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复合酶法优化碎米荠多糖的提取工艺及其抗氧化活性



全 文 : 复合酶法优化碎米荠多糖的提取工艺及其抗氧化活性1
罗凯 1,2 ,黄秀芳 1,2 ,周毅峰 1,2 ,张弛 1,2*
(1 湖北民族学院生物科学与技术学院 湖北 恩施 445000 2 生物资源保护与利用湖北省重点实验室 湖
北 恩施 445000)
摘 要:利用人工种植的碎米荠为原料,研究其粗多糖的提取工艺参数及抗氧化活性。首先对提取条件
的单因素进行了优化,在单因素优化的基础上,进行了提取条件的响应面优化。单因素优化结果显示:
2%(质量浓度)的复合酶(纤维素酶:果胶酶=2:1)为最佳复合酶配方;最佳的碎米荠酶解时间为 90min;
最佳酶解温度为 60℃;最佳 pH 定为 4.0。响应面优化结果为:酶解时间 91.8min,酶解温度 57.1℃,pH
值 4.17。在此条件下,碎米荠粗多糖的提取率最高,粗多糖的得率预测值为 4.14%,在此条件下做验证
实验,得到实际粗多糖的平均得率为 4.07%;与理论预测值相比,其相对误差约为 1.62%。抗氧化活性
研究结果显示碎米荠多糖具有抗氧化活性,且效果优于 VC。该实验结果为碎米荠多糖的提取以及多糖的
性质研究提供了一定的试验基础。
关键词:碎米荠; 多糖; 提取条件; 优化
Optimization of the multi-enzymatic extraction of polyphenols from Cardamine
hirsuta L. as well as its Antioxidant Activity
LUO Kai1,2, HUANG Xiu-fang1,2, Zhou Yi-feng1,2, Zhang Chi1,2*
( 1. College of Biological Science and Technology, Hubei University for Nationalities ,Hubei Enshi,445000, China; 2. Key
Laboratory of Biological Resources Protection and Utilization of Hubei Province, Hubei Enshi,445000, China)
Abstract: The extraction parameters of crude polysaccharide were studied by use the artificial
cultivation of Cardamine hirsuta L. as raw material. On the basis of the single factor
optimization, response surface optimization was carried out. The single factor optimization
results as: 2% (mass concentration) of compound enzymes (cellulase: pectinase =2:1) as the best
enzyme complex formula; Cardamine hirsuta L. optimal enzyme hydrolysis time was 90 min;
the optimum enzymatic hydrolysis temperature should be about 60 ℃, the best pH is set to 4.
Response surface optimization results as: Cardamine hirsuta L. optimal enzyme hydrolysis time
was 91.8 min, enzymatic hydrolysis temperature 57.1℃, the best pH is set to 4.17. Under this
condition, the extraction rate of polysaccharide from Cardamine hirsuta L. the highest yield
predictive value of 4.14% . Under these conditions, the experiment were done, the average yield
of the actual crude polysaccharide was 4.07%, compared with the theoretical prediction, the
relative error is about 1.62%. The results show that Cardamine hirsuta L. polysaccharides have

基金项目:湖北民族学院博士启动基金项目(MY2015B031)。
作者简介:罗凯(1979—),男,博士,副教授,主要研究方向为食品化学与营养学。E-mail:luokai_79@163.com
*通信作者:张弛(1965—),男,教授,硕士,研究方向为地方特色食品资源开发。E-mail: zhtzu@163.com

2016-11-14
1
网络出版时间:2016-11-16 15:37:50
网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20161116.1537.042.html

