全 文 ：中　国　药　科　大　学　学　报
Journal of China Pharmaceutical University 　1999 ,30(3):212 ～ 215
白鲜皮水提物改善迟发型变态反应性肝损伤的作用机理
陆朝华　曹劲松　凡　华 　徐　强
(中国药科大学中药药理学教研室 , 南京 210038)
摘　要　白鲜皮水提物能作用于 2 , 4 , 6-三硝基氯苯所致迟发型变态反应的效应相 ,有效地改善迟发型变态
反应性肝损伤 ,在肝损伤 12 h 分离的肝非实质细胞和肝细胞共培养体系中 ,白鲜皮水提物预处理肝非实质细胞
明显地阻断了上清中谷丙转氨酶的释放 ,作用呈量效关系和时效关系 ,而预处理肝细胞则无影响。同样 , 白鲜皮
水提物对 Con A引起的脾淋巴细胞增殖无抑制活性 ,诱导相给药对肝损伤亦无保护作用。以上结果提示白鲜皮
水提物改善肝损伤的作用主要与选择性地抑制肝损伤时肝非实质细胞的功能有关。
关键词　白鲜皮;迟发型变态反应;肝损伤
　　肝细胞的破坏是许多肝炎发病的关键步骤 ,保
护肝细胞不受损害对于治疗十分重要。这种保护
包括经典的肝细胞膜保护[ 1]以及清除或减轻引起
肝毒性的因素 ,而后者似乎更为重要。
目前已知 , T 细胞介导的细胞免疫反应是许多
肝病中引起肝细胞损坏的主要原因之一 [ 2-4],我们的
前期研究已模拟这种细胞免疫机制建立了迟发型
变态反应诱导的肝损伤动物模型 ,证实其主要效应
细胞为CD4+ T 和 CD8+ T 细胞[ 5-7 ] ,并证实肝损
伤小鼠肝内浸润的 T 淋巴细胞具有杀伤肝细胞释
放谷丙转氨酶的能力而对正常肝细胞并无影响 ,这
种杀伤能力在肝损伤后 12 h达到高峰 ,但从正常
小鼠中分离的肝非实质细胞不具有这种能力[ 8 ] ,
表明肝损伤时非实质细胞中浸润的 T 淋巴细胞是
造成肝细胞损伤的主要因素之一。
为此 ,本文拟运用肝实质细胞与肝细胞相互作
用的实验体系 ,探索从影响非实质细胞的功能 、消
除造成肝细胞损伤的免疫因素角度 ,进行药物治疗
的可能性。鉴于前期研究已发现清热燥湿中药白
鲜皮水提物对迟发型变态反应性肝损伤有显著改
善作用[ 7 ] ,本研究进一步探讨了其改善肝损伤的
作用机理 。
1　材料与方法
1.1　药品及试剂
白鲜皮 Cortex Dictamni , CD 购自南京市药
材公司 ,经本校中药分析教研室余伯阳教授鉴定为
Dictamnus dasycarpus Turcz.。用 10 倍量蒸馏水
煎煮两次 ,过滤 ,每次1 h ,合并滤液 ,冷冻干燥得水
提物(CD ext)粉末 ,收率为 24 %,实验中所用的白
鲜皮剂量均以该粉末计算。 2 , 4 , 6-三硝基氯苯
(picryl chloride , PCl)(Tokyo Kassei Indust ry Co.
Ltd., Tokyo , Japan);胶原酶(collagenase , 182 u-
nits/mg)(Wako Pure Chemical Industries Ltd.,
Osaka , Japan);戊巴比妥钠(pentobarbital , Nembu-
tal , Abbo t Laboratories , Chicago , IL );EGTA
(ethy lene gly col-bis-(β-amino ethyl)-N ,N′-tetraetic
acid);HEPES (2-[ 4-(2-hydroxyethyl)-1-piper-
azinyl] ethanesulfonic acid)(Dojindo Chemical Inst.
