全 文 ：收稿日期:2004 —06 —14
修订日期:2004 —07 —05
＊“863”计划生物和现代农业技术领域生物工程技术课题“生
物柴油关键技术与对策研究”项目内容。
绿玉树多倍体诱导及其抗寒性研究＊
李培旺1 , 李昌珠1 , 周朴华2 , 蒋丽娟1
(1.湖南省林业科学院 , 湖南 长沙　410004;　2.湖南省农业大学 , 湖南 长沙　410218)
摘　要:采用不同浓度的秋水仙碱对绿玉树试管丛芽块进行多倍体诱变处理 ,试验结果表明:不同处理方法和处理
浓度影响四倍体的诱变率 , 0.25%秋水仙碱浸泡和共培养 48 h以上均能诱导绿玉树产生大量的四倍体小苗。四倍体
小苗与正常二倍体小苗比较 ,叶子颜色深绿 , 不易脱落 , 茎干较粗壮 ,经根尖细胞学鉴定染色体鉴定为 40 条(2n=4x
=40 , x=10),耐低温能力强。
关键词:绿玉树;多倍体;秋水仙碱;抗寒性
中图分类号:S 722.3　　　文献标识码:A　　　文章编号:1003 —5710(2004)05 —0007 —03
Polyploid induce and the cold-resistant characteristics of the
induced polyploid plantlets for Euphorbia tirucalli (L.)
LI Pei-wang1 , LI Chang-zhu1 , ZHOU Pu-hua2 , JIANG Li-juan1
(1.Hunan Forestry Academy , Changsha 410004 , China;　2.Hunan Agriculture Univ., Changsha 410218 , China)
Abstract:Experiments of polyploid inducement using colchicines was conducted on the Euphorbia tirucalli(L.).The results showed:the te-
traploid proliferation rate was affected by concentration of colchicines and treatment methods.Explants whether were soaked in 0.25 %
colchicine solution or cultured on media containing 0.25% colchicines could proliferate tetraploid shoots.Compared with the shoots reproduced
from control explants , polyploid shoots have black green leaves , larger stems , and leaves remained longer.The normal plantlet has 20 chromo-
somes , and the polyploid plantlet has 40 chromosomes.The tetraploid plantlets has greater cold-resistance.
Key Words:Euphorbia tirucalli ;polyploid;colchicines;cold-resistant
　　染色体是遗传物质的载体 , 多倍体由于染色体数目倍
增 ,植物组织器官 、生理功能 、发育 、形态以及产量 、品质等方
面都会相应地发生变化。多倍体品种的生物产量有望提高 ,
抗病性和抗逆性有望增强。利用组织培养进行多倍体诱导
与常规方法或种子诱变方法相比 , 具有明显的优点。 首先 ,