antioxidant activity, and the effect was better than that of VC. The experimental results provide
some experimental basis for extraction of Cardamine hirsuta L. polysaccharides and study on the
properties of Polysaccharides.
Key words: Cardamine hirsuta L.; polysaccharide; extraction parameters; optimization
中图分类号: TS255.36 文献标志码:A
碎米荠(Cardamine hirsute)属 1~2 年生草本植物,属十字花科。大部分生长在海拔约
1000m 的山坡林下沟边湿地,全世界发现了大约 130 种,我国发现大约 40 种。分布于我国
南北各地[1]。碎米荠最初出现在《野菜谱》上[2],被当作野菜食用用,碎米荠的幼嫩茎叶可
以作为珍贵的野菜食用且口感良好。碎米荠被用来当药用也有很长的历史[3],《食性本草》
和《食疗本草》均有相关记载。碎米荠属中大多数种类都可以作为药用,如紫花碎米荠
(Cardamine tangutorum)能治黄水疮和筋骨疼痛[4];大叶碎米荠(Cardamine macrophylla)
当作草药用可以利通小便、止痛和治疗败血病[5];华中碎米荠(Cardamine urbaniana)的根
状茎可以治哮喘和支气管炎[6];光头山碎米荠(Cardamine engleriana)的植株能化痰止咳;
弹裂碎米荠(Cardamine impatiens)可以用于月经不调;水田碎米荠(Yrata Bunge)和碎米
荠(Cardamine hirsuta)可以清热去湿气;弯曲碎米荠(Cardamine flexuosa)清热去湿健胃
和止泻[7]。同时有研究证明碎米荠具有超强的硒聚集功能[8-12],其聚集的的硒部分与多糖进
行结合,因此碎米荠多糖与一般植物多糖相比较,其功能更加丰富。碎米荠多糖不仅可以使
癌细胞的 DNA 合成受阻而抑制癌细胞生长,而且可以通过提高相关酶的活性来拮抗重金属
中毒和抗氧化活性的能力[13-16]。碎米荠多糖的提取效率和质量对于进一步开发碎米荠资源,
生产出碎米荠保健品具有十分重要的意义。本文在对人工种植碎米荠多糖提取条件的探索
下,运用响应面法优化复合酶法提取多糖的工艺,并进行其体外抗氧化活性研究,旨在为碎
米荠的开发利用提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
碎米荠材料采自于恩施市碎米荠人工种植基地。
实验药品:纤维素酶(15 U/mg)、果胶酶(500 U/mg)国药集团化学试剂有限公司;
葡萄糖、苯酚、浓硫酸、氢氧化钠、三正丁醇乙醇、氯甲烷、无水乙醇、乙醚等均为分析纯,
成都市科龙化工试剂厂。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) 国
药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
500 g 多功能粉碎机 永康市小宝电器有限公司;DHG 型电热恒温鼓风干燥箱 上海一
恒科技有限公司;AL204 电子天平(精确至 0.000 1 g) 梅特勒-托利多仪器有限公司;AKHL-
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Ⅲ-24 超纯水机 成都康宁试验专用纯水设备厂;旋转蒸发器 上海亚荣;离心机 德国
Eppendorf;UV-3802H 型紫外-可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;磁力搅拌器、循
环水式真空泵 巩义市英峪予华仪器厂;DHZ-C 大容量冷冻恒温振荡器 江苏太仓市试验设
备厂。
1.3 方法
1.3.1 碎米荠多糖酶法提取工艺[17-20]
碎米荠材料干燥粉粹,过 80 目筛,60℃干燥 2 小时。称取 100g置 250ml 圆底烧瓶,
加石油醚 100ml,75℃回流 1 小时脱脂,过滤,石油醚回收重复利用,滤渣挥干备用。准确
称取 1g处理样品,加蒸馏水 100mL,调 Ph,升温 50℃,加入酶,不同条件下进行酶解,
离心,滤液加 95%乙醇使醇含量达 80%,冰箱静置过夜沉淀。适量水溶解,加入 3 倍体积
Sevesge 试剂,振荡,静置,分液,再进行两三次振荡分离后醇沉过夜。沉淀再次溶解,定
容至 10mL,苯酚硫酸法测定多糖含量,计算提取率(提取率=粗多糖(g)/样品(g))。
1.3.2 标准曲线的制作及多糖含量的测定
参考文献[21-22]
1.3.3 碎米荠粗多糖提取单因素试验
在碎米荠多糖的酶法提取制备过程中,影响多糖得率最重要的因素是酶的种类和有效浓
度。为了研究这些因素对多糖提取率的影响规律,试验对反应条件进行了设置:控制碎米荠
酶解反应的温度为 60℃,酶解时的 PH 值设为 4,然后分别选择不同浓度的果胶酶、纤维素
酶以及两种酶的复合酶,对碎米荠粉末进行持续 60min 的酶解反应。对提取液进行处理,测
定碎米荠粗多糖的提取得率。
选取以上优化后的最优复合酶,控制其它反应条件(如酶解温度 60℃、pH=4)分别测
定酶解时间为 30、60、90、120、150min 时碎米荠多糖的得率;根据以上研究结果,选取最
优复合酶组合,控制其它反应条件(如酶解时间 60min、pH=4),分别测定酶解温度为 30、
40、50、60、70℃时碎米荠多糖的得率。
1.3.4 响应面优化试验设计
在单因素优化实验的基础上对最优复合酶的酶解时间(A)、酶解温度(B)和 pH 值
(C)3 个因素进行三因子响应面设计,优化碎米荠多糖的复合酶提取工艺参数,试验设计
的方案见表 1。对各因素水平下碎米荠多糖的提取率进行测定,并以计算所得碎米荠多糖的
得率为响应值进行统计学回归分析


