全 文 ：第 21 期
第 51卷第 21期
2012年 11月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 51 No.21
Nov．，2012
收稿日期：2012－03－16
基金项目：湖北省研究与开发项目（2011BBB049）；湖北省农业科技创新中心资助项目（2007－620－001－03）；湖北省农科院果茶所青年科学基金
项目（GCJJ201203）
作者简介：何利刚（1982－），男，湖北罗田人，助理研究员，博士，主要从事果树生物技术育种和抗寒分子机理研究，（电话）027－87988653
（电子信箱）lghe44＠yahoo．com．cn；通讯作者，蒋迎春，研究员，（电话）027－87989513（电子信箱）jyc6512＠yahoo．com．cn。
桃叶橙原产于湖北省秭归县屈原镇龙马溪村
低山地，由于其春梢叶片呈披针形，狭长似桃叶，故
命名为桃叶橙。 自 20 世纪 60 年代开始，湖北省农
业科学院果树茶叶研究所就已开展了桃叶橙的相
关研究工作。 典型桃叶橙果实果形端正，果面橙红
光滑，脐部有印圈，果肉橙黄，皮薄子少，浓甜质脆，
汁多化渣，富玫瑰香气，具有甜、香、脆的独特风味，
鲜食品质极佳［1］。由于其品质的优越性，桃叶橙与脐
橙、夏橙并誉为“峡橙三秀”，曾是中国柑橘三大地
方良种之一。
20 世纪 80 年代， 桃叶橙是秭归县重点推广和
发展的柑橘良种，在秭归县境内各柑橘产区广泛栽
培。 然而，20 世纪 90 年代脐橙引种成功，导致桃叶
橙种植面积逐渐萎缩；同时，由于三峡库区蓄水工
程的顺利推进，原有桃叶橙优良单株和桃叶橙丰产
园均被淹没。 其次，原产地栽培品种混杂，管理措施
桃叶橙资源筛选评价及分子鉴定
何利刚 1，蒋迎春 1，吴黎明 1，许 淼 1，仝 铸 1，王志静 1，孙中海 1，吴述勇 2，崔旭东 3
（1．湖北省农业科学院果树茶叶研究所，武汉 430209；2． 湖北省秭归县特产中心，湖北 秭归 443600；
3．湖北省秭归县屈原镇青滩桃叶橙产销专业合作社，湖北 秭归 443604）
摘要：以湖北省地方特色柑橘桃叶橙为研究对象，开展了资源调查、搜集及评价工作。 从品质分析角度阐
述了当前桃叶橙已经成为一个品种群体，果实大小、种子数量和可溶性固形物含量等性状变化较大，影
响了桃叶橙的鲜食品质，不利于桃叶橙产业未来的发展。 通过测定并从中优选了 24 份单株资源，并针对
育种目标进行了资源分类，为桃叶橙选育工作奠定基础。 AFLP 分子鉴定从 DNA 水平充分证明了参试样
品发生了遗传物质的变异，同时也初步探明了各单株与桃叶橙 8 号、18 号和 139 号的遗传进化关系。
关键词：桃叶橙；资源；评价；鉴定
中图分类号：S666．4 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2012）21－4823-04
Diversity Assessment of Taoye Orange （Citrus sinensis （Linn．） Osbeck cv． Taoye
Cheng） Germplasm Resources and Molecular Characterization Using AFLP Markers
HE Li－gang1，JIANG Ying－chun1，WU Li－ming1，XU Miao1，TONG Zhu1，WANG Zhi－jing1，SUN Zhong－hai1，
WU Shu－yong2，CUI Xu－dong3
（1． Institute of Fruit and Tea， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430209，China；
2． Local Specialty Service Center in Zigui County， Yichang 443600，China；
3． Production and Marketing Professional Cooperatives for Taoyecheng Orange in Quyuan Town of Zigui County，Yichang 443604，Hubei，China）
Abstract： Taking taoye orange as the research object， evaluation analysis on fruit quality showed that the range of fruit size，
seed number and content of total soluble solid altered widely in Taoye orange， reduced the fresh food quality and contributed