Ltd., Kumamoto , Japan);血清谷丙转氨酶和谷草
转氨酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
无钙镁 Hank′s 液的配制:NaCl 8.175 g , KCl
0.403 g , Na2HPO4 0.114 g , 溶于 950 ml双蒸水 ,
加 HEPES 调 pH至 7.4 , 定容至 1000 ml。
Hank′s 液的配制:KCl 0.403 g , Na2HPO4
0.114 g , KH2PO4 0.054 g , NaHCO3 0.35 3 g , Ca-
Cl2 0.144 g , MgCl2 0.102 g , MgSO4 0.147 g , Na-
Cl 8.00 g , D-glucose 1.110 g , 0.02%Phenol red ,
溶于 950 ml 双蒸水中 , 加 HEPES调 pH 至 7.4 ,
定容至 1000 m l。
RPM I-1640(GIBCO)培养液:用双蒸水溶解 ,
加入 100 U/ml 青霉素和 100 U/ml 的链霉素 ,过
212
收稿日期　1999-03-08　国家自然科学基金资助项目 No.396622004
滤灭菌 ,临用前加入 10%灭活除菌的新生牛血清
(new born serum , NBS)即为 RPM I-1640-10%
NBS 液。
1.2　实验动物
4 ～ 6周龄(体重 18 ～ 22 g)的昆明种雌性小
鼠 ,由中国药科大学动物房提供。
1.3　2 ,4 ,6-三硝基氯苯(picryl chloride , PCl)致迟
发型变态反应(PCl-DTH)诱发小鼠肝损伤
取昆明种小鼠 , 刮去小鼠腹毛 ,涂 1%(w/v)
PCl的乙醇溶液 100 μl致敏 , 5 d 后再次同样致
敏 ,再 5 d后 ,用0.2 %PCl的橄榄油溶液 10μl肝
内注射 ,于注射后 18 h采血 ,血清用于测定谷丙转
氨酶及谷草转氨酶的活力 。或于注射后 12 h 按下
述方法分离肝实质细胞和非实质细胞。药物于诱
导相给药时 ,从 PCl首次致敏起 ,连续 10 d 。
1.4　肝实质细胞和非实质细胞的分离
采用修改的两步灌流法分离肝损伤 12 h 后小
鼠的肝实质细胞与非实质细胞。即给小鼠腹腔注
射戊巴比妥钠 40 mg/kg 麻醉 ,开腹 、肝门脉插管 ,
先用无钙镁 Hank′s 内含 0.5 mmol/L EGTA 、25
mmol/L HEPES , pH 7.4 灌流至肝脏中血被冲洗
干净 ,再换用 0.1 %的胶原酶液继续灌流几分钟 ,
然后摘出肝脏置冰冷的 RPMI-1640-10%NBS 液
中 ,分散肝细胞 ,100目筛网过滤 ,50 g 离心 2 min ,
得肝细胞(HC)。上清于 300 g 离心 5 min ,得肝非
实质细胞(NPC)。肝细胞 、肝非实质细胞经两次洗
涤后以台酚蓝染色 ,计数 ,存活率分别为 80 %和
90 %。通常在分离后立即用于培养。
1.5　细胞培养与转氨酶释放实验
采用肝损伤 12 h 时分离得到的细胞。肝细胞
经计数调成1.0×105 cells/ml ,在 96孔板上接种细
胞悬液 0.2 ml/well ,于 37℃、5%CO2下预培养 3
h ,弃上清 , 用 RPM I-1640 培养液洗两次后 ,加入
1.0×106 cells/ml的肝非实质细胞 0.1 ml或 0.1
ml RPM I-1640 培养液 ,共同培养 3 h 后 ,收集上
清 ,测定谷丙转氨酶的活性。药物处理时 ,在共同
培养前 ,用白鲜皮水提物与肝细胞或非实质细胞在
37 ℃培养 1 h , 洗去药液 ,再进行上述共培养 。
1.6　Con A致小鼠脾淋巴细胞转化试验
取正常小鼠无菌摘除脾脏 ,于 5 ml Hank′s液
中制备获得脾细胞悬液 , 1000 r/min 离心 5 min
后 ,用 0.17 mol/L Tris-0.75 %NH4Cl去除红细
胞 ,再用 RPM I-1640 培养液洗涤两次 ,调成 107
cells/ml 。取 106 cells/well置 96孔培养板中 ,在 5
μg/ml Con A 及不同浓度的白鲜皮水提物的共存
下于 37℃, 5 %CO2 ,培养 72 h 。然后加入 MTT
的培养基溶液 20μl , 37℃, 5 %CO2 ,再培养 4 h ,
吸去上清 ,每孔加入 0.2 ml DMSO ,振荡 ,使沉淀
完全溶解 , 540 nm 处测吸光度 。将加 Con A 时的
吸光度除以不加 Con A时的吸光度作为 Con A 对
脾细胞的刺激指数 。
1.7　统计
血清谷丙转氨酶及谷草转氨酶的水平以均值
x ±s表示 ,并进行 t-检验 。
2　结　果
2.1　白鲜皮水提物对迟发型变态反应性肝损伤小
鼠肝非实质细胞杀伤肝细胞的影响
与肝细胞的自动释放值相比 ,肝非实质细胞显
著增加了上清中谷丙转氨酶的水平。对于这种增
加 ,用 10-7 , 10-6 , 10-5 , 19-4 g/ml的白鲜皮水
提物预处理肝非实质细胞剂量依赖性地抑制了谷
丙转氨酶的释放 , 其抑制率分别为 34.5%, 54.
