分钟抑 制连苯三酚 自氧 化速率 达 50 帕时 的 酶量定为
一个单位活力 ( U ) 。
单泣活力 ( U / m l ) 二
O D 一样液速 率
O D
5 0 肠
X 1 0 0肠
-一 - -一 x 反应液总休积 x 样液稀释倍数丰羊液 体 积
1
。
4 受试对象及血样处理
受试对象为15 位5 一 67 岁身沐健康的老人 , 其中男性 n 人 , 女性 4 人 , 平均年龄为 2G . 9
岁 。 试验前 一周及受试 过程中均未服用药物及滋补品 。 舒人每天早晚各服用余甘子 果 汁 1
次 , 每次 40 m l , 用 60 ℃温开水冲稀 3 倍 口服 , 2 个月为一疗程 。 在疗释开始 与结 束 时 , 空
腹抽静脉血 2 m l作S O D 活力及脂质过氧 化物 ( 简称 L P O ) 含最测定 。
血样处 里按下列方法进行 :
将 。 . 5m l构陈酸三钠加入静脉血样中 , 摇 匀后经 3 0 0 o r / m in 离心 s m i n 。 以除去白细 胞
的上清液为血浆 , 供测定 L P O 含量使用 。 沉淀物为红细 胞 , 向红细胞液 ,{“ 加入 4 m l生理 盐
水洗 3 次 , 每次混匀后经 3 0 0 0 r / m in 离心 5 m i n , 弃上清液 , 得较纯净的 血红细胞 。 加入等
体积冷重蒸馏水于红细胞液中 , 摇 匀后取 1 m l溶血液 , 再加入 1 m l重蒸馏水及 1 m l预冷 无
水 乙醇 , 混匀 3 05 舌再加入 o . 6 m l预冷氯仿 , 混合抽提 1 m i n , 取上清液供 测定 S O D 用 。
另取溶 血后的血液 20 间 , 用血红蛋白比 色计测定血红蛋白 ( H b ) 含量 。
1
.
5 红细胞 5 0 。活力测定
·
5
.
1 连苯三酚自氧化速 率测定
2期 刘风书等 : 余甘子果汁超氧化物歧化酶 为研究 39
正试管 中 加入 4 . 6m l 5 0m ol /L 的 T rs i一 HCI 缓 冲液 , 其 p H值 为 8 . 2 , 在 25 ℃下 保 温
20 m i
; : , 然后加入预热的连苯三酚 ( 80 m m ol I/ , )6 时 , 计时 , 迅速摇匀后倒入比 色 杯 ( 光
径为 cI m ) 中 , 在分光光度计 3 2加 m 处隔 3 05 测 1次光 密度 O D值 , 要求自氧化 速 率 控 制 在
矿 0 7 O D / m i n 。
1
·
.5 2 红细 胞抽提液的 S O D活力测定 。
在试管叮功日)\/ p H S . 2 s om m o l / L 的 T r i s一 H C I缓冲液 4 . s m l , 于 2 5℃下保 温 Z o m i n , 再
加入红细胞提取 液 5 0 时 , 摇匀 , 加入预热的 80 m m ol / L连苯三酚 6 川 , 计 “ J· , 迅速摇匀后
倒入比色怀中 , 每隔 3 05 测 O D 值 l 次 。
活力单 位定义 : 在一定条件下 , 每克血 .红蛋白中 , 每分钟抑 制自氧化速率达动 % }付的酶
量定为一个单位 ( U ) 。
。 7 . 0一样液速率
0
。
0 7
x 1 0 0肠
单位活力 =
( U / g H b )
X
5 0肠
反应液总休积
手羊液体积
上清液体积
g H b /m l皿
1
.
6 血浆脂质过氧化物 ( L P O ) 的测定
1
.
6
.
1 工作曲线的制浮
在 5 支试管中分别加入 4 x 1 0 “ 6 m ol / L 的四 乙氧基丙烷标准应用液 50 , 1 0 , 1 50 , 2 0 ,
2 5 o m l (相应 于 0 . 2 , 0 . 4 , 0 . 6 , 0 . 5 , i . o n m o l ) , 再加入硫代巴比妥酸 ( T B A )试剂 1 m l ,
经沸水 浴 70 m i n , 水冷却后加入 5 m l正丁醇 , 混匀 , 以 3 5 0 0 r / m in 离 心 10 m i n , 取 上 层 正
丁醇 相在荧光光 度计上测定各管的荧光强度 ( 波长 : 激发 光 s o on m , 发射光 5 5 0n m ) , 以 四
乙氧 丛丙烷 含量为横座标 , 荧光强 度为纵座标作图 。
1
·
6
.
