全 文 ：遗　传 HEREDITAS(Beij ing) 28(3):268～ 272 , 2006 研究快报
收稿日期:2005 06 14;修回日期:2005 11 15
基金项目:国家自然科学基金(编号:30000117)资助 [ Supported by the Nat ional Natural Science Foundation of China (No. 30000117)]
作者简介:付春华(1974—),女 ,山东青岛人 ,博士 ,华中科技大学讲师 ,研究方向:植物生物技术与制药。 Tel:027 - 61303896;E-mail:fchcxp@
21cn. com
全国 7省本地早橘基因组间相关性的 AFLP分析
付春华1 , 陈方永2 , 邓秀新1
(1. 华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室 ,国家农作物分子育种中心 ,武汉 430070;
2. 浙江省农业科学院柑橘研究所 ,黄岩 318020)
摘　要:采用 AFLP分子标记对全国 7省的 12份本地早橘资源进行遗传多样性分析。使用了 28对选择性引物组
合 ,共扩增出 882个遗传位点 , 其中 192条(21. 8%)为多态性位点;以黄岩本地早橘为对照 , 各地的本地早橘的多
态性位点数不多(3. 5%～ 10. 54%), 且来源于浙江省外的本地早橘样品的 AFLP多态性位点数要多于浙江省内的 ,
说明区域生态差异对遗传多样性有着一定的影响。对 12个样品进行聚类分析结果表明 , 样品间的遗传距离最大
为 0. 229, 说明差异不大 ,引种后的变异率不高。这些结果有助于揭示其遗传变异与生态条件的关系 , 对柑橘品种
的遗传改良提供参考意见。
关键词:本地早橘;种质资源;遗传多样性;AFLP;聚类分析
中图分类号:S666　　　文献标识码:A　　　 文章编号:0253- 9772(2006)03 - 0268 -05
Gernetic Diversity of Citrus succosa Hort. Ex Tanaka from
Seven Provinces as Revealed by AFLP Analysis
FU Chun-Hua1 , CHEN Fang-Yong2 , DENGXiu-Xin1
(1. National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement , National Center of Crop
Molecular Breeding , Huazhong Agricultural University , Wuhan 430070 , China ;
2. Citrus Research Institute of Zhejiang Agricultural Academy , Huangyan 318020 , China)
Abstract:Using 28 selected primer combinations , 12 accessions of Bendizao tangerine from seven provinces were in-
vestigated by AFLP analysis. A total of 882 genetic sites were detected, among which 192 were polymorphic. Using
Huangyan Bendizao as contrast , the polymorphic sites of the other 11 accessions from seven provinces are not very
high (3. 5%～ 10. 54%), and the number of different sites between accessions from other provinces is higher than that
from Zhejiang province, which indicates that the ecological difference can partially contr ibute to the formation of the
genetic diversity. Genetic distance and dendrogram showed considerably close relatedness among the 12 accessions ,
and the max genetic distance was 0. 229. The genetic analysis of the 12 accessions from seven provinces can provide
useful information for the relationship between the formation of genetic variation and environmental difference and can
facilitate the genetic improvement of this cultivar.