在组织培养条件下 ,可以反复大批量在培养瓶中处理植物愈
伤组织 、丛生芽等 , 从而大大提高诱导成功率;其次 , 由于组
织培养不受自然条件的影响 ,诱导条件易于控制;第三 ,在离
体培养条件便于继代培养 , 多次选择 , 减少嵌合体。因此在
离体培养条件下 ,利用秋水仙碱进行染色体加倍不管是草本
植物还是木本植物都已有很多成功的报道[ 1 ～ 5] 。
绿玉树(Euphorbia tirucalli)是大戟科大戟属植物 , 又名橡
胶大戟(rubber euphorbia)、绿珊瑚 、白乳木(millkbush)。 直立
无刺的灌木或小乔木 ,高 2 ～ 10 m。是一集药用 , 供能 、观赏 、
工业原料 、环境绿化 、水土保持于一体 , 且具能源 、生态 、经济
综合效益的多功能 、 多用途树种。我国海南 、广州 、西双版
纳等地作为庭园观赏树种零星引种栽培 , 其药用和能源价值
逐步被认识 ,并开始把它作为能源 、防护林造林树种进行引
种栽培。本研究在已建立的绿玉树再生系统的基础上 , 以离
体培养的绿玉树丛芽块为试验材料 ,研究不同浓度秋水仙碱
的诱变效果 ,期望获得优良绿玉树同源四倍体新种质。
1　试验材料与方法
1.1　材料
组培无菌丛芽块。
1.2　方法
1.2.1　染色体加倍的诱变处理方法　本研究采用浸泡与混
合培养2 种方法。
(1)浸泡法。将带丛芽的小茎段投入无菌的不同浓度
秋水仙碱溶液中浸泡12 ～ 72 h , 无菌水反复冲洗多次后 ,取出
进行培养。
(2)混合培养法。 将不同浓度秋水仙碱溶液配入培养
基中 ,灭菌 ,并将带丛芽小茎段转入此培养基上进行培养。
1.2.2　对照　不加秋水仙碱诱变剂只作继代培养。
1.2.3　秋水仙碱处理浓度　0.1 %, 0.25 %, 0.5%。
1.2.4　培养基　3/4MS+ZT 0.5～ 2 mg/ L+NAA 0.01～ 0.02
湖南林业科技　2004年第31卷第 5 期 研究报告　
+蔗糖 3%。
1.2.5　倍性鉴定
(1)对植株的外形特征进行观察鉴定。
(2)细胞学鉴定。对获得的试管苗进行生根培养 , 待根
长至 1.5～ 2.0 cm 长时 , 于上午 9:00～ 10:00 取样 ,切下根尖
1 cm 长 ,放入饱和对二氯苯进行前处理 2 h , 移入 0.75 mol/ L
KCl前低渗 , 2.5 %纤维素酶和 2.5 %果胶酶酶解 ,蒸馏水后
低渗 ,卡诺氏液固定;改良卡宝品红染色 , 压片 , 正丁醇脱水 ,
加拿大树胶封片 ,显微镜观察摄影。
(3)超微结构的制片与观察方法。纵向切取幼茎的表
皮和皮层组织 , 4%戊二醛预固定 , 用 0.2 M 磷酸缓冲液
pH 7.2 ,漂洗 3～ 5 次 ,每次 20 min;2%锇酸固定 3 h;用 0.2M
磷酸缓冲液 pH 7.2 ,漂洗 3 ～ 5 次 , 每次 15 min;用 50 %～ 100
%ALC 脱水 3 h ,用环氧柄酰过渡 3 次 , 每次 20 min;Epon 812
环氧树脂包埋聚合;切片厚度为 70 nm 左右 , 经醋酸铀 、柠檬
酸铅双染色。H-600(日立)型透射电子显微镜观察拍照。
(4)细胞膜透性的测定方法。采用李振国测定方法。
将正常二体和诱导产生的四倍体试管苗分别在常温(25 ℃)、
8 ℃, 2 ℃、0 ℃温度下处理 16 h , 然后转致常温。将经不同温
度处理的枝条切成1 cm长的若干小段 , 称取1 g 小茎段 ,测定
电导率。各处理均设 3 个重复 , 鲜重相同 , 材料段数尽量接
近。以电解质的相对外渗率表示细胞膜受损程度 , 电解质相
对外渗率(%)=枝条杀死前的电导率/枝条杀死后(全透性)
电导率×100。
2　结果分析
2.1　秋水仙碱不同浓度和不同处理方法的诱变效果
