全 文 ：收稿日期:2008-08-28;　修订日期:2008-12-30
基金项目:国家 “十五 ”科技攻关专题(No.2001BA535C-8)
作者简介:黎继烈(1959-),女(汉族),湖南华容人 ,现任中南林业科技大
学生命科学与技术学院教授 ,博士学位,主要从事农产品生物加工方面的
工作.
金橘黄酮对小鼠免疫功能的影响
黎继烈 , 王　卫 , 刘忠敏 , 李忠海
(中南林业科技大学生命科学与技术学院 ,湖南 长沙　410004)
摘要:目的 探讨金橘黄酮的免疫功能。方法 环磷酰胺诱导小鼠免疫功能低下 ,予金橘黄酮 ,观察小鼠碳粒廓清指数 K、
吞噬指数 a、胸腺和脾脏指数 、耳肿胀度 、血清溶血值(HC50)等指标的变化。结果 与模型对照组相比 ,金橘黄酮 80mg/kg
· bw剂量时 , 小鼠碳粒廓清指数 K、吞噬指数 a、胸腺和脾脏指数 、耳肿胀度有显著提高(P< 0.05), 血清溶血值(HC50)
有极显著提高(P<0.01);金橘黄酮 160mg/kg· bw剂量对全部试验参数的影响具有极显著性(P<0.01)。结论 金橘黄
酮对于免疫低下型小鼠的免疫功能具有一定的恢复作用。
关键词:金橘;　黄酮;　免疫功能
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2009)07-1599-02
EffectofFortunellacrassifoliaFlavonoidonImmuneFunctionofMice
LIJi-lie, WANGWei, LIUZhong-min, LIZhong-hai
(ColegeofLifeScienceandTechnology, CentralSouthUniversityofForestry＆Technology, Changsha, Hu-
nan, 410004, China)
Abstract:ObjectiveToexploretheeffectsofFortunelacrassifoliaflavonoidsonimmunefunctionofimmunodepressedmice.MethodsTheimmunosuppressedmicewereinducedbycyclophosphamide(CY)andFortunelacrassifoliaflavonoidwastakeno-
raly.TheimmunodulatoryefectsweremeasuredbyclearancerateKofcharcoalparticles, phagocyticindexa, thymusandspleen
index, earswellingdegree, HC50 valueandsoon.ResultsComparedwithmodelgroup, theclearancerateKofcharcoalparti-cles, phagocyticindexa, thymusandspleenindexandearswelingdegreeof80mg/kg· bwFortunelacrassifoliaflavonoiddose
groupweresignificantlyimproved(P<0.05), andaverysignificanteffect(P<0.01)wasmadetotheHC50 valueatthisdose.Whilethedosewasincreasedto160mg/kg· bw, aloftheexperimentalparametersshowedextremelysignificantimprovements
(P<0.01).ConclusionFortunelamrassifoliaflavonoidcanpartlyrejuvenatetheimmunereactivityoftheimmunosuppressed
mice.