Key words:Ci trus succosa hort. Ex Tanaka;germplasm resources;AFLP;genetic diversity;cluster analysis
　　黄岩本地早橘(Citrus succosa Hort. Ex Tana-
ka),又叫天台山蜜橘 ,主产浙江黄岩 、临海一带 ,种
植已有 100多年的历史 。该品种树势强健 ,树冠高
大;枝条细 ,分枝多而密;该品种在 11月上旬成熟 ,
果实扁圆 ,果皮浓橙黄色 ,汁多味甜 ,肉嫩化渣 ,含糖
量高 ,既宜鲜食 ,又适加工 ,是我国柑橘十大良种之
一。正因为如此 ,部分柑橘产区纷纷引种栽培 ,除浙
江外 ,江西 、福建 、陕西 、甘肃等省均有栽培 ,并且有
4个省育成了新的本地早橘品系。这些品系各有自
己的特点 ,福建龙岩本地早橘在果皮厚度 、化渣性 、
可食率方面优于同类品种 ,贵农本地早橘在果皮光滑
度 、匀整度 、抗寒性等方面超过同类 ,江西新余本地早
橘则在持续丰产性及固形物含量上有优势[ 1] 。对同
一品种在不同栽培区条件下的遗传多样性分析 ,有助
于揭示其遗传变异与生态条件及引种时间 、引种方式
的关系 ,对柑橘品种的遗传改良提供参考意见。
由 Vos等[ 2] 发明的 AFLP(amplified fragment
length polymorphism)分子标记技术可以在基因序
列未知的情况下 ,利用少数几对引物对相关物种基
因组多态性进行有效检测 ,因此在遗传和育种领域
有着广泛的应用前景[ 3] 。自 AFLP技术问世以来 ,
已广泛应用于品种的遗传多样性研究[ 4 , 5] 。本文利
用 AFLP-银染法对采自全国 7个省份的 12 份本地
早橘资源的多态性进行检测 ,以期对本地早橘品系
之间的衍化关系和优良品种的培育提供帮助 。
1　材料和方法
1. 1　实验材料
收集浙江(6份)、江西 、福建 、甘肃 、湖北 、陕西 、
贵州等 7省的本地早橘枝条共 12份 ,统一嫁接在华
中农业大学标本园内 ,砧木为枳壳 。
1. 2　实验方法
取嫁接萌发的嫩叶分离 DNA。DNA的提取参照
文献[ 6] ,CTAB法大量提取 。提取到的 DNA经岛津
分光光度计测定浓度 ,并调整到 20 ng/μL备用。
AFLP技术参照 Vos[ 2]的方法。具体技术路线 、
所用的 EcoRⅠ和 Mse Ⅰ接头 、引物序列等同前人
的报道[ 7] 。预扩增采用带有一个选择性碱基的引物
(EA00:E+A;MC00:M+C)进行。本实验中采用了
9个 EcoR Ⅰ引物(E01:E+AGC;E02:E+ACC;
E03:E+ACA;E04:E+ACT;E05:E+AGG;E06:E+
AGT;EA01:E+ATC;EA02:E+AGA;EA03:E+
ACG)和 9个Mse Ⅰ引物(MC01:M+CAG;MC02:M
+CCA;MC03:M+CTG;MC04:M+CGA;MC05:M
+CAA;MC06:M+CTC;MC10:M+CGT;CMC02:M
+CAC;CMC04:M+CTA),其中 E和 M 分别表示
EcoRⅠ和Mse Ⅰ引物的共同序列 , E表示的共同序
列为 5′-GTAGACTGCGTACCAATTCA-3′, M表示的
共同 序列为 5′-GACGATGAGTCCTGAGTAAC-3′。
选择性扩增产物热变性后在含有 6%的变性胶上电
泳 ,凝胶的银染程序参照 Promega的试剂盒说明书
进行 ,具体如下:电泳结束后 ,将两块玻璃板小心分
开 ,把凝胶放入 10%的乙醇中固定 ,直到二钾苯氢
指示剂的颜色褪掉 ,然后用双蒸水洗涤 3次 ,每次 2
min ,沥干水后转至染色液(2 g硝酸银 , 3 mL 37%甲
醛 ,溶于 2 L水中)中染色 35～ 40 min ,再用双蒸水
漂洗 5～ 6 s ,转到预冷至 4℃的 1 L 显影液中(60 g
碳酸钠 ,3 mL甲醛 ,400μL 10%硫代硫酸钠溶于2 L
双蒸水中),待电泳带隐现时 ,更换新的显影液直至
带清晰 ,加入 10%乙酸定影。将凝胶用双蒸水洗涤
后 ,自然干燥 。
1. 3　数据处理和分析
选清晰可辨的电泳带 ,以 1 和 0 记录多态性片
段的有无 ,以获得矩阵。数据在 NTSYS2. 0软件上
计算遗传距离 ,然后采用 UPGMA方法在相同软件
上进行聚类分析 ,获得聚类图。
2　结果与分析
2. 1　AFLP引物组合的扩增效率
本试验采用经筛选的Mse Ⅰ和 Eco RⅠ 的 64
对引物组合对来自 7 个省的 12 份材料进行 AFLP
分析 ,结果有 28 对引物产生了清晰可读的带。28
对引物共扩增出了 882个遗传位点 ,平均每个引物
