全 文 ：第 32 卷 第 2 期 暨南大学学报(医学版) Vol． 32 No． 2
2011 年 4 月 Journal of Jinan University(Medicine Edition) Apr． 2011
［收稿日期］ 2010 － 12 － 21
［基金项目］ 国家自然科学基金项目(81000923) ;广东省医学科学技术研究基金项目(B2009117) ;广东高校优秀青年创新人才培育项目
(2009400)
［作者简介］ 李朋军(1974 －) ，男，博士研究生，研究方向:天然产物抗肿瘤活性及分子机制研究
通讯作者:孙 艳，女，副教授，Tel:020 － 39352150;E － mail:sxmshw77@ 163． com
右旋一叶萩碱对小鼠黑色素瘤 B16
增殖及细胞周期的影响
李朋军1， 沈伟哉1， 叶文才2， 苏晓朴3， 孙 艳3
(暨南大学 1．医学院 人体解剖教研室;2．中药及天然药物研究所，广东 广州 510632;
3．广东药学院 生命科学与生物制药学院，广东 广州 510006)
［摘 要］ 目的:探讨右旋一叶萩碱对小鼠黑色素瘤 B16 细胞增殖和细胞周期的影响及其作用机制。方法:右旋
一叶萩碱作用于小鼠黑色素瘤细胞 B16，MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期。结果:右旋一叶萩碱以
时间和浓度依赖的方式抑制 B16 细胞生长;药物作用 72 h IC50为 63． 34 μmol /L;右旋一叶萩碱诱导 B16 细胞凋亡
并显著减少 S期、G2 /M期细胞。结论:右旋一叶萩碱可以抑制黑色素瘤细胞的恶性增殖，其作用机制与诱导细胞
凋亡、减少 S期和 G2 /M期细胞有关。
［关键词］ 右旋一叶萩碱; 黑色素瘤; 凋亡; 增殖; 细胞周期
［中图分类号］ R979． 19 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1000 － 9965(2011)02 － 0151 － 04
Effect of virosecurinine on proliferation and
cell cycle of mouse melanoma cell line B16
LI Pengjun1， SHEN Wei-zai1， YE Wen-cai2， SU Xiao-pu3， SUN Yan3
(1． Department of Anatomy，Medical College;2． Institute of Traditional Chinese
Medicine ＆ Natural Products，Jinan University，Guangzhou 510632，China;3． Life Science and
Biopharmaceutical College，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China)
［Abstract］ Aim:To investigate the effect and mechanism of virosecurinine on proliferation and cell cy-
cle of mouse melanoma cell line B16． Methods:B16 cells were treated with virosecurinine in vitro． Cell
proliferation was measured by MTT assay． Cell cycle was detected by flow cytometry． Results:Virose-
curinine inhibited proliferation of B16 in a time and dose-dependent manner with an IC50 value of 63． 34
μmol /L at 72 h． Virosecurinine induced apoptosis on B16 cells and decreased cells of S and G2 /M sta-
ges． Conclusion:Virosecurinine can inhibit malignant proliferation of melanoma cells． The mechanism is
associated with induced apoptosis and decreased cells of S and G2 /M stage in cell cycle．
［Key words］ virosecurinine; melanoma; apoptosis; proliferation; cell cycle
一叶萩碱(Securinine)是大戟科 (Euphorbiace-
ae)叶底珠属植物一叶萩 (Securinega suffruticosa
Pall． Rehd．)的主要生物碱。早期发现一叶萩碱的
主要药理活性是士的宁样中枢神经兴奋作用［1］，尤
其对脊髓兴奋作用强，其作用机制与拮抗抑制性神
经递质 γ-氨基丁酸(gamma amino butyric acid，GA-
BA)有关［2］。临床已应用左旋硝酸和盐酸一叶萩碱
治疗小儿麻痹后遗症、面神经麻痹、抑郁等神经系统