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编码水平 时间(A/min) 温度(B/℃) PH(C)
1 60 50 3
0 90 60 4
-1 120 70 5
1.3.5 碎米荠多糖体外抗氧化活性实验[21,22]
分别取不同质量浓度的样品溶液 2 mL 以及 DPPH 溶液 2 mL(0.08 mg/mL),置于预先
编号的洁净三角瓶中(100mL),混匀,待反应进行 30 min 后在 517 nm 波长处测定其吸光
度,用 VC 标准品作为对照。按照下式计算碎米荠多糖清除 DPPH 自由基的清除率:

清除率(%)=

式中:ADPPH为 DPPH 溶液的吸光度;A 样品为加入样品溶液或加入 VC 后样品 DPPH 溶
液的吸光度。
1.4 数据处理
在本实验数据检测中,每组数据均检测三次取平均值,采用origin 7.5软件以及Excel2007
进行处理。

2 结果与分析
2.1 单因素试验结果分析
2.1.1 酶种类和浓度对碎米荠粗多糖提取得率的影响


酶的种类 酶的百分比用量(%) 碎米荠粗多糖得率(%)
纤维素酶 1 1.46
1.5 2.26
表 1 复合酶提取碎米荠多糖的响应面试验因素水平
Table 1 Corresponding actual values of factors in Box-Behnken design
ADPPH-A 样品
ADPPH
表 2 酶种类和浓度对碎米荠粗多糖提取得率的影响
Table 2 Effect of variety and activity of enzyme on the yield rate of polysaccharide from Cardamine
hirsuta L.
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通过对实验结果进行分析发现,不同种类以及不同配比的酶在浓度不同的时候,对碎米
荠多糖的提取得率影响各不相同,但规律基本一致,且粗多糖的得率都随酶浓度的升高呈现
先增大后稍微有减少的变化趋势。纤维素酶、果胶酶、纤维素-果胶复合酶(纤:果质量比=1:1、
1:2 和 2:1)均在质量百分数为 2%时,碎米荠粗多糖的得率达到最大。其中,由质量百分含
量为 2%的纤维素-果胶复合酶(纤:果=2:1)辅助提取时,碎米荠粗多糖的得率最高达到
3.95%。因此本研究拟定质量百分含量为 2%的复合酶(纤:果=2:1)为最佳复合酶,并进行
后续试验。
2.1.2 酶解时间对碎米荠多糖得率的影响
酶对细胞的作用有一个处理过程,因此,酶的作用实践肯定会影响提取效率。酶解时间
对碎米荠多糖得率的影响结果如图 1 所示。由图 1 可见,在提取的前 90min 内,随着酶解处
理时间的延长,碎米荠多糖的提取率逐渐上升;但在 90min 后提取率反而呈逐步下降趋势。
这种变化趋势可能与酶发挥作用的最适反应时间以及酶的最适反应温度有关,因此发现酶促
提取时间越长不一定越适合酶的活力发挥。据此,最佳的碎米荠酶解时间为 90 min,此时粗
多糖的提取率最高。
2 3.50
2.5 2.19
3 2.10
果胶酶 1 1.36
1.5 1.99
2 3.46
2.5 2.25
3 2.12
复合酶(纤:果=1:2) 1 1.78
1.5 2.57
2 3.85
2.5 3.06
3 2.84
复合酶(纤:果=1:1) 1 1.67
1.5 2.46
2 3.74
2.5 2.96
3 2.71
复合酶(纤:果=2:1) 1 1.86
1.5 2.73
2 3.95
2.5 3.42
3 2.94
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2.1.3 酶解温度对碎米荠多糖得率的影响
温度对酶的活性影响很大,每一种酶都具有本身最适宜的温度。酶解温度对碎米荠多糖
得率的影响结果如图 2 所示。从图 2 结果可以看出,低于 50℃时,随着温度的提升,酶的
活性也随着升高,碎米荠粗多糖的提取率也随之提高;但温度超过 50℃以后,粗多糖的得
率变化不大,温度超过 60℃以后,得率下降十分明显,这可能是当温度升高到一定程度时,
酶蛋白开始受热变性,使得酶的活性降低,从而降低了粗多糖的提取率。据此拟确定碎米荠
粗多糖提取的最佳酶解温度应约为 60℃。