产生 31. 5个遗传位点 ,其中 192个位点上显出多态
性 ,多态性带比率占 21. 8%;不同引物表现的多态
性比率相差很大 ,位于 3. 7%～ 34. 9%之间(表 1)。
根据所用的引物不同 , 12个样品表现出不同的谱
带 ,图 1显示的是引物对 E05/MC06的扩增结果 ,在
此电泳图上 , 3 ,4 , 11号 3个样品均检测出了多态性
带(箭头所示),说明 AFLP技术用于本地早橘遗传
多样性分析的可行性。
2. 2　样品 DNA的多样性
以黄岩本地早橘(2号样品 ,来源于浙江黄岩)
为对照 ,在 28对引物扩增出的 882个遗传位点上 ,
各地的本地早橘的多态性位点数不尽相同(3. 5%～
10. 54%)(表 2),淅江省内样品与黄岩本地早橘的
差异位点数多位于 30～ 53个之间(3. 5%～ 6. 1%),
而来自外省的样品与黄岩本地早橘的差异位点数多
在 60个以上(6. 8%～ 10. 54%),均高于浙江省内的
样品 ,其中差异位点数最多的是来自湖北武汉的华
269　3期　　　　　　　　　　　　付春华等:全国各地本地早橘基因组间相关性的 AFLP分析
表 1　用于 AFLP扩增的 28个选择性引物及扩增结果
Table 1　Primer combinations and their amplified
bands used for AFLP analysis
引物
Primers
扩增带数
Numbers of
scored band
多态性带
Polymorphic
bands
多态性带百分数(%)
Percentage of
polymorphic
bands(%)
EA02/MC02 44 7 15. 9
EA02/MC03 44 8 18. 2
EA02/MC04 40 8 20
EA02/MC11 44 7 15. 9
E02/MC10 42 12 28. 6
E02/MC01 38 12 31. 6
E01/MC03 23 6 26. 1
E01/MC01 26 8 30. 8
E03/MC04 38 6 15. 8
E03/MC03 28 5 17. 9
E05/MC02 45 10 22. 2
E05/MC03 35 10 28. 6
E05/MC04 42 11 26. 2
E05/MC05 51 5 9. 8
引物
Primers
扩增带数
Numbers of
scored band
多态性带
Polymorphic
bands
多态性带百分数(%)
Percentage of
polymorphic
bands(%)
E04/MC04 38 6 15. 8
E02/MC11 43 7 16. 3
E02/MC02 57 12 21. 1
EA02/MC06 11 1 9. 1
E01/CMC02 43 15 34. 9
EA01/MC06 25 4 16
EA01/MC11 33 7 21. 2
EA02/MC10 13 2 15. 4
EA03/MC03 27 6 22. 2
EA03/CMC04 27 1 3. 7
E06/MC11 35 7 20
E05/MC06 35 12 34. 3
E05/MC01 27 5 18. 5
E06/MC06 18 2 11. 1
图 1　12个样品的 AFLP指纹图谱
(E05 /MC06, 箭头示多态性位点)
1～ 12:代表来自全国各地的不同样品。1:黄岩少核本早地
(种子数<3);2:黄岩本地早(种子数>3);3:黄岩本地早
(种子数<3);4:黄岩少核本早地(种子数>3);5 , 6:嫁接在
不同砧木上的黄岩本地早;7:来自贵州;8:来自浙江建德;
9:来自江西新余;10:来自陕西汉中;11:来自湖北武汉;
12:来自甘肃武都。
Fig. 1　The AFLP fingerprinting of 12
accessions from different places
(E05 /MC06 , arrowhead showed the polymorphic sites)
1～ 12:Reperant the accessions from seven provinces. 1～ 6
are from Zhejiang province;7 is f rom Guizhou;8 is from Jiande
Zhejiang province;9 is from Xinyu Jiangxi province;10 is from
Hanzhong Shanxi province;11 is fromWuhan Hubei province;
12 is fromWudu Gansu province.