疾病。近来研究显示，一叶萩碱除了兴奋神经的作
用外，还具有较好的抗肿瘤活性，能抑制人早幼粒细
胞白血病 HL-60、人红白血病 K562、人骨肉瘤 HOS-
8603、人脑胶质瘤 SHG-44 等肿瘤细胞的增殖［3 － 5］，
本研究通过观察其旋光异构体右旋一叶萩碱(viros-
ecurinine)体外对小鼠黑色素瘤 B16 细胞增殖及细
胞周期的影响，探讨右旋一叶萩碱的抗肿瘤作用及
其可能机制。
1 材料与方法
1． 1 材料
(1)药物 右旋一叶萩碱，黄色结晶，受赠于暨
南大学药学院叶文才教授。用二甲亚砜(dimethyl
sulfoxide，DMSO)溶解，制备浓度为 50 mmol /L 的储
存液，－ 20 ℃保存。
(2)细胞株 小鼠黑色素瘤细胞株 B16 购自
美国标准生物收藏中心(American type culture col-
lection，ATCC)。
(3)主要试剂与仪器 RPMI1640 培养基购自
美国 Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青公司，3-
(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(3-〔4，
5-dime thylthiazol-2-yl〕-2，5-diphenyltetrazolium bro-
mide，MTT)、碘化丙啶(propidiumiodide，PI)、核糖
核酸酶 A(RNase A)购自美国 Sigma公司。
1． 2 方法
(1)MTT法检测细胞增殖 收集对数生长期的
肿瘤细胞。含体积分数 10%胎牛血清的完全培养
基调整细胞浓度，按 7. 0 × 103 /孔接种 96 孔板，设置
空白对照组，阴性对照组和实验组，每组设置 4 个复
孔。细胞接种 24 h，实验组加入右旋一叶萩碱，使其
终浓度分别为 5、10、20、40、80、160 μmol /L。空白
对照组加入等体积完全培养基。阴性对照组加入体
积分数为 1‰DMSO。药物作用 24、48、72 h后，加质
量浓度为 10 g /L的 MTT继续培养 4 h。弃上清，每
孔加入 150 μL DMSO 溶解，待完全溶解后振荡均
匀，酶标仪测定 490 nm波长处 A值。计算抑制率及
半数抑制浓度(50% inhibition concentration，μmol /
L，IC50)。
(2)流式细胞术检测细胞周期 收集对数生长
期的肿瘤细胞。含体积分数 10%胎牛血清的完全
培养基调整细胞浓度，按 4. 0 × 105 /孔接种 6 孔板，
设置阴性对照组和实验组。实验组加入右旋一叶萩
碱，使其终浓度为 20、40 μmol /L。药物作用 24 h后
收集细胞，体积分数为 70%冷乙醇 4 ℃固定 24 h，
PBS洗涤 2 次，10 μL RNase A (质量浓度为 10 g /
L) ，37 ℃水浴 30 min。质量浓度为 10 g /L的 PI染
液 4 ℃避光染色 30 min。流式细胞仪检测，ModFIT
软件分析结果。
1． 3 统计学分析
各项指标结果用(均数 ±标准差) (珋x ± s)表示，
采用 SPSS 11. 0 进行方差分析。
2 结果
2． 1 右旋一叶萩碱对 B16 细胞生长的影响
细胞培养 72 h，对照组 B16 细胞呈长梭形，折
光性好，生长速度较快，细胞呈重叠生长(图 1A) ;
浓度为40 μmol /L右旋一叶萩碱作用组，细胞数较对
A．对照组;B．右旋 －叶萩碱浓度 40μmol /L;C．右旋 －叶萩碱浓度 80 μmol /L．
图 1 右旋一叶萩碱作用 72 h后 B16 细胞形态学改变(× 200)
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照组明显减少，部分细胞出芽形成小泡(图 1B) ;浓
度为80 μmol /L作用组，细胞缩小、变圆，出现较多圆
形或椭圆形颗粒(图 1C)。2． 2 右旋一叶萩碱抑制
B16 细胞增殖
浓度 60 μmol /L右旋一叶萩碱作用于 B16 细胞
24、48、72 h，结果显示可以抑制 B16 细胞增殖，且随
时间延长抑制作用增强。作用 48、72 h 的抑制率
(63. 29 ± 2. 33)及(69. 12 ± 0. 77)分别与作用 24 h
的抑制率(11. 36 ± 2. 53)相比，P ＜ 0. 05，有统计学
差异。应用不同浓度右旋一叶萩碱作用于 B16 细
胞 72 h，结果显示右旋一叶萩碱抑制 B16 增殖的作
用具有浓度依赖性(图 2) ，作用 72 h IC50为(63. 34
± 7. 42)μmol /L。
图 2 不同浓度右旋一叶萩碱对 B16 细胞增殖的抑制
2． 4 右旋一叶萩碱对 B16 细胞周期的影响
流式检测右旋一叶萩碱对 B16 细胞周期的影
响，结果显示右旋一叶萩碱可以诱导 B16 细胞凋亡
(图 3)。作用 24 h，对照组细胞凋亡率为 (1. 50 ±
0. 10)%，浓度 20 μmol /L 组细胞凋亡率为(4. 5 ±
0. 61)%，浓度 40 μmol /L组细胞凋亡率为(16. 30 ±
2. 11)%，各处理组间有统计学差异(P ＜ 0. 01)。浓
度分别为 20、40 μmol /L组 S期细胞分别为 (3. 9 ±