2 血浆 洋品的测定
在试管中加血浆 5 0件 1, 再 加 1/ 2 4m o l / L硫酸4 m l , 1 0帕磷钨酸 0 . 〔m l , 棍匀 , 放 置 s m i n
后 经 3 0 0 0 r / m in 离心 s m i 。 , 弃上清 液 。 于沉淀中加入 ln l重蒸馏水和 1二 IT B A试剂 , 混合后
沸水浴 70 m i n , 以后操作同工作 曲线制作 。 测得的荧光强度在工作 曲线 上 可 查 得 相 应 的
L P O 含量 , 然后换算出每毫升血浆中的 L P O 含量 。
2 试验结果
2
.
1 余甘子果汁粗提液对 ( NB T ) 光 化 还原的抑制
N B T 于 30 ℃时 , 在 4 0 0 0 x1 荧光 下 , 其光化还原速率呈直线上升 , 3￡m in 后还原速率 趋
于稳定 。 将余甘子呆汁粗提液加入反应 混合液以后 , 对 N B T光化还原有 明 显 的 抑 制 效 果
(图 l ) , 而且抑制的百分率随余甘子果汁粗提液加入量的增加而增大 ( 图 2 ) 。
以上结果表 明 , 余甘子果汁粗提液中含有 S O D 。
2
.
2 余甘子果汁粗提液对肾上腺素自氧化的抑制作用
将余甘子 果汁粗提液加入肾上腺素溶液中 , 余甘子果汁粗提液能抑 制肾上腺素自氧化 ,
其抑制比率随着肾上腺素浓度 的增加而增大 ( 表 2 ) 。
以上结果亦表明 , 余甘子果汁粗提液巾含有 S O D 。
热 带 作 物 学 报 13卷0 4
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Q5 口碑 ., 沪 .砂
/ 不加余甘子
/
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表 2 余甘子果汁粗提液对肾上腺素自氧化
的抑制作用
项 日
肾上腺 素浓度 ( m o l / L )
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·
1 0 2 0
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·
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砂2
无余甘子果 汁粗提液
( O D / s m i n )
有 余甘 子果汁粗提液
( O D / 5 二 i n )
差 值
抑制比率 ( % )
0
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, 沪户
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汉玫定时 间吩 娜二
余甘子果汁粗提液对 N B T光化
还原的抑制
表 3 15 位受试者试验前后S O D与 L P O 变化情况
03210
编 性
号 别
S O D 活性 ( U / g H b ) L P O含量 ( n m o l /皿 l )
图 1 试验前 试验后 试验 前 试 验后
龄年
1 男 6 2 1 一旦 0 . 6 1 6 了5 . 6 4 . 了 3 , 4
2 女 。 5 8 0 3 . 6 14 3 4 . 6 ` . 了 4 . 6
3 男 6 1 7 34 . 7 2 0 1 1 . 4 3 . 8 3 . 4
4 女 5 了 1 玉了2 . 6 一5 3 2 . 1 3 . 6 4 . 0
5 男 6 7 9 5 3 . 5 2 1 4 6 . 6 4 . 2 3 . 8
6 男 6 4 12 4 2 . 0 2 1 5 2 . 8 3 . 9 3 . 0
7 女 6了 74 0 . 6 1 78 9 . 了 3 . 6 3 . 0
8 男 6 6 7 8 6 . 6 ! 6 1 6 . 烤 5 . 0 5 . 3
9 男 6 5 7 3 7 . 9 2 2 5 3 . 1 ` . 了 月 . 0
I Q 男 6 4 6 15 . 1 2 6 5 3 . 7 5 . 2 4 . 8
1 1 女 6 6 6 0 5 . 9 2 7 3 2 . 2 5 . 2 5 . 5
1 2 男 6 5 9 6 2 . 了 2 1了6 . 5 5 . 0 6 . 竺
1 3 男 6 0 1 1 7 7 . 7 1 9 0 4 . 了 4 . 6 3 . 4
14 男 5 5 6 9 5 , 0 1丁5了 . 4 4 . 5 4 . 0
1 5 男 6 J 10 4 5 . 3 2 t 17 . 9 4 . 日 2 . 6
X 8 9 2
.
9 4 2 0 15
.
1 了 4 . 5 1 4 . 0 2
5 2 16
.
3 2 3 9 3
.
4 了 0 . 5 6 1 . 1 0
余f 子莱丹粗提准 : 、 量撇劫
图2 余甘子果汁粗提液加入且与抑制
百分率的关系
2
.