9%, 65.0%, 83.0%(图 1)。
Fig 1.Dose-dependen t inhibition by CD ext of the potent ial of NPC
to cause ALT release f rom HC in vi tro.HC and NPC are isolated
f rom the mice wi th PCl-DTH liver injury 12 h af ter.Drug t reat-
ment of NPC w as performed at 37℃ f or 60 min at various concen-
t rations before added onto HC for co-culture.Each column indicates
the mean(s of 3 experiments and each experiment includes tripli-
cate set s.
＊＊P<0.01 vs drug non-t reated group
同样 ,用 10-4 g/ml白鲜皮水提物预处理非实
2133 期 　 陆朝华等:白鲜皮水提物改善迟发型变态反应性肝损伤的作用机理 　
质细胞 15 , 30 , 60 和 120 min ,其抑制率分别为
29.6 %, 49.8 %, 70.0 %, 99.7 %(图 2)。
Fig 2.Time-dependent inhibition by CD ext of the potential of
NPC to cause ALT release from HC in vit ro.NPC was incubated
at 37 ℃w ith 1.0×10-4 g/ml of CD ext for 0 , 15 , 30 , 60 and
120 min before added on to HC.For other details , see the legend of
Fig.1
＊＊P<0.01 vs drug non-t reated group
2.2　白鲜皮水提物处理肝损伤小鼠肝细胞对非实
质细胞杀伤肝细胞的影响
预培养后的肝细胞经不同浓度的药物处理 1
h ,洗去药液后加入非实质细胞共培养 ,结果药物处
理并不影响非实质细胞所致上清中谷丙转氨酶的
释放(图 3)。
Fig 3.No protect ive activity of CD ext f rom the NPC-induced hep-
atocyte damage w hen used to t reat HC before the co-culture.For
other details , see the legend of Fig 1.
2.3　白鲜皮水提物于诱导相给药对迟发型变态反
应性肝损伤的影响
如表 1所示 ,与模型对照组相比 ,白鲜皮水提
物的两剂量组经口给药对肝损伤几无影响 ,而环磷
酰胺腹腔注射则使血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶
水平显著降低 。
Tab 1.Ef fects of CD ex t and Cy on PCl-DTH liver injury in mice w hen
given during the induction phase of liver injury.( x±s)
G roup
Dose
(mg/ kg)
No.of
mice
ALT
(Karmen uni t)
AST
(Karmen unit)
Normal - 8 17.1±3.9 86.8±10.3
Cont rol - 8 215±91.1 186±22.0
CD ex t 100 7 224±87.7 166±32.0
CD ex t 200 6 216±97.6 167±37.3
Cy 10 8 149±33.9＊＊ 120±10.7＊＊
Liver injury w as induced by PCl-DTH.CD ext was given po and Cy
was injected ip for 10 days from the first PCl sensitization.For the
other details , see the materials and methods.＊＊P<0.01 vs control.
