全 文 ：收稿日期:2014 － 04 － 11;修回日期:2014 － 05 － 10
基金项目:福建省公益类项目(2010Ｒ1017 － 5)福建省自然科学基金项目(2012J05048)福建省农业科学院双百项目(2014sbmx)，2015 年度
福建省农业科学院“青年科技英才百人计划”项目(YC2015 － 10)。
* 通讯作者:陈 源(1981 －)，女，副研究员，研究方向:果树生理生化。E － mail:katecy@ 163. com。
响应面法优化酶解结合超声波
辅助技术提取金柑皮总黄酮
陈 源* ，余文权，杨道富，谢鸿根，余亚白，陈登云
(福建省农业科学院农业工程技术研究所，福建 福州 350003)
摘 要:采用酶 －超声波辅助法提取金柑果皮黄酮，在酶用量、乙醇体积分数、超声功率、液料比、超声时间的单因
素试验的基础上，采用响应面法优化金柑黄酮提取条件，得到金柑果皮黄酮提取的回归方程预测模型，确定最佳
提取工艺条件:酶用量酶 75 U /mL，乙醇体积分数 67%，超声功率 460 w，液料比 45 mL /g，超声时间 20 min，重复提
取 2 次。在此条件下，黄酮得率预测值为 2. 02%，经验证，实际得率为 1. 98%，与模型相符，说明拟合方程可靠。
采用酶 －超声提取法，黄酮得率高，时间短，为金柑果皮的开发利用提供理论参考。
关键词:金柑果皮;黄酮;响应面;酶 －超声提取
中图分类号:Q814. 9 文献标识码:A 文章编号:1008 － 0457(2015)01 － 0056 － 06
Optimization of Enzyme Assisted Ultrasonic Extraction of Flavonoid from Kumquat Peel by Ｒe-
sponse Surface Method
CHEN Yuan* ，YU Wen-quan，YANG Dao-fu，XIE Hong-gen，YU Ya-bai，CHEN Deng-yun(Institute of Agri-
cultural Engineering and Technology，Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fuzhou 350003，Fujian Prov-
ince，P． Ｒ． China)
Abstract:In order to optimize the extraction techniques of flavonoids which come from kumquat，five factors
(enzyme dosage，ethanol content，ultrasonic power，liquid to solid ratio，ultrasonic time)were investigated
in the single － factor experiments． The process conditions of extraction of flavonoid from kumquat were opti-
mized by response surface methoddogy． The mathematical regression model was established and the optimum
extraction conditions were also determined (enzyme dosage 75 U /ml，ethanol content，67% ultrasonic pow-
er，460w，uguid to solid ratio，45 ml /g，treat ment time:20num)． The theoretical yield for flavonoids was
2. 02% ． Furthermore，the actual yield was 1． 98%，which was in accordance with theoretical result． Tereby
the fitted nulltiple regression equation was credible． Enzyme assisted ultrasonic extraction not only produced