农本地早橘 ,其次是来自甘肃武都的样品 ,来自江西
新余的样品与黄岩本地早橘差异位点与陕西汉中的
样品相同 。这说明区域生态差异对遗传多样性有着
一定的影响。
表 2　各品系与黄岩本地早橘的 AFLP差异位点数
Table 2　The different sites between other accessions
and Huangyan Bendizao based on AFLP information
样品
Accessions
差异位点数
Different sites
样品
Accessions
差异位点数
Different sites
2 0 7 60
1 31 8 45
3 51 9 67
4 38 10 65
5 53 11 93
6 32 12 80
　　注:1～ 12代表来自全国各地的不同样品。 1:黄岩少核本早地
橘(种子数<3);2:黄岩本地早橘(种子数>3);3:黄岩本地早橘
(种子数<3);4:黄岩少核本早地橘(种子数>3):5～ 6嫁接在不同
砧木上的黄岩本地早橘;7:来自贵州;8:来自浙江建德;9:来自江西
新余;10:来自陕西汉中;11:来自湖北武汉;12:来自甘肃武都。
Note:1～ 12 reperant the accessions from seven provinces. 1～ 6
are from Zhejiang province;7 is from Guizhou;8 is from Jiande Zhe-
jiang prov ince;9 is f rom Xinyu Jiangxi province;10 is fromHanzhong
Shanxi province;11 is from Wuhan Hubei province;12 is from Wudu
Gansu province.
2. 3　聚类分析
来自全国 7个省份的 12个样品 ,其相互间的遗
传距离为 0. 034～ 0. 229 ,说明他们之间的差异不是
很大 。采自浙江省的 7 个样品(表 3),相互间的遗
传距离均比较小 ,位于 0. 030～ 0. 140之间且大多位
270 遗　传 HERED ITAS (Bei jing)2006　　　　　　　　　　　　　　　　28卷　
于 0. 1以下 ,表明虽然淅江各地的本地早橘品质有
所差异 ,但 DNA水平上的变异并不大。遗传距离最
大的组合是 3号(浙江少核本地早橘)与 11号样(华
农本地早橘),为 0. 229;来自湖北武汉与甘肃武都
的样品与其他 10个样品的遗传距离均比较大 ,说明
这两地的本地早橘变异最大 ,而此两者之间的遗传
距离最小 ,为 0. 054。
表 3　不同样品间 AFLP标记的遗传距离
Table 3　The pairwise genet ic distances between the accessions of Cit rus
succosa Hort. f rom different geographical regions based on AFLP information
样品号
Accessions
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 0
2 0. 077 0
3 0. 099 0. 099 0
4 0. 036 0. 093 0. 087 0
5 0. 099 0. 099 0. 113 0. 091 0
6 0. 129 0. 066 0. 140 0. 129 0. 075 0
7 0. 103 0. 111 0. 125 0. 115 0. 058 0. 087 0
8 0. 085 0. 089 0. 115 0. 093 0. 030 0. 066 0. 034 0
9 0. 103 0. 127 0. 159 0. 110 0. 093 0. 111 0. 093 0. 075 0
10 0. 136 0. 127 0. 159 0. 148 0. 085 0. 123 0. 109 0. 072 0. 097 0
11 0. 155 0. 195 0. 229 0. 146 0. 144 0. 181 0. 166 0. 134 0. 144 0. 161 0
12 0. 168 0. 155 0. 188 0. 163 0. 111 0. 146 0. 132 0. 105 0. 136 0. 107 0. 054 0
　　注:1～ 12代表来自全国各地的不同样品 ,具体见表 2注。
Note:1～ 12 represent the accessions from seven provinces, detailed informat ion see Table 2.