negatively to the development of Taoye orange industry． In addition， 24 germplasm resources were selected as candidates and
classified into five classes for future selection according to breeding objectives． The results of AFLP analysis revealed the re-
lationship between individual and No． 8， No． 18， or No． 139， and suggested that a genetic variation had happened definitely
in selected germplasm resources．
Key words： Taoye orange； germplasm； diversity assessment； AFLP
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2012.21.070
湖 北 农 业 科 学 2012 年
表 1 AFLP 采用的接头及引物序列
标记
EcoR I 接头 1
EcoR I 接头 2
EcoR I 预扩增引物
E-AAC
E-AAG
E-ACA
E-ACT
E-ACC
E-ACG
E-AGC
E-AGG
序列
5′-CTC GTA GAC TGC GTA CC-3′
5′-AAT TGG TAC GCA GTC TAC-3′
5′-GAC TGC GTA CCA ATT CA-3′
5′-GAC TGC GTA CCA ATT CAA C-3′
5′-GAC TGC GTA CCA ATT CAA G-3′
5′-GAC TGC GTA CCA ATT CAC A-3′
5′-GAC TGC GTA CCA ATT CAC T-3′
5′-GAC TGC GTA CCA ATT CAC C-3′
5′-GAC TGC GTA CCA ATT CAC G-3′
5′-GAC TGC GTA CCA ATT CAG C-3′
5′-GAC TGC GTA CCA ATT CAG G-3′
标记
Mse I 接头 1
Mse I 接头 2
Mse I 预扩增引物
M-CAA
M-CAC
M-CAG
M-CAT
M-CTA
M-CTC
M-CTG
M-CTT
序列
5′-GAC GAT GAG TCC TGA G-3′
5′-TAC TCA GGA CTC AT-3′
5′-GAT GAG TCC TGA GTA AC-3′
5′-GAT GAG TCC TGA GTA ACA A-3′
5′-GAT GAG TCC TGA GTA ACA C-3′
5′-GAT GAG TCC TGA GTA ACA G-3′
5′-GAT GAG TCC TGA GTA ACA T-3′
5′-GAT GAG TCC TGA GTA ACT A-3′
5′-GAT GAG TCC TGA GTA ACT C-3′
5′-GAT GAG TCC TGA GTA ACT G-3′
5′-GAT GAG TCC TGA GTA ACT T-3′
相对落后， 影响了桃叶橙原有优良品质的发挥，导
致果实大小参差不齐，种子偏多，品质下降，严重阻
碍了桃叶橙商品化的生产［2，3］。 因此，桃叶橙在市场
竞争中处于劣势，受市场影响原产地农户也出现抛
弃桃叶橙改种脐橙的现象，一定程度上更加速了桃
叶橙种植面积的下滑和桃叶橙产业的衰落。 基于桃
叶橙产业的发展现状，拟通过对搜集到的桃叶橙群
体资源进行品质测定，并进行综合评价分析，以筛
选出果大、 少核或无核和高糖低酸的候选单株，辅
以 AFLP分子标记技术进行遗传变异鉴定， 从基因
水平进一步确定桃叶橙优变单株，从而充分发挥桃
叶橙特色资源优势和文化优势， 为桃叶橙提纯选
优、新品种选育及桃叶橙产业的发展奠定基础。
1 材料与方法
1．1 试验材料
2009 年和 2010 年连续两年在秭归县屈原镇广
泛开展桃叶橙资源调查，单株编号，并采集树体中
上部不同方位果实 15 个以上，待测。 针对 2009 年
和 2010 年入选复选的优良单株， 依据编号随机采
集树体外围无病虫危害的幼嫩叶片，液氮速冻后
－80 ℃保存用于 AFLP分子鉴定。
1．2 品质测定
称取 15 个以上果实，计算单果重；分别用直尺
一次性量取 15 个以上果实纵径和横径， 计算果形
指数；描述果实色泽（橙红、橙黄、黄）和香气有无；