2.1.4 pH 值对碎米荠多糖得率的影响
pH 过小(过酸)、过大(过碱)都能使酶蛋白变性而失活,pH 的改变能影响酶活性中
心上必须基团的解离程度,同时也可以影响底物和辅酶的解离程度,从而影响酶分子对底物
图 1 酶解时间对碎米荠多糖得率的影响
Fig.1 Effect of hydrolysis time on extraction yield of polysaccharide from Cardamine hirsuta L.
20 40 60 80 100 120 140 160
1 .0
1 .5
2 .0
2 .5
3 .0
3 .5
4 .0
4 .5
5 .0









%)
酶 解处理时间( min)
40 45 50 55 60 65 70
2 .0
2 .2
2 .4
2 .6
2 .8
3 .0
3 .2
3 .4
3 .6
3 .8
4 .0
4 .2








%)
酶 解 温度 ( %)
图 2 酶解温度对碎米荠多糖得率的影响
Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on extraction yield o polysaccharide
from Cardamine hirsuta L.
酶解温度(℃)
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分子的结合和催化,只有在特定的 pH 下,酶、底物和辅酶的解离状态,最适宜它们相互结
合,并发生催化作用,从而使酶反应速度达到最大值。pH 值对碎米荠多糖得率的影响结果
图 3 所示。根据分析可见,当提取液的 pH 由 2.0 升至 4.0 时,碎米荠粗多糖的提取率随着
pH 的增大而提高,在 pH>4.0 后碎米荠多糖的提取率随着 pH 的增大而下降。结果表明复
合酶在 pH4.0 条件下活性较好,因此将酶解最佳 pH 定为 4.0,此时碎米荠多糖的得率最高。
















2.2 响应曲面法试验设计及结果
2.2.1 碎米荠多糖提取率的二次多项回归方程
通过前述单因素优化实验发现:在酶解过程中当纤维素酶与果胶酶的复配比例为 2:1(添
加量 2.0%)、酶解的时间控制在 90min、温度控制在 60℃、pH 值调至 4.0 时,能够得到碎
米荠粗多糖的最大提取率。碎米荠提取的响应曲面优化实验设计方案和试验结果见表 1 和表
3。根据前述的设计方案,将酶解时间、酶解 pH 值和酶解温度作为研究的对象条件,以碎
米荠粗多糖提取率为响应值,共得到 17 个试验点,其中 12 个为析因点,1 个为中心点,中
心点试验进行了 5 次,用来估计误差。利用 Design Expert 7.5 软件对表 4 数据进行多元回归
拟合,得到碎米荠粗多糖提取率对以上因素的二次多项回归模型为:粗多糖得率(%)
2 3 4 5 6
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0









%)
pH值
图 3 酶解 pH 值对碎米荠多糖得率的影响
Fig. 3 Effect of pH on extraction yield of polysaccharide from Cardamine hirsuta L.
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Y=4.074+0.065A-0.414B+0.210AB-0.255AC-0.356BC-0.781A2-0.563B2-0.638C2,式中
A、B、C 分别代表酶解时间、温度和 pH 值。






2.2.2 回归模型的方差分析
对复合酶法辅助提取碎米荠粗多糖的回归数学模型进行方差分析,以检验方程的有效性
和各因子的偏回归系数,回归模型的方差分析如表 4 所示。通过统计学分析可以发现,该试
验选用的模型极显著(P<0.0001),方差的失拟项不显著(P=0.1365>0.05),说明模型的
选择是很合适的;另外,所选模型的 R2=0.997,证明该模型能解释 99.7%的结果值的变化规
律,仅有总变异 0.3%不能用该模型来解释,基本可用于复合酶辅助提取碎米荠粗多糖的分
析与预测。同时,表 5 结果还显示,在此试验设计中,A 显著(P<0.05),B,AB,AC,
BC,A2、B2,C2 都极显著(P<0.01),C 项不显著。