2.4　白鲜皮水提物对 Con A 所致淋巴细胞增殖
的影响
Con A对脾细胞的刺激指数为 6.37 ,与其相
比 ,白鲜皮水提物各浓度对 Con A所致的淋巴细
胞转化均无抑制作用。
3　讨　论
我们的前期研究已发现白鲜皮水提物能选择
性的抑制 PCl所致接触性皮炎及绵羊红细胞所致
足跖反应的效应相 ,但对诱导相无影响 ,其对二甲
苯及鸡蛋清所致的炎症亦有显著抑制作用 ,并能抑
制体液免疫反应[ 9] ,进一步于效应相给药能显著
改善迟发型变态反应性肝损伤[ 7] 。本研究探讨了
白鲜皮水提物改善肝损伤的机理 。结果发现白鲜
皮水提物对肝损伤 12 h 肝非实质细胞的预处理能
显著抑制肝非实质细胞对肝细胞的杀伤作用 ,并具
有时效及量效依赖关系 ,提示其能通过影响肝损伤
时肝非实质细胞的功能来改善肝损伤 。但是 ,白鲜
皮水提物处理肝细胞并不影响肝非实质细胞的杀
伤作用 ,对四氯化碳所致的正常肝细胞毒作用亦无
改善作用(实验数据未给出),表明无肝细胞膜保护
作用 ,其对肝损伤的改善是从抑制免疫反应的角度
来实现的 ,后者主要体现在对已激活的免疫细胞功
能的抑制上而非影响其激活过程 ,对 Con A 所致
的脾淋巴细胞增殖无影响以及于诱导相给药对迟
发型变态反应性肝损伤无改善作用的结果证实了
这一推测 。我们的前报已证实 ,肝损伤 12 h 时肝
组织有大量炎性细胞浸润 ,肝非实质细胞的组成发
214　 　 中 国 药 科 大 学 学 报 　 　 30 卷
生了改变 ,进一步用 Percoll梯度离心法纯化后 ,证
实其具有杀伤肝细胞活性的组分中主要含有 51.2
%的 CD4+ T 细胞和 26.1 %的 CD8+ T 细胞 ,而
正常的肝非实质细胞并不具有这样的活性 ,这种杀
伤作用还与肝损伤时肝非实质细胞表面的淋巴细
胞功能相关抗原-1及肝细胞表面的细胞间粘附分
子-1的表达增加密切相关[ 8] 。因此 ,白鲜皮水提
物对肝损伤的改善作用主要系抑制肝损伤时肝非
实质细胞中浸润的 T 淋巴细胞的功能所致 ,而对
这些细胞的活化增殖过程则无影响 。
总之 ,白鲜皮水提物能明显改善细胞免疫性肝
损伤 ,其作用方式在现有抗肝炎药物中鲜有报道 ,
本研究对于开发新型肝病治疗药具有重要意义。
参 考 文 献
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234
Mechanisms for Improving the Liver Injury Induced by Delayed-type Hy-
persensitivity by the Aqueous Extract from Cortex Dictamni
Lu Zhaohua , Cao Jingsong , Fan Hua , Xu Qiang
Department of Pharmacology for Chinese Materia Medica , China Pharmaceutical University ,
Nanjing 210038
Abstract　The aqueous ex t ract f rom Cortext Ditamni(CD ext)improved the liver injury induced by delayed-
type hypersensitivity to picryl chloride (PCl-DTH)through affect ing the effecto r phase.By using the co-cul-
ture assay between nonparenchymal cells and hepatocy tes in v itro , we found that pret reatment of non-
parenchymal cells at 12 h af ter PCl challenge wi th CD ext could abrogate the hepatotoxity in a manner of time-
and dose-dependence.However , pretreatment of hepatocy tes did not show a protective activity f rom non-
parenchymal cells.Further examination showed that CD ex t had no effect on the lymphocyte t ransformation
induced by Con A.The administration of CD ext during the induction phase of DTH reaction also did not de-
crease the liver injury.These results suggest that CD ex t improve the liver injury through a selective dysfunc-
tion of nonparenchymal cells.
Key words　Cortex Dictamni;Aqueous ext ract;Delayed-type hypersensitivity;Liver injury
2153 期 　 陆朝华等:白鲜皮水提物改善迟发型变态反应性肝损伤的作用机理