　　以遗传距离为基础 ,经聚类分析显示(图 2),样
品的亲缘关系有一定程度的地域趋势 。如以 0. 10
为阈值 ,所有样品可聚为 3类 ,来自浙江的 3个少核
植株聚在一起 ,来自湖北武汉和甘肃武都的两个样
品聚为一类 ,其余 7个样品聚为一类 ,包括浙江的 4
个多籽样品及新余 、贵阳 、汉中产地的 3个样品。
图 2　本地早橘不同分布区的 AFLP标记聚类图
1～ 12代表来自全国各地的不同样品 ,具体见表 2注。
Fig. 2　The UPGMA dendrogram showing genetic
relationship between the accessions of Cit rus
succosa Hort f rom different regions based on
AFLP information
1～ 12 represent the accessions from seven provinces,
detailed informat ion see Table 2.
3　讨　论
物种的遗传多样性是大自然最珍贵的自然资
源 ,是人类赖以生存的基础。一个物种的进化潜力
和抵御逆境的能力取决于种内遗传变异的大小 ,遗
传多样性越丰富 ,对环境变化的适应能力越强 ,其自
然分布范围越广[ 8] ,前人对物种的遗传多样性分析
多集中于对不同生境条件下 、不同居群或同一居群
下的植物种类的遗传多样性进行分析[ 9～ 11] 。由于
环境的改变而引起的表型上的相应变化 ,称为表型
可塑性(phenotypic plast icity),又称为环境饰变(en-
vironmental modification),是同一基因型由于环境
条件的改变在表型上做出相应变化(响应)的能
力[ 12] 。一方面 ,环境饰变是生物变异的来源之一 ,
是生物适应环境的一种方式[ 13] ;另一方面 ,尽管环
境饰变是一种非遗传变异 ,但环境饰变幅度和式样
却受遗传控制 ,而且环境所引起的饰变常与遗传所
造成的变异相混淆[ 14] 。表型可塑性的表现形式 、机
理 ,可塑性的适应意义以及可塑性与遗传变异性之间
的关系都是目前物种生物学或进化生物学关注和争
论的热点[ 15] ,有许多假说和理论[ 12] ,是未来进化生物
271　3期　　　　　　　　　　　　付春华等:全国各地本地早橘基因组间相关性的 AFLP分析
学所要解决的重要课题。因此 ,对同一品种在不同栽
培区条件下的遗传多样性分析 ,有助于揭示其遗传变
异与生态条件的关系 ,可为品种的遗传改良提供参考
意见。本研究中所采用的 12个来自全国 7省的本地
早橘样品均来源于黄岩本地早橘 ,分别在不同的年
代 、采用不同的外植体引种驯化成为当地的栽培品
种。据文献报道[ 1] ,这些品种经人工芽变选种 、杂交
育种过程 ,其生物学性状均发生了改变 ,如浙江省柑
橘研究所经芽变选种获得了系列少核 、无核本地早橘
新品系 ,福建龙岩本地早橘在果皮厚度 、化渣性和可
食率方面优于同类品种;贵农本地早橘在果皮光滑
度 、果实整齐度上超过同类;新余本地早橘则在丰产
性及可溶性固形物含量上优于原品种 。
以上分析可以看出 ,不同区域间的引种选种 ,通
过自然选择和人工选择的双重作用 ,在一定程度上
会丰富某一优良品种的遗传多样性 ,如本研究中的
湖北武汉的华农本地早橘 ,在抗寒性方面优于浙江
的本地早橘。但从另一个方面说 ,栽培植物由于人
工选育驯化 ,遗传变异和近亲繁殖等因素 ,老的品系
及育系被淘汰 ,造成遗传多样性流失 ,遗传单一 ,造
成栽培植物群体在遗传多样性水平上远远低于野生
群体 ,出现遗传多样性“瓶颈” [ 16] ,因此 ,应注意对现
有地方本地早橘品系的收集与保护 。
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