Keywords:Fortunelacargarita;　Flavonoids;　Immunefunction
　　金橘 , 系芸香科(rutacea)金橘属(Rutaceae)常绿小乔木的果
实 , 又称夏橘 、寿星柑。分为金弹 、圆实金橘等 6个品种。金橘果
实富含挥发油 、黄酮等生物活性物质 [ 1] , 目前果实除鲜食外还用
于果脯 、饮料等产品的加工原料 [ 2] , 但总体上对于金橘的研究与
开发仍集中在单纯的加工方面 。近年来 ,我们从深度开发金橘资
源角度出发 , 对其活性物质的提取及其药用保健功能进行了一些
研究 [ 3～ 6] ,本文则在此基础上进一步深入探讨金橘黄酮对免疫低
下小鼠免疫功能的影响 ,提高人们对金橘深度开发的认识。
1　材料
1.1　药物及试剂 实验药物 [ 4]:金橘采自江西遂川 , 品种为金弹
FortunelacrassifoliaSwingle。取新鲜金橘皮 ,真空冷冻干燥 ,将干
燥后的金橘皮粉碎过 40目筛 ,用石油醚脱脂回流 2 h,脱脂后按
金橘粉∶酒精(80%)=1∶20(W/W)物料比 ,用 MDS-6压力自
控密闭微波萃取系统 60℃萃取 30 min, 过滤 ,滤液用大孔树脂吸
附 , 洗脱液经真空浓缩即为金橘黄酮提取物 , 测定总黄酮含量为
33.82%, 使用时配制成所需浓度;环磷酰胺(Cyclophosphamide,
CTX),上海华联制药有限公司;碳酸氢钠 、二硝基氟苯(2, 4-Di-
nitrofluorobenzene, DNFB)均为化学纯 , 大连伊利特有限公司;印
度墨汁 , 北京笃信精细制剂厂。
1.2　动物 单一性别昆明种小鼠 , 7 ～ 8周龄 , 体重 18 ～ 22 g, 湖
南中医药大学实验动物中心购买 ,医动字 20-001号 。
2　方法
2.1　动物分组 、造模及喂养方法 健康小鼠适应环境 7d,随机分
为空白对照组 ,模型对照组(Cy)和实验组(金橘黄酮高剂量组 、
中剂量组和低剂量组),每组 10只。模型对照组和实验组腹腔注
射环磷酰胺(Cy, 80 mg/kg· bw), 连续 7 d, 造成 Cy所致小鼠免
疫功能低下模型 [ 7] , 空白对照组注射相同体积的生理盐水。 小
鼠免疫功能低下模型建立后 ,实验组按不同剂量灌胃金橘黄酮溶
液 , 对照组灌胃等体积的蒸馏水 , 灌胃量为 0.1 ml/10 g· bw, 连
续灌胃 28d后 , 进行免疫指标测定。
2.2　小鼠碳廓清指数 K和吞噬指数测定 [ 7] 在末次灌胃金橘黄
酮溶液 30 min后 , 经小鼠尾静脉注射印度墨汁 0.05 ml/10 g·
bw, 然后在不同时间(1 min, 5 min)内 , 从眼框取静脉血 20 μl, 溶
于 2 ml0.1% Na2CO3溶液中 ,在 680 nm下比色 , 测定吸光度 , 最
后将小鼠颈椎脱臼处死 ,分别称取肝脏 、脾脏重。
廓清指数 K=lgA1 -lgA2t2 -t1
式中:A1 , A2———在时间为 t1 , t2时所取血样的吸光度　　 t
1
-t
2
———取两血样的时间差
吞噬指数a= 3k×体重肝脏重+脾脏重
2.3　小鼠胸腺和脾脏指数测定 [ 7] 小鼠连续灌胃 28 d后 , 颈椎
脱臼处死 ,剥取胸腺和脾脏 , 用电子天平称重 ,以胸腺与脾脏的重
量指数(mg/10g· bw)表示。
2.4　DNFB诱导小鼠迟发型超敏反应(DTH)的测定 [ 8] 小鼠连
续灌胃 28d后 ,腹部去毛 , 用 1%DNFB均匀涂抺 , 末次给金橘黄
酮溶液 30min后 , 将 1% DNFB均匀涂抺于小鼠右耳进行攻击 ,
24 h后 ,颈椎脱臼处死 , 用打孔器取直径 8 mm的耳片 , 称重 , 计
算肿胀率。