一次性切取 5 个以上果实，描述风味（甜酸、适中、
酸甜）；测定 5 个果实赤道面皮厚，计算单果皮厚，
并统计种子数量； 采用糖度数显折射仪 DRB0－45
（购自上海测维光电技术有限公司） 测定果实可溶
性固形物含量；可滴定酸含量测定采用酚酞指示剂
法，VC含量测定采用 2，6－二氯靛酚滴定法［4］。
1．3 DNA的提取
桃叶橙叶片基因组 DNA 提取采用改良 CTAB
法 ［5］。 最后用 30～50 μL TE 缓冲液溶解沉淀，并于
0．8％琼脂糖凝胶电泳进行质量检测。
1．4 AFLP分析
AFLP 分析中所采用的引物及接头序列见表 1，
其中 E 和 M 分别表示 EcoRⅠ系列引物和 MseⅠ系
列引物，具体操作流程参考文献［6］。 酶切连接反应
体系为 25 μL，DNA底物为 200 ng，EcoRⅠ和 MseⅠ
各 2 μL， 接头 1 μL，10 mmol/L ATP 2．5 μL，T4 DNA
连接酶 1 μL，瞬时离心混合后 37 ℃温育 5 h，8 ℃继
续保温 4 h，4 ℃过夜。 预扩增采用 25 μL反应体系，
DNA 模板 2 μL， 预扩增引物 1 μL，dNTPs 0．5 μL，
Taq 聚合酶 0．5 μL，瞬时离心数秒，扩增参数：94 ℃
变性 30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 80 s，30 个循
环。 预扩增产物采用 TE稀释 20倍，取 2 μL作为选
择性扩增模板， 选择性扩增引物 1 μL，dNTPs 0．5
μL，Taq 聚合酶 0．5 μL，加入 ddH2O 至 25 μL，瞬时
离心数秒混匀， 第一轮扩增参数：94 ℃变性 30 s，
65 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 80 s， 以后每轮循环温度
递减 0．7 ℃，12 个循环 ； 第二轮参数 ：94 ℃变性
30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 80 s，23 个循环。 扩
增产物加入 10 μL Loading Buffer 混匀，95 ℃变性，
4％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
1．5 数据处理
品质测定结果导入 Excel 软件中，计算单果重、
果形指数、皮厚以及可滴定酸和 VC 含量，采用 SAS
9．2 软件对计算结果进行标准差和变异系数的统计
分析。 AFLP分析中获得的 DNA谱带进行数字化统
计，有带的位置计为 1，无带的位置计为 0，将统计
结果输入 Excel 表格中，利用 NTSYS pc 2．10e 数据
分析软件进行聚类分析。
2 结果与分析
2．1 桃叶橙资源评价
2009 年和 2010 年分别测定 29 份和 44 份桃叶
4824
第 21 期
注：表中“-”表示未测定。
表 4 2010 年秭归桃叶橙优良单株果实品质测定结果
单株编号
WSF-40
JBG-47
WSF-31
ZGJ-45
FLY-5
LW-58
LYJ-37
GX-50
DKB-66
DKB-65
DYL-39
CWX-41
DYL-02
JBG-48
DYL-63
WSF-34
0
纵径//cm
6.10
6.83
6.43
5.81
6.22
6.28
6.28
6.33
6.11
5.38
6.11
5.87
6.04
6.00
6.25
6.07
6.00
横径//cm
6.76
7.44
6.75
6.03
6.54
6.71
6.91
6.83
6.48
5.79
6.68
6.25
6.53
6.42
6.52
6.61
5.92
果形指数
0.90
0.92
0.95
0.96
0.95
0.94
0.91
0.93
0.94
0.93
0.91
0.94
0.92
0.93
0.96
0.92
1.01
单果重//g
154.5
205.4
155.0
114.0
145.0
155.0
163.5
158.2
140.5
100.0
150.0
126.8
138.5
133.7
142.0
142.7
114.0
皮厚//mm
4.7
4.5
4.5
4.1
3.7
4.4
2.8
4.1
4.0
4.0
3.6
3.3
4.9
3.7
3.9
3.3
2.7
色泽
橙红
橙黄
黄
橙黄
橙红
橙黄
橙红
橙黄
橙黄
橙黄
橙红
橙黄
橙黄
橙黄
橙红
橙黄
橙黄
风味
酸甜
酸甜
甜酸
酸甜
酸甜
酸甜
甜酸
酸甜
酸甜
酸甜
甜酸
酸甜
甜酸
酸甜
酸甜
酸甜
酸甜
香气
有
有
有
有
有
有
有
有
有
有
有
有
有
有
有
有
有
种子数//粒