3 余甘子果汁粗提液 50 0 活性的测定
连苯三酚方碱性条件下自氧化 , 释放出
·
O 三, 生成带 色的中间产物 。 反应 开 始 后
溶液先变成黄绿 色, 几分钟后转为绿 色 , 线
性时间维持在 3 ~ 3 . s m i n , 于分光 光 度 计 3 2 5n m处测光密度值 , 连苯三酚自氧 化 速 率 为
。 . 07 0 O D / m i n ; 有 4 川 余甘子果汁粗提液时 , 样液速 率为 0 . 0 4 0 O D / m i n , 代入公式计 算
出单 位活力为 9 6 4 . 2 8 U / m l。
2
.
4 余甘子果汁对老年人红细胞 50 0活性和血浆 L P O含量的影响
1 5例服用余廿子果汁受试者 , 两个月后 , 红细胞 S O D 活性明显高于服用前 , 差 异 非 常
显著 (P < 0 . 0 0 1 ) 。 受试人体内抗氧化能 力均增强 。 在 15 例中 , 有 73 肠的受试者的 血 浆 L P O
含量有所下降 , 总平均 值亦有所下降 ( 表 3 ) 。
2期 刘风书等 : 余甘子果汁超氧化物歧化酶的研究 4 1
3 讨论
余甘子果汁有抑 制 N B T光化还原及抑制连苯三酚自氧化和肾上腺素 自氧 化的效应 , 因而
含有超氧 化物歧 化酶 。 每毫升果汁含有的酶活力为 96 4 . 28 国际单位 。
超氧化物歧化酶能对机体新陈代谢过程中产生的超氧阴离子自由基进行歧化反应 , 从而
减轻自由基对机体 的损害 , S O D 被认为是具有抗衰老作用的一种酶 〔 7 〕 。 术试 验 中 , 余甘
子果汁对提高人体血液中红细胞 S O D活性有十分显著 的作用 , 同时 降 低 了 血 浆 中 L P O 含
量。 这说明余甘子果汁对人体具育抗衰老作用 。
参 考 文 献
刘凤书 , 侯开卫 , 杨 臣 武 , 等 . 余甘 子对 强致瘤物 N 一亚硝基化合物合成的阻断作用 (一 ) . 热带作物学 报 , 19 8 8 ,
9 ( 2 )
: 6 5一 6了
侯开 卫 , 刘风书 , 杨 臣武 , 等 . 余甘 子对 强致癌物 N 一亚硝基化合物合成的阻断作用 (二 ) . 热带作物学报 , 19 89 ,
J O ( 1 )
: 6 3一6 7
侯开 卫 , 等 . 余甘子对 强致癌物 N 一亚硝 基化 合物在人体 内合成的阻 断 作 用 . 林 业 科 学研 究 , 10 8 9 , 2 ( 1 ) :
5 5一 6 8
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5 1功 P l e a s s a y f o r S O D . J B i o l e h e m , l日了2 , 2 4 7 : 3 1了。一 3 2 7 5
邓碧玉 , 袁勤生 , 等 . 改良的连苯三酚 自氧化 侧定超氧化物歧化酶活性 的方法 . 生物 化 学 与 生 物 物 理 进 展 ,
一9 马z , 18 ( 2 ) : 2 6 3
陶国 枢 , 等 . 四项衰老指标 的探讨 . 中华老年医 学杂志 , 19 8 8 , 7 ( 8 ) : 167 一 16 9
热 带 作 物 学 报4 2
S UP E ROX ID ED IS MA T US E IN F RUT IJ U ICE
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一 o x i d a t i o n p了r o g a l l o l 1 5 d i s e u s s e d i n t h e p r e s e n t p a p e r . E x p e r i m e n t s s h o w e d
t h a t p e r m i l l i l i t r e f r u i t j u i
e e e o n t a i n e d S O D w i t h a e t i v i t y o f 9 6 4
.
2 8 u n i t s
.
C l i n i e a l
t r e a tm e n t s f o r f i f t e e n o l d p eo p l e d e m o n s t r a t e d t h a t t h e j u i e e e o u l d i n e r e a s e a e t i v i t v
o f S O D a n d r e d u e e t h e e o n t e n t o f L P O i n h u m a n b o d y
.
T h e r e s u l t s i n d i e a t e d t h a t
S O D f r o m e m b l全e a p o s s e s s e d t h e f u n e t i o n o f a n t i s e n e s e e n c e .
K e y w o r d
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a e t i v i t y d e t e r m i n a t i o n
, c l i n i e a l t e s t