0. 53)%、(1. 17 ± 0. 15)%，G2 /M 期细胞分别为
(5. 5 ± 0. 51)%、(4. 6 ± 1. 05)%，与对照组(S 期细
胞: (15. 2 ± 2. 0)%;G2 /M 期细胞: (13. 2 ±
0. 55)%)相比显著减少(P ＜ 0. 01，图 4)。
1) :与对照组比较 P ＜ 0. 05;2) :与对照组比较 P ＜ 0. 01．
图 4 右旋一叶萩碱对 B16 细胞周期的影响
A．对照组;B． 右旋 －叶萩碱浓度 20 μmol /L;C． 右旋 －叶萩碱浓度 40 μmol /L．
图 3 流式细胞术检测右旋一叶萩碱作用 24 h对 B16 细胞周期及凋亡的影响
3 讨论
本研究结果显示右旋一叶萩碱具有抑制小鼠黑
色素瘤 B16 细胞增殖活性，并呈现出明显的浓度和
时间依赖性。此外，右旋一叶萩碱作用后出现 sub
G1 峰，且随浓度增加而增大;形态学观察可见典型
的凋亡改变:细胞缩小变圆，出现凋亡小体样颗粒
等。说明右旋一叶萩碱与左旋一叶萩碱［5 － 6］均可诱
导肿瘤细胞发生凋亡。研究显示，一叶萩碱抑制
K562、HL-60 增殖的作用与诱导凋亡有关［6］，但其
作用强度则明显低于右旋一叶萩碱。浓度 40
μmol /L右旋一叶萩碱作用 24 h 诱导 16. 30%的细
351第 2 期 李朋军，等:右旋一叶萩碱对小鼠黑色素瘤 B16 增殖及细胞周期的影响
胞发生凋亡，而浓度 184 μmol /L 一叶萩碱作用 48
h，HL-60 细胞凋亡百分数仅为 14. 7%。一叶萩碱
诱导肿瘤细胞凋亡分子机制与提高细胞内钙离子浓
度，下调 bcl-2 基因表达有关［7］。
本研究结果显示右旋一叶萩碱可以显著减少 S
期、G2 /M 期细胞。而 Dong 等
［6］报道，一叶萩碱诱
导 HL-60 凋亡的同时，S 期、G2 /M 期细胞增加。可
能与作用的肿瘤细胞不同或药物旋光性不同有关。
由于本实验中 G1 期细胞并未出现规律性的增加，S
期、G2 /M期细胞减少可能是由于处于该时期的细
胞死亡而并非由细胞阻滞于 G1 期造成的。
Rana S等［8］报道，一叶萩碱可以通过促进 p53
家族蛋白 p73 的表达诱导 p53 缺陷结肠癌细胞株
RKO发生显著凋亡，而表达 p53 的结肠癌 HCT116
则通过 p53 介导的 p21 上调保护细胞，仅发生较低
水平的细胞凋亡。由于多数肿瘤细胞都存在 p53 失
活，一叶萩碱可以在杀伤肿瘤细胞的同时保护表达
p53 的正常细胞，因此可能是理想的抗肿瘤药物。
而比较左旋和右旋一叶萩碱药理学作用的研究［9］，
左旋一叶萩碱和右旋一叶萩碱均有升血压和兴奋呼
吸的作用，但左旋一叶萩碱存在致抽搐作用，右旋一
叶萩碱没有;右旋一叶萩碱的急性毒性是左旋一叶
萩碱的 1 /13. 6，说明右旋一叶萩碱的安全性可能
更好。
本研究结果提示右旋一叶萩碱具有抗肿瘤活
性，深入探讨其抗肿瘤及诱导细胞凋亡的分子机制
将为一叶萩碱的临床新用途提供实验依据。
［参考文献］
［1］ 彭建中，陈先瑜． 硝酸一叶萩碱的中枢作用［J］． 中
华医学杂志，1977，57(6) :334 － 335．
［2］ BEUTLER J A，KARBON E W，BRUBAKER A N，et
al． Securinine alkaloids:a new class of GABA receptor
antagonist［J］． Brain Res，1985，330(1) :135 － 140．
［3］ 董宁征，刘卫军，顾振纶． 一叶萩碱对不同细胞增殖
影响及鼠体内抗肿瘤作用［J］． 苏州医学院学报，
1998，18(2) :115 － 119．
［4］ 董宁征，顾振纶． 一叶秋碱的抗肿瘤作用及其机制研
究［J］． 中成药，1999，21(4) :193 － 195．
［5］ 刘卫军，顾振纶，周文轩． 一叶秋碱诱导 K562 细胞凋
亡［J］． 中国药理学通报，1999，15 (2) :135 － 138．
［6］ DONG N Z，GU Z L，CHOU W H，et al． Securinine in-
duced apoptosis in human leukemia HL-60 cells［J］．
Zhongguo Yao Li Xue Bao，1999，20(3) :267 － 270．
［7］ 刘卫军，顾振纶，周文轩，等． 一叶萩碱诱导 K562 细
胞凋亡及对［Ca2 +］i 的影响［J］． 苏州医学院学报，
1999，18(11) :1127 － 1128．
［8］ RANA S，GUPTA K，GOMEZ J，et al． Securinine in-
duces p73-dependent apoptosis preferentially in p53-defi-
cient colon cancer cells［J］． FASEB J，2010，24(6) :
2126 － 2134．
［9］ PU H，ZHAO J，PONG B，et al． Pharmacological com-
parison between virosecurinine and securinine［J］． Zhong
Yao Cai，2001，24(4) :278 － 280．
［责任编辑:朱颖嫄］
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