试验序号 碎米荠粗多糖得率(%) 试验序号 碎米荠粗多糖得率(%)
1 4.05 10 2.36
2 4.01 11 2.05
3 4.08 12 4.12
4 4.11 13 2.98
5 3.22 14 2.66
6 2.06 15 2.28
7 2.44 16 3.68
8 2.95 17 2.98
9 2.87
模型系数相 平方和 自由度 均方 F Prob >F
模型 8.61 9 0.96 234.67 <0.0001**
A 0.034 1 0.034 8.29 0.0237*
B 1.37 1 1.37 335.84 <0.0001**
C 1.125E-004 1 1.125E-004 0.028 0.8728
AB 0.18 1 0.18 43.26 0.0003**
AC 0.26 1 0.26 63.78 <0.0001**
表 3 复合酶提取碎米荠多糖的响应曲面试验结果
Table 3 Corresponding results of response surface analysis on polysaccharide extraction from
Cardamine hirsuta L.
表 4 二次多项式回归模型的方差分析
Table 4 Variance analysis of the regression model for the extraction yield of polysaccharide
from Cardamine hirsuta L.
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2.2.3 响应面交互作用分析与最佳提取条件的确定
碎米荠粗多糖得率对酶解的时间、酶解的温度和酶解时的 pH 值三因素回归模型的响应
曲面与等高线如图 5 所示。通过对以上三个曲面的分析可以预测和检验变量的响应值以及确
定变量之间的相互关系[25],响应曲面越陡,反映出各因素之间的两两交互作用越显著。同
样,等高线的形状也可反映出交互效应的强弱,椭圆形表示两因素交互作用显著,而圆形则
与之相反[26]。通过响应曲面 B-C 的陡峭程度分下发现,酶解时间对碎米荠粗多糖提取率的
影响最大,其次是酶解温度和浸提液的 pH 值,这与方差分析结果一致。
通过 Design Expert 7.5 软件分析,获得碎米荠粗多糖的最佳复合酶辅助提取条件:酶
解时间,91.8min,酶解温度,57.1℃,pH 值,4.17。在此条件下,碎米荠粗多糖的提取率
最高,粗多糖的得率预测值为 4.14%,在此条件下做验证实验(做三个平行实验),得到实
际粗多糖的平均提取率为 4.07%;与理论预测值相比,其相对误差约为 1.62%,说明模型可
以较好地反映出碎米荠粗多糖提取的条件。









BC 0.51 1 0.51 125.37 <0.0001**
A2 2.57 1 2.57 629.40 <0.0001**
B2 1.34 1 1.34 327.57 <0.0001**
C2 1.72 1 1.72 420.62 <0.0001**
残差 0.029 7 4.078 X10-3
失拟项 0.020 3 6.808X10-3 3.35 0.1365
纯误差 8.120X10-3 4 2.030 X10-3
总误差 8.64 16
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2.2.4 碎米荠多糖体外抗氧化活性分析
大多数从植物体内提取的多糖都具有抗氧化活性。在实验过程中,发现并验证了碎米荠
多糖也具有一定的抗氧化活性,并对其抗氧化活性与 VC 的抗氧化活性进行比较,结果如图
5 所示。从图 5 可看出,在设定的质量浓度范围内,随着碎米荠多糖质量浓度的升高,对
DPPH 的清除率也随之升高,在整个测定的质量浓度范围内,其 DPPH 自由基的清除率都是
大于 VC 的。


B:酶




图 4 各因素交互作用的响应面与等高线图
Fig. 4 Response surface and contour map of the pairwise interaction of various hydrolysis
conditions
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3 结 论
酶是一种速度快专一性强和反应条件温和的优点,在酶提取多糖中用的酶有果胶酶、淀
粉酶、半纤维素酶和纤维素酶等[21,22]。酶在提取植物多糖时能快速除去没有生物活性纤维素、
快速分解细胞壁和能除去淀粉杂质等,从而能大大提高提取率[23,24]。本文利用人工种植的碎
米荠为原料,研究其粗多糖的复合酶法提取工艺参数及其抗氧化活性。首先对提取条件的单
因素进行了优化,在单因素优化的基础上,进行了提取条件的响应面优化。单因素优化结果
显示:2%(质量浓度)的复合酶(纤维素酶:果胶酶=2:1)为最佳复合酶配方;最佳的碎米
荠酶解时间为 90min;最佳酶解温度为 60℃;最佳 pH 定为 4.0。响应面优化结果为:酶解
时间,91.8min,酶解温度,57.1℃,pH 值,4.17。在此条件下,碎米荠粗多糖的提取率最
高,粗多糖的得率预测值为 4.14%,在此条件下做验证实验(做三个平行实验),得到实际
粗多糖的平均得率为 4.07%;与理论预测值相比,其相对误差约为 1.62%。抗氧化活性实验
结果证明碎米荠多糖具有抗氧化活性,在一定的浓度范围内,其抗氧化活性强于 VC,与其
它植物多糖相比较,碎米荠多糖的抗氧化活性略强于阿克苏骏枣多糖[25],略差于松茸多糖
[26],这可能与多糖的提取纯度有关,下一步实验将对碎米荠多糖进一步纯化,然后进行后
续研究。实验结果为碎米荠多糖的提取以及多糖的性质研究与运用提供了一定的试验基础。


参考文献:
图 5 碎米荠多糖对 DPPH 自由基的清除率
Fig.5 DPPH free radical scavenging effect of polysaccharides from Cardamine hirsuta L.
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

质量浓度(mg/mL)



%
多糖
VC
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