试验结果见表1。未经处理的丛芽 ,其生长分化正常;经
秋水仙碱处理的材料其生长和分化都受到不同程度的抑制 ,
且出苗率随秋水仙碱浓度的增高和处理时间的延长而降低。
液体浸泡处理法比混合培养法处理丛芽块更直接 , 但两种处
理方法对绿玉树的生长状况的影响表现出一致的趋势。当
表 1　秋水仙碱不同浓度和不同处理方法的诱变效果
方法
Method
处理时间
Treat time
0.1%
处理丛
芽块数
No.of
treated
explants
　
呈多倍体
性状的芽
块数＊
Shoots
presenting
polypoild
诱导率%
Mutant
percentage
%
0.25%
处理丛
芽块数
No.of
treated
explants
　
呈多倍体
性状的芽
块数＊
Shoots
presenting
polypoi ld
诱导率%
Mutant
percentage
%
0.5%
处理丛
芽块数
No.of
t reated
explants
　
呈多倍体
性状的芽
块数＊
Shoots
presenting
polypoild
诱导率%
Mutant
percentage
%
浸泡法
混合培
对　照
12 50 0 0 50 5 10 50 15 30
24 50 4 8 50 12 24 50 22 44
48 50 21 42 50 38 76 50 22 44
72 50 20 40 50 18 36 50 13 26
12 50 0 0 50 3 6 50 9 18
24 50 5 10 50 9 18 50 19 38
48 50 33 66 50 31 62 50 11 22
72 50 44 88 50 40 80 50 7 14
50 50 0
　　＊注:苗增粗 ,呈瓶状的小苗 ,经染色体鉴定为 2n=4x=40。
处理浓度为 0.5 %、浸泡处理 48 h 以上 , 大分部丛芽块褐变;
混合培养时 ,材料在培养过程外植体均先后死亡或是停止生
长分化 ,未能诱导产生新芽。当处理浓度为 0.25 %时 , 混合
培养和浸泡处理 12 ～ 24 h 的丛芽块中有芽生长 , 部分茎增
粗 ,呈瓶状小苗, 大部分为正常二倍体小苗;而处理 48 h 以上
产生呈瓶状的小苗数量增多。处理浓度为0.1%时, 浸泡和混
合培养处理 12～ 24 h ,丛芽没有受害状 ,大多数小苗呈现为二
倍体性状 ,而混合培养处理 48 h 以上 , 部分小苗增粗 ,呈瓶状。
2.2　倍性鉴定
2.2.1　外观形态鉴定　对经秋水仙碱处理获得茎增粗 , 形
如瓶状的小苗与对照比较 , 叶片较厚 , 颜色浓绿 , 不易脱落 ,
茎干较粗壮的(图 1①, ②)为多倍体苗 ,并将这些小苗苗端段
一分进行生根培养 ,部分进行丛芽增殖继代培养。
2.2.2　细胞学鉴定　取对照及10株初步定为多倍体苗根尖
作细胞学鉴定 ,鉴定结果如表 2。从表 2中可知 , 未经秋水碱
处理的丛芽形成的小苗为二倍体(2n=2x=20), 而所得的多
倍体植株全为四倍体(2n=4x=40 , 图 1③, ④)。 在表 2 中有
的细胞染色体比正常细胞多一条 ,有可能是制片时将染色体
　　①二倍体植株;②秋水仙碱处理产生的四倍体植株;③二
倍体植株细胞染色体数(2n=2x=20);④四倍体植株细胞染色
体数 40条(2n=4x=40)
图 1　二倍体 、四倍体植株及其细胞染色体数
· · 李培旺 ,等:绿玉树多倍体诱导及其抗寒性研究8　
表 2　各种材料细胞学鉴定结果
代号 材料
具可数
分裂相
细胞数
2n=20
细胞数
　
2n<20
细胞数
　
2n=40
可数分
裂细胞
数
2n<40
细胞数
　
2n>40
　
　
1
对照(正
常 2倍体) 45 34 1 0 0 0