肿胀率(%)=(右耳重–左耳重)/左耳重 ×100%
2.5　小鼠血清溶血值(HC50)的测定 [ 9] 小鼠连续灌胃第 24天
后 , 每只小鼠腹腔注射 2%鸡红细胞(SRBS)0.2 ml进行免疫 , 免
·1599·
LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2009VOL.20NO.7 时珍国医国药 2009年第 20卷第 7期
疫后继续灌胃 4 d,然后眼球取血离心分离血清。用生理盐水稀
释血清至 500倍 , 取 1ml稀释后的血清置试管内 , 依次加入 10%
(V/V)SRBS0.5 ml,补体 1 ml(用生理盐水按 1∶10稀释),与不
加血清的生理盐水试管作对照 , 于 37℃保温 30 min, 0℃终止反
应。离心后取上清液于 540nm测吸光度值(OD),另设不加血清
的空白对照 , 计算样品的半数溶血值。
溶血值 HC50 =(样品的吸光度值 / SRBC半数溶血时的吸光度值)
×稀释倍数
2.6　数据处理方法 实验数据以 x±s表示 , 正态分布的两组的
均数比较用 t检验 ,统计分析采用 SPSS13.0软件处理 , 显著性界
值 P=0.05。
3　结果
3.1　对小鼠碳廓清的影响 单核巨噬细胞是非特异性免疫的重
要组成细胞之一 , 可迅速吞噬和清除进入机体的细菌 、异物等抗
原性物质 , 巨噬细胞廓清指数 K的多少可以反映其吞噬功能 a的
强弱。另外 , 单核巨噬细胞所分泌的多种细胞因子对非特异性免
疫和特异性免疫又具有调节作用 ,可通过抗原呈递功能间接的启
动机体的特异性免疫应答 [ 10] 。因此 , 根据碳廓清指数 K和吞噬
指数 a反映出的单核巨噬细胞吞噬能力的大小 ,可以反映机体的
免疫能力的强弱。
如表 1所示 , 实验各组小鼠的廓清指数 K和吞噬指数 a均有
提高 , 与模型对照组相比 ,金橘黄酮高剂量组的廓清指数 K提高
41.42%(P<0.01), 吞噬指数a提高 43.58%(P<0.01),金橘黄
酮中剂量组廓清指数 K提高 26.92%(P<0.05), 吞噬指数 a提
高 27.61%(P<0.05), 说明金橘黄酮高 、中剂量能显著提高免疫
低下型小鼠单核巨噬细胞吞噬功能 ,具有明显改善小鼠的非特异
性免疫功能。
表 1　金橘黄酮对小鼠碳廓清的影响( x±s)
分组 剂量C/mg· (kg· bw)-1 廓清指数 K 吞噬指数 a
空白对照 - 0.055 5±0.007 9 6.417 6±0.530 3
模型对照 - 0.033 8±0.004 3■■ 5.093 9±0.300 5■
金橘黄酮(高) 160 0.047 8±0.009 1＊＊ 7.302 5±0.115 7＊＊
金橘黄酮(中) 80 0.042 9±0.009 9＊ 6.302±0.207 2＊
金橘黄酮(低) 20 0.039 0±0.013 5 5.519 1±0.276 0
　　与空白对照组比较 , ■P< 0.05, ■■ P< 0.01;与模型对照组比较 ,
＊P<0.05, ＊＊P<0.01;n=10
3.2　对小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响 胸腺和脾脏为体内主
要的免疫器官 , 胸腺指数和脾脏指数大小的改变提示机体对免疫
调节作用的强弱变化。实验结果如表 2所示 , 各给药组小鼠胸腺
指数和脾脏指数都有不同程度的提高。与模型对照组相比 ,金橘
黄酮高剂量组的胸腺指数提高 34.3%(P< 0.01), 脾脏指数提
高 25.8%(P<0.01), 金橘黄酮中剂量组胸腺指数提高 27.3%
(P<0.05), 脾脏指数提高 17.3%(P< 0.05), 金橘黄酮高剂量