0.7
1.3
1.3
1.7
1.7
1.7
2.7
3.0
3.0
3.0
3.0
3.3
3.7
4.3
5.3
5.7
7.3
可溶性固形物//%
12.3
13.2
12.5
12.4
12.1
12.4
12.3
12.3
12.1
11.9
12.5
11.5
12.7
12.9
13.6
13.5
11.3
可滴定酸//%
0.51
0.46
0.89
0.37
0.63
0.62
0.82
0.25
0.24
0.28
0.76
0.33
0.97
0.53
0.29
0.36
0.38
VC//（mg/100 mL）
45.9
52.8
64.4
47.4
53.3
49.8
48.2
45.7
44.6
45.8
54.9
41.4
61.1
50.1
54.2
63.3
47.8
橙单株果实样品。 室内测定结果发现，桃叶橙果实
色泽橙红，普遍具有香气，风味酸甜为主，汁多化
渣。 表 2 和表 3 统计分析结果表明，桃叶橙果实单
果重 89．00～205．40 g， 变异系数 2009、2010 年分别
为 14．56％、14．99％，性状表现参差不齐；种子数变化
大， 变化范围 0．70～15．70 粒， 变异系数 2009 年、
2010 年分别为 39．87％、53．47％，极不稳定，影响鲜
食品质； 可溶性固形物含量变化相对较小， 最低
11％，最高可达 14％，变异系数 2009、2010 年分别为
6．28％、4．67％；可滴定酸含量也有较大幅度变化，变
异系数 2010年达 40．36％；此外，果皮厚度变异也比
较严重。 根据大果、少核或无核和高糖等选育目标，
2009 年 7 份、2010 年 17 份入选复选（表 3、表 4），
并初步确定 WGH－01、DYL－63 和 WSF－40 作为重
点候选优株， 进入优良性状遗传稳定性观察阶段。
为储备桃叶橙特色育种资源，对入选优株进行资源
分类，结果见表 5。
2．2 AFLP聚类分析
对 2009～2010 年参选的桃叶橙资源中的 23 份
单株进行 AFLP 分子鉴定发现，64 对通用引物中引
物对 E－ACT ／M－CAA、E－ACT ／M－CTT、E－ACC ／M－
CAA、E－ACG ／M－CAA、E－AGC ／M－CAA 和 E－AGC ／
表 2 2009~2010 年桃叶橙性状变异范围与变异系数
性状
纵径//cm
横径//cm
果形指数
单果重//g
皮厚//cm
种子数//粒
可溶性固形物//%
可食率//%
可滴定酸//%
VC//（mg/100 mL）
年份
2009
2010
2009
2010
2009
2010
2009
2010
2009
2010
2009
2010
2009
2010
2009
2010
2009
2010
2009
2010
平均数
5.78
6.07
6.17
6.50
0.94
0.93
133.11
140.38
0.27
0.39
7.56
6.18
12.40
12.39
80.14
-
-
0.50
-
51.48
变幅
5.00~6.46
5.38~6.83
5.36~6.92
5.79~7.44
0.90~0.98
0.90~1.01
89.00~186.00
100~205.40
0.19~0.34
0.27~0.50
1.80~13.80
0.70~15.70
11.00~14.00
11.10~13.60
73.50~84.40
-
-
0.20~0.97
-
41.40~64.40
标准差
0.35
0.30
0.34
0.33
0.02
0.02
19.38
21.04
0.04
0.06
3.01
3.30
0.78
0.58
2.22
-
-
0.20
-
5.99
变异系数//%
6.00
4.95
5.51
5.10
2.27
2.16
14.56
14.99
13.22
15.26
39.87
53.47
6.28
4.67
2.77
-
-
40.36
-
11.64
表 3 2009 年秭归桃叶橙优良单株果实品质测定结果
单株编号
LML-01
WGH-02
CWX-01
FLY-11
WGH-01
WS-04
LML-02
纵径//cm
6.06
5.52
6.18
6.06
5.58
5.36
6.46
横径//cm
6.52
6.14
6.54
6.16
6.10
6.00
6.92
果形指数
0.93
0.90
0.94
0.98
0.91
0.89
0.93
单果重//g
158
127
155
137
132
127
186
皮厚//cm
0.31
0.26
0.32
0.27
0.22
0.22
0.23
色泽
橙红
橙红
橙红
橙红
橙红
橙红
橙红
风味
酸甜
酸甜
酸甜
酸甜
酸甜
酸甜
酸甜
香气
有
有
