全 文 ：论著 文章编号:1000-5404(2007)17-1654-03
白鲜皮抗内毒素活性物质的分离提取与活性研究
郭毅斌 1 ,曹红卫 1 ,范　莉2 ,杨大成 2 ,鲁永玲 1 ,吕根法 1 ,郑　江 1 ,肖光夏 3　　(第三军医大学西南医院:1中心实验室 ,
3全军烧伤研究所 , 创伤 、烧伤与复合伤国家重点实验室 , 重庆 400038;2西南大学化学化工学院 , 重庆 400715)
　　提　要:目的　筛选与类脂 A( lip id A)具有较高结合活性的中药 , 从中提取具有拮抗内毒素( lipopolysaccha ride,
LPS)活性的物质。方法　采用生物传感技术 , 以 lipid A为靶点 , 检测 42种中药的水提物与 lip id A的结合活性;以白鲜皮
为研究对象 ,通过大孔吸附树脂 、溶剂萃取 、聚酰胺柱层析和高效液相色谱(HPLC)法 ,分离提取与 lipid A结合活性较高的
组分;动态比浊法鲎试验检测 H PLC 产物 DPR-1 ～ 3对 LPS(0. 1 ng /m l)的中和作用;ELISA 法检测 DPR-2对 LPS
(100 ng /m l)刺激的 RAW 264. 7细胞释放肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白细胞介素-6( IL-6)的影响。结果　8种中药水提物
与 lip id A具有较高的结合活性(RU>100 arc /s);从白鲜皮中逐步分离出与 lipid A结合活性较高的组分 ,经 HPLC法获得
3种物质 DPR-1 ～ 3;DPR-2对 LPS具有一定的中和作用 , 在 8 μg /m l浓度以上可显著抑制 LPS诱导的 RAW 264. 7细胞释
放 TNF-α和 IL-6 (P <0. 05), 并具有剂量效应关系。结论　从 42种中药中筛选出与 lipid A具有较高结合活性的中药白
鲜皮 , 并从中分离提取出抗 LPS活性物质 DPR-2, 其抗 LPS活性可能与 DPR-2对 LPS的中和活性有关。
　　关键词:白鲜皮;内毒素;生物传感器;高效液相色谱
　　中图法分类号:R284. 2;R285. 5　　　 文献标识码:A
Extraction and activity of anti-lipopolysaccharide component from densefruit pittany
root-bark
GUO Y i-bin1 , CAO Hong-wei1 , FAN Li2 , YANG Da-cheng2 , LU Yong-ling1 , LU G en-fa1 , ZHENG Jiang1 , XIAO
Guang-xia3(1M edica l Re search Center, 3 S ta teKey Labo ra to ry of T raum a, Burns and Comb ined Inju ry, Institute of Burns, Southw estH os-
pital, Third M ilitary M ed ica l University, Chongq ing 400038; 2 Schoo l o f Chem istry ＆ Chem ica l Techno logy, Sou thw est University,
Chongqing 400715, Ch ina)
　　Abstract:Object ive　To screen the Chinese he rbs w ith high affinity fo r lipid A and ex tract the an ti-li-
popolysaccha ride (LPS) compound from densefru it pittany roo t-bark (DPR). Methods　Fo rty-two k inds o f a-
queous ex tracts of traditiona lCh inese medicine we re screened to determ ine their b ind ing to lipid A by the bio-
senso r techno logy. The chem ica l componen tsw ith high affinity for lipid A we re gotten bymacropo rous adsorp tive
resins, so lvent extrac tion, polyam ide lam inar analy sis and h igh perfo rmance liquid chrom atog ram (HPLC) from