2 诱变株 50 0 0 47 2 1
3 诱变株 39 0 0 35 4 0
4 诱变株 38 0 0 37 1 0
5 诱变株 40 0 0 38 2 0
6 诱变株 43 0 0 43 0
7 诱变株 42 0 0 39 3 0
8 诱变株 42 0 0 40 1 1
9 诱变株 39 0 0 39 0 0
10 诱变株 37 0 0 35 2 0
11 诱变株 39 0 0 38 1 0
压断 ,有的少一条 , 可能是另一染色体没在一个平面 , 是制片
中出现的问题。
2.3　多倍体丛芽增殖继代培养
获得的多倍体苗端段用于生根 ,腋芽段在增殖培养基 3/
4MS+ZT 1.0 mg/ L+NAA 0.02 mg/ L+GA 30.01 mg/L上腋芽
萌动形成丛芽 ,而且与培养基接触的节间也分化形成一定量
的不定芽。通过连续 10代对这些丛芽及其试管苗的形态观
察 ,未发现嵌合体现象 , 这也充分说明了只要诱变出来是真
正四倍体 , 在绿玉树多倍体丛芽的形成和成苗是十分稳定
的。
2.4　低温对叶绿体 、线粒体超微结构的影响
将正常二倍体和诱变获得的四倍体试管苗经 0 ℃低温
处理 24 h ,在常温下恢复生长 1 d 后 ,取样固定制片 , 观察叶
绿体 、线粒体超微结构的变化。没经低温处理的常规试管苗
为叶绿体和线粒体正常结构 ,以没经诱变处理的试管苗经低
温处理后叶绿体 、线粒体的变化为负对照。正常细胞的叶绿
体 、线粒体小 , 紧靠细胞膜分布 ,数量少 ,细胞被大液泡充满 ,
细胞质少 ,紧贴细胞膜 , 叶绿体由基粒和基粒片层构成 ,叶绿
体内有大淀粉粒二倍体小苗 ,经 0 ℃低温处理后 , 叶绿体变
成圆球状 ,叶绿体内基粒和基粒片层结构紊乱 , 淀粉粒解体 ,
线粒体溶解。而经秋水仙碱诱导产生的 4 倍体小苗 , 叶绿
体 、线粒体结构稍有紊乱 , 但结构仍基本保持完整。
2.5　低温对不同材料细胞膜透性的影响
植物受低温冷害时 ,其细胞膜的透性会显著增加 , 因此
可以用膜透性的变化即电解质相对外渗率作为衡量植物或
不同品种抗寒性的指标。供试材料经不同温度处理后电解
质相对外渗率的变化结果如图 2 ,在 8 ℃时 2 种供试材料的
细胞膜透性变化很接近。在 2 ℃时 ,二倍体植株电解质的相
对外渗率为 42.8 %, , 而经诱变选育的四倍体材料此时的电
解质外渗率小于 40%。经 0 ℃处理时只有四倍体植株其细
胞膜电解质外渗率小于50%,抗寒性稍强于前者。而其它供
试材料均大于 50%。
图2　不同供试材料在不同温度下电解质相对外渗率的
变化
3　讨论与结论
(1)秋水仙碱溶液浸泡丛芽及其丛芽在加有秋水仙碱
溶液的培养基上培养所获得的良好加倍效果表明:顶端分生
组织的细胞得到了很好的诱变效果 ,所用的两种方法都得到
了多倍体植株 ,但从操作和加倍效果两个方面考虑 , 培养基
混合培养法较为简单 ,诱导率较高 , 优于液体浸泡法。
(2)用秋水仙碱诱导多倍体基本方法比较成熟。 但是
将组织培养技术和绿玉树同源四倍体的诱发相结合 , 使选择
与快速繁殖同步进行 ,与其它方法相比较 ,具有诱变频率高 ,
便于选择淘汰 ,所建立起来的绿玉树同源多倍体无性系稳定
性好 。为创造绿玉树新种质及快速繁殖有重要科学价值。
(3)所筛选出的四倍体植株的抗寒性比二倍体强。
要想培育出绿玉树多倍体新品种 , 还须经过田间试验 、
经济性状选择等大量研究工作 ,多倍体绿玉树新种质的获得
已经奠定了前期坚实基础。但是要重视秋水仙碱诱导产生
的多倍体橡胶树大多数品系橡胶产量低于正常二倍体植株
这一现实 , 加强对多倍体绿玉树株系的选择有待进一步研
究。
参考文献:
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