给药组效果极为显著 ,提示金橘黄酮对免疫低下型小鼠免疫的调
节有增强作用。
表 2　金橘黄酮对小鼠胸腺和脾脏指数的影响( x±s)
分组 剂量C/mg· (kg· bw)-1 胸腺指数 脾脏指数
空白对照 - 33.001±6.829 99.628±2.510
模型对照 - 27.785±3.234■ 84.030±5.933■
金橘黄酮(高) 160 37.325±2.215＊＊ 105.736±8.934＊＊
金橘黄酮(中) 80 35.365±5.280＊ 98.582±2.372＊
金橘黄酮(低) 20 31.459±3.377 87.069±5.419
　　与空白对照组比较 , ■P< 0.05;与模型对照组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P
< 0.01;n=10
3.3　对 DNFB诱导小鼠迟发型超敏反应的影响 DNFB是一种
半抗原 , 与皮肤蛋白结合形成抗原 ,能刺激 T淋巴细胞增值成致
敏淋巴细胞 , 再次攻击后会诱发迟发型超敏反应。迟发性超敏反
应是 T细胞介导的兼有巨噬细胞参与的特异性炎症反应 , 与机体
细胞一致 ,可根据肿胀率的大小 , 说明其细胞免疫力强弱。
如表 3所示 ,不同剂量的金橘黄酮在一定程度上都具有提
高小鼠耳肿胀的作用 ,随着剂量的增加 , 耳肿胀率呈上升降趋势 ,
与模型对照组相比 ,金橘黄酮高剂量组的耳肿胀率提高 36.91%
(P<0.01), 金橘黄酮中剂量组耳肿胀度提高 21.42%(P<
0.05)。结果表明 , 金橘黄酮能明显地增强 DNFB引起的小鼠的
DTH,说明其可以激活 T细胞和巨噬细胞的特异性免疫功能。
表 3　金橘黄酮对小鼠耳肿胀度的影响( x±s)
分组 剂量 C/mg· (kg· bw)-1 肿胀率 (%)
空白对照 - 34.35±5.33
模型对照 - 20.35±5.33■■
金橘黄酮(高) 160 30.45±2.93＊＊
金橘黄酮(中) 80 26.99±3.40＊
金橘黄酮(低) 20 21.67±2.54
　　与空白对 照组比 较 , ■■ P< 0.01;与模型对 照组比 较 ,
＊P< 0.05, ＊＊P<0.01;n=10
3.4　对小鼠血清溶血素的影响 溶血素(IgM)是反映体液免疫
功能状况的一种方法。血清溶血素水平反映特异性体液免疫能
力 , 如果溶血素生成增多 ,则表明机体的体液免疫作用增强。 如
表 4所示 ,与模型对照组相比 , 各剂量实验组均能提高小鼠半数
溶血值 , 中剂量组与高剂量组的小鼠溶血值 HC50分别提高了
73.34%和 49.36%,均达到极显著效果(P<0.01), 说明金橘黄
酮可提高免疫低下型小鼠特异性体液免疫功能。
表 4　金橘黄酮对小鼠血清溶血素的影响( x±s)
分组 剂量 C/mg· (kg· bw)-1 溶血素 HC50
空白对照 - 289.45±22.20
模型对照 - 158.45±15.33■■
金橘黄酮(高) 160 274.26±21.95＊＊
金橘黄酮(中) 80 236.60±19.47＊＊
金橘黄酮(低) 20 185.12±17.58
　　与空白对照组比较 , ■■P< 0.01;与模型对照组比较 , ＊＊P<0.01;n
=10
4　结论
本实验对 Cy所致免疫低下型的小鼠,经过金橘黄酮灌胃 28d
后 ,与模型对照组相比,小鼠碳廓清指数 K和吞噬指数 、血清的溶血
素水平 、胸腺和脾脏指数及对 DNFB诱导的耳肿胀度都有显著提高。
这表明 ,金橘黄酮具有提高 Cy所致免疫低下型小鼠免疫功能的作
用 ,可能是一种良好的免疫调节剂 ,有待进一步研究和开发。
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