有
有
有
有
有
种子数//粒
1.8
2.2
5.0
5.6
5.8
6.2
7.4
可溶性固形物//%
12.0
12.2
12.0
12.2
12.5
12.2
11.8
可食率//%
80.4
81.1
80.0
81.1
83.4
82.7
84.4
内质
化渣
化渣
化渣
化渣
化渣
化渣
化渣
何利刚等：桃叶橙资源筛选评价及分子鉴定 4825
湖 北 农 业 科 学 2012 年
M－CAC能够将大部分样品区别开。 其中，以桃叶橙
杂交父本金水柑为外部对照，桃叶橙各单株（包括
杂交亲本及子代） 在相似系数为 0．28～0．67 水平上
聚类（图 1），3 株桃叶橙候选优株中 ，WSF－40 和
DYL－63 与 18 号较为临近，与 8 号相距较远，说明
WSF－40 和 DYL－63 可能为 18 号营养系后代 ；
WGH－01 为 139 号营养系后代， 与 18 号、8 号差别
均比较明显，聚类分析充分证明了这一观点。
表 5 2009~2010 年秭归桃叶橙优株资源分类
类型
大果型（单果重不小于 150 g）
无核型（种子数小于 5 粒）
少核型（种子数介于 5 粒和 10 粒之间）
高糖型（可溶性固形物含量大于 13％）
高桩型（果形指数大于 1）
单株编号
CWX-01、DYL-39、GX-50、LML-01、LML-02、LW-58、LYJ-37、JBG-47、WSF-31、WSF-40
CWX-41、DKB-65、DKB-66、DYL-02、DYL-39、FLY-5、GX-50、JBG-47、JBG-48、LML-01、
LW-58、LYJ-37、WGH-02、WSF-31、WSF-40、ZGJ-45
CWX-01、DYL-63、LML-02、WSF-34、0、FLY-11、WS-04、WGH-01
DYL-63、JBG-47、WSF-34
0
（责任编辑 王晓芳）
3 小结
以柑橘地方特色品种秭归桃叶橙作为研究对
象，旨在为重振桃叶橙产业奠定理论基础。 桃叶橙
在原产地具有深厚的群众基础和文化底蕴，在市场
经济飞速发展的今天， 充分挖掘和利用资源优势，
有利于桃叶橙产业的复苏和壮大。 拥有自主知识产
权的品种是市场竞争的核心，发展桃叶橙产业必须
具有性状优良的桃叶橙品种（系），针对这一目标，
开展了广泛的资源调查、搜集及评价工作，并且初
步确定桃叶橙品种（系）候选优株，然而由于桃叶橙
目前在原产地栽培环境复杂， 多为小范围种植，资
源搜集难度较大，群体的覆盖率难以保证；其次，大
多数单株资源仅采用一年的试验数据，其遗传稳定
性还有待连续的观察和研究。
AFLP 分子鉴定分析中， 虽然将大部分样品区
别开， 但是对于桃叶橙 8 号、18 号和 139 号的进化
关系仍不明确，根据记载，18 号来源于 8 号，聚类分
析图中可以说明这一点， 然而 139 号为 18 号的营
养系后代，聚类分析没有反映这一点，这可能与分
子鉴定过程中筛选的引物数量有关，由于仅采用了
6 对引物，无法覆盖全部基因组，不能客观反映基因
组序列中所有的差异位点，通过增加筛选引物组合
数量可以缓解。
参考文献：
［1］ 向长海． 秭归开展桃叶橙优良单株选育 ［J］． 中国果业信息，
2009，26（12）：44．
［2］ 孙林红，王耀群，吴述勇，等．桃叶橙丰产优质栽培技术措施［J］．
柑桔与亚热带果树信息，2001，17（2）：22－23．
［3］ 向长海，周志虎，戈 伟，等．一代名品“桃叶橙”的发展现状与振
兴对策［J］．现代园艺，2008（9）：49－51．
［4］ 李锡香． 新鲜果蔬的品质及其分析法［M］．北京：中国农业出版
社，1994．
［5］ 许 淼，蒋迎春，孙中海，等．鄂柑一号椪柑少核芽变的 AFLP 分
析［J］． 湖北农业科学，2011，50（17）：3556－3559．
［6］ 周延清． DNA 分子标记技术在植物研究中的应用［M］．北京：化
学工业出版社，2005．
图 1 桃叶橙资源聚类关系图
0.28 0.38 0.47 0.57 0.67
相似系数
WGH-69（T0）
ZGJ-45（T13）
WSZ-52（T16）
DYL-63（T23）
WSF-40（T28）
WSZ-51（T15）
LW-58（T21）
JBG-47（T32）
18 号（T18）
DYL-64（T24）
FLY-05（T25）
高糖单株（T11）
FLY-0（T139）
母本桃叶橙（Tm）
CWX-01（T1）
LML-01（T2）
LML-02（T4）
WS-04（T5）
FLY-11（T6）
8号（T8）
WGH-01（T10）
WGH-02（T3）
桃叶橙子代（Tf1）
父本金水柑（Tf）
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