high yield of flavonoids，but also greatly shortened processing time，which provided a reference for developing
new processes of kumquat peel．
Key words:Kumquat peel;Flavonoids;Ｒesponse surface methodology;Enzyme;Ultrasonic extraction
金柑为芸香科金柑属植物，中医临床常用来治
疗咳嗽痰多，胸闷郁结，伤酒口渴，食滞胃呆，脘腹
满等症［1］。金柑果实中主要活性成分是黄酮类物
质，果皮中的黄酮类种类和含量均明显高于果肉。
金柑总黄酮具有抗氧化、调节血脂血糖、清除自由
基、提高免疫力、抗菌、促进胃肠吸收等生物
活性［2 － 6］。
超声波提是目前高效、经济的提取方法，可在
山 地农业生物学报 34(1):056 ～ 061，2015
Journal of Mountain Agriculture and Biology
短时间内充分提以植物组织内的黄酮［7］。同时，纤
维素酶能有效降解植物细胞壁，使植物细胞中的有
效成分迅速释放，促进其中的有效成份的提取［8］。
两者相结合可提高黄酮得率，已应用于枇杷花、山
楂、菊花、玉米须等活性物质的提取上，是一种高
效、快速、经济的提取方法［9 － 14］。本文采用纤维素
酶酶解与超声波技术相结合，以黄酮得率为指标，
在单因素试验基础上，采用响应面分析法对各因素
之间的单一和交互作用等进行分析，以此从响应面
上找到最佳控制点，优化酶结合超声波提取金柑提
取工艺参数，为金柑果皮总黄酮的开发利用提供技
术支持。
1 材料与方法
1. 1 材料、试剂与设备
金柑，由尤溪县兴农金柑专业合作社提供。
芦丁标准品(Sigma)，乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、
亚硝酸钠均为分析纯，酶(无锡酶制剂厂，1. 5 万
U /g)。
超声波清洗器:KQ － 600DB(昆山市禾创超声
仪器有限公司);752 型紫外分光光度计: (上海科
学精密仪器有限公司);电热鼓风干燥箱:BPG －
9140A(上海恒科技有限公司);高速万能粉碎机:
FW100(泰斯特仪器有限公司);电子天平:FA1104
型(上海天平仪器厂)。
1. 2 黄酮类化合物提取的工艺流程
金柑果皮→清洗→干燥→粉碎→称质量→酶
－超声波提取→离心→定容→黄酮含量测定→计
算得率。
1. 3 标准曲线的绘制
黄酮的含量按参考文献方法分析［22］。以芦丁
为标样配制标准溶液，测定标准溶液的吸光度，绘
制标准曲线，实验数据经线性回归得回归方程为:
A =0. 0016C － 0. 001，相关系数 Ｒ2 为 0. 9997。
1. 4 黄酮得率的测定
以芦丁作为标准，采用分光光度法测定总黄酮
含量。计算公式为:
A =0. 0016C － 0. 001 (1)
黄酮得率 /% =(A +0. 001 )× V /1. 6m (2)
式中:C为提取液的黄酮浓度(μg /mL);A 为
提取液测定时的吸光度;V 为提取液体积(mL);m
为试样的质量(g)。
1. 5 单因素试验
称取一定量的金柑果皮粉，研究酶用量、超声
功率、液料比、超声时间、乙醇体积分数对金柑皮黄
酮提取率的影响。
1. 6 响应面试验
在单因素试验的基础上，选取影响金柑黄酮得
率的因素:乙醇体积分数、功率、液料比、提取时间
为自变量，以黄酮得率为响应值，根据 Box －
Benhnken试验设计设计原理进行 4 因素 3 水平实
验设计。试验因素和水平见表 1。
表 1 响应面试验的因素和水平编码值
Tab． 1 Coded factors and levels in quadratic
regression rotational combinational design
水平
A
(乙醇体积分数 /%)
B
(功率 /W)
C
(液料比 /mL. g)
D
(时间 /min)
－1 60 300 40 20
0 70 400 50 30
1 80 500 60 40
1. 7 统计分析
采用 Excel 和 DesignExpert7. 0 软件对数据进
行分析。
2 结果与分析
2. 1 超声波提取的单因素试验
由单因素试验确定的酶 －超声波辅助提取金
柑皮黄酮工艺条件:乙醇体积分数 70%、超声波功
率 400 W、液料比 50 mL /g、提取时间 30 min。溶液
添加不同浓度的纤维素酶液，液料比 50 mL /g、乙
醇体积分数 70%的条件下提取 30 min，测定溶液中
总黄酮含量。结果表明从 45 U /mL到 75 U /mL，金
柑皮总黄酮提取率增大，当加酶量为 75 U /mL 时，
黄酮得率最高;另外还可看出，当加酶量大于 75U /
mL，随着加酶量的增加，样品浓度对酶达到饱和，
抑制酶的活性，使金柑皮总黄酮得率反而下降。
图 1 加酶量对黄酮的影响
Fig． 1 Effect of enzyme on extracting rate of total flavonoids
75第 1 期 陈 源，等:响应面法优化酶解结合超声波辅助技术提取金柑皮总黄酮
图 2 提取次数对黄酮的影响
Fig． 2 Effect of enzyme on extracting rate of total flavonoids
考虑溶剂成本和节约时间的同时，由单因素试
验确定的酶 －超声波辅助提取金柑皮黄酮工艺条
件:酶用量 75 U /mL，乙醇体积分数 70%、超声波功
率 400 W、液料比 50 mL /g、提取时间 30 min，提取
两次。
2. 2 响应曲面优化试验设计
2. 2. 1 响应面分析方案及试验结果 Design Ex-
pert 7. 0 软件进行数据拟合，试验方案及结果见
表 2。
2. 2. 2 模型的建立与显著性检验 根据单因素试
验已经得出的最佳范围，采用 Design Expert 7. 0 软
件对表 2 数据进行响应面优化，获得黄酮得率(Y)
对自变量乙醇体积分数(A)、功率(B)、液料比(C)
和提取时间(D)的回归模型:Y = 1. 73 + 0. 073A +
0. 037B － 0. 082C － 0. 16D － 0. 25AB + 0. 46AC +
0. 25AD －0. 055BC －0. 27BD + 0. 11CD － 0. 22A2 －
0. 38B2 － 0. 39C2 － 0. 081D2。该模型方程中各项系
数绝对值的大小直接反映各因素对项目指标黄酮
得率的影响程度，正、负值反映了影响的方向［15］。
由方程的一次项系数大小决定了各因素对黄酮得
率影响程度，依次为提取时间 ＞液料比 ＞乙醇体积
分数 ＞功率。由于该方程的二次项系数都是负值，
可以推断响应曲面开口向下，有极大值点。对该模
型进行方差分析，结果见表 3。
p水平是检验回归系数的标准，p ＞ 0. 05、p ＜
0. 05 和 p ＜ 0. 01 时，分别表示回归方程不显著、显
著和高度显著［16］。从整体分析，回归模型 F检验 p
值为0. 003 8(p ＜ 0. 01)，表明该模型高度显著;失
拟检验项 p 值(p ＞ 0. 05)不显著，表明回归模型与
实际情况拟合较好，可应用该模型进行检测和分
析。由表 3 可以看出，超声时间(D)对 Y(黄酮得
率)影响显著，而乙醇体积分数(A)、超声功率
(B)、液料比(C)影响不显著，二次项中 AC、B2、C2
对响应值的影响达到高度显著水平，A2、BD对响应
值的影响达到显著水平，由此可知乙醇体积分数和
液料比两因素的交互作用影响显著。
2. 2. 3 单因素交互作用及响应面优化 根据回归
方程绘出酶解结合超声提取金柑皮黄酮的响应面
及等高线图。响应面坡度平缓和陡峭程度反映出
各因素对黄酮得率影响的强弱趋势，坡度平缓，表
明其不影响得率大小，相反，如果坡度陡峭，表明各
因素改变可影响得率高低。等高线图反映各因素
之间交互作用的强弱，椭圆形表示交互作用显著，
而圆形表示因素之间交互作用不显著［17］。结果见
图 3 ～图 8。
由图 3 可知，提取时间和液料比不变时，超声
功率和乙醇体积分数的交互作用显著;黄酮得率随
乙醇体积分数的增大和超声功率的升高都呈先升
高后降低的趋势。这主要由于乙醇体积分数太高
时会产生较大的渗透压，金柑黄酮的溶解性降低，
因而得率也下降。
由图 4 可知，超声时间和超声功率不变时，液
料比和乙醇体积分数的交互作用显著;在乙醇体积
分数较低时，随着液料比增加得率随之降低;乙醇
体积分数较高时，随着液料比增加得率随之提高。
图 5 可知，超声时间和乙醇体积分数的交互作用显
著;乙醇体积分数低于 75%时，超声提取时间越长
提取，黄酮得率下降。这主要由于乙醇体积分数较
低时黄酮类物质溶解度较低时易将蛋白质、糖类等
易溶于水的物质提取出来，黄酮类物质溶出率低;
提取时间的增加则使水溶性物质溶出对黄酮产生
吸附作用，降低黄酮析出比率［18，19］。
由图 6 可知，液料比和超声功率的交互作用不
显著;在液料比较小和超声功率较低的情况下，黄
酮得率随液料比的增加和功率的提高显著提高;
当液料比超过 50 mL /g 时，得率略有降低;当功率
高于 400W时，得率则呈现降低的趋势。
由图 7、图 8 可知，超声时间和超声功率，液料
比和超声时间率的交互作用显著，在液料比较低
时，黄酮得率超声时间的延长而缓慢降低，液料比
较高时，随着超声时间的延长变化不大。主要是由
于液料比小时，溶剂少，超声时间长，升温快，黄酮
易氧化。
2. 2. 4 验证试验 由 Design Expert 7. 0. 0 软件分
析得出金柑黄酮的最优提取条件是:乙醇体积分数
66. 87%，超声功率 460. 15 W，液料比 45. 35 mL /g，
超声时间 20. 28 min。此条件下模型预测的得率为
85 山地农业生物学报 2015 年
2. 02%。考虑到实际操作的局限性，将理论值修正
为乙醇体积分数 67%，超声功率 460 W，液料比
45 mL /g，超声时间 20 min。在此条件下做验证试
验，所得得率为 1. 98 ± 0. 04%(N =3)，与理论值误
差 2. 02%，说明该模型能较好地预测实际提取率。
表 2 响应面分析方案和试验结果
Tab． 2 Ｒesponse surface analysis design and results
标准序 运行序
A:乙醇体
积分数
B:超声
功率
C:液料比 D:时间
黄酮
得率 /%
27 1 0 0 0 0 1. 87
12 2 1 0 0 1 1. 73
10 3 1 0 0 － 1 1. 26
22 4 0 1 0 － 1 1. 82
29 5 0 0 0 0 1. 89
1 6 － 1 － 1 0 0 0. 81
7 7 0 0 － 1 1 1. 04
16 8 0 1 1 0 0. 98
8 9 0 0 1 1 0. 77
19 10 － 1 0 1 0 0. 76
15 11 0 － 1 1 0 0. 72
13 12 0 － 1 － 1 0 0. 78
11 13 － 1 0 0 1 1. 03
14 14 0 1 － 1 0 1. 26
9 15 － 1 0 0 － 1 1. 59
23 16 0 － 1 0 1 1. 47
24 17 0 1 0 1 0. 88
28 18 0 0 0 0 1. 74
21 19 0 － 1 0 － 1 1. 33
6 20 0 0 1 － 1 1. 08
18 21 1 0 － 1 0 0. 75
26 22 0 0 0 0 1. 32
5 23 0 0 － 1 － 1 1. 80
25 24 0 0 0 0 1. 82
2 25 1 － 1 0 0 1. 39
20 26 1 0 1 0 1. 85
3 27 － 1 1 0 0 1. 20
4 28 1 1 0 0 0. 80
17 29 － 1 0 － 1 0 1. 51
表 3 回归模型系数检验
Tab． 3 Parameter test of regression model
变异来源 平方和 自由度 均方 F值 P值
A 0. 064 533 1 0. 064 533 1. 055 661 0. 321 6
B 0. 016 133 1 0. 016 133 0. 263 915 0. 615 5
C 0. 080 033 1 0. 080 033 1. 309 216 0. 271 7
D 0. 320 133 1 0. 320 133 5. 236 866 0. 038 2*
AB 0. 240 1 1 0. 240 1 3. 927 649 0. 067 5
AC 0. 855 625 1 0. 855 625 13. 996 65 0. 002 2＊＊
AD 0. 265 225 1 0. 265 225 4. 338 654 0. 056 1
BC 0. 012 1 1 0. 012 1 0. 197 937 0. 663 2
BD 0. 291 6 1 0. 291 6 4. 770 106 0. 046 5*
CD 0. 050 625 1 0. 050 625 0. 828 143 0. 378 2
A2 0. 317 045 1 0. 317 045 5. 186 353 0. 039 0*
B2 0. 917 44 1 0. 917 44 15. 007 84 0. 001 7＊＊
C2 1. 004 808 1 1. 004 808 16. 437 03 0. 001 2＊＊
D2 0. 042 645 1 0. 042 645 0. 697 611 0. 417 6
模型 3. 9 14 0. 28 4. 55 0. 003 8＊＊
残差 0. 855 83 14 0. 061 131
失拟检验 0. 634 35 10 0. 063 435 1. 145 656 0. 486 8
纯误差 0. 221 48 4 0. 055 37
总变异 4. 76 28
注:* 表示在 5%的显著性水平通过检验;＊＊ 表示在 1%的极其
显著性水平通过检验。
图 3 超声功率和乙醇体积分数对黄酮得率的交互影响
Fig． 3 Correlative effects of ultrasound power
and ethanol concentrations on the yield of flavonoids
95第 1 期 陈 源，等:响应面法优化酶解结合超声波辅助技术提取金柑皮总黄酮
图 4 液料比和乙醇体积分数对黄酮得率的交互影响
Fig． 4 Correlative effects of liquid to solid ratio
and ethanol concentrations on the yield of flavonoids
图 5 超声时间和乙醇体积分数对黄酮得率的交互影响
Fig． 5 Correlative effects of extraction time and
ethanol concentrations on the yield of total flavonoids
图 6 液料比和超声功率对黄酮得率的交互影响
Fig． 6 Correlative effects of ultrasound power
and liquid to solid ratio on the yield of total flavonoids
图 7 超声时间和功率对黄酮得率的交互影响
Fig． 7 Correlative effects of extraction time and
ultrasound power on the yield of total flavonoids
图 8 超声时间和液料比对黄酮得率的交互影响
Fig． 8 Correlative effects of extraction time and liquid to solid ratio on the yield of total flavonoids
06 山地农业生物学报 2015 年
3 结论与讨论
超声波、纤维素酶技术已应用于金柑黄酮提
取。其中纤维素酶提取金柑皮黄酮的最佳工艺参
数为 70%乙醇，酶用量 75 U /mL，液料比 35 mL /g，
温度 50℃，提取时间 100 min，黄酮得率达 1. 39%。
金柑超声波提取总黄酮得率为 1. 51%［20 － 22］。本
实验将超声波和纤维素酶的应用结合起来用于植
物活性成分的提取，能强化对柑橘皮细胞壁的破坏
而更好地促进胞内成分的释放、扩散和被提取，进
一步提高黄酮得率。金柑果皮酶辅助超声波提取
黄酮的最佳提取条件是:酶用量酶 75 U /mL，乙醇
体积分数 67%，超声功率 460 W，液料比 45 mL /g，
超声时间 20min，重复提取 2 次。模型预测结果显
示:黄酮得率为 2. 02%，经验证，实际得率为
1. 98%，与预测理论值相差 2. 02%。回归分析和
验证试验表明该响应面法合理性、可行。与单一的
超声波提取法和酶解提取法相比，超声波辅助酶解
法耗时更短，黄酮得率更高。
参 考 文 献:
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16第 1 期 陈 源，等:响应面法优化酶解结合超声波辅助技术提取金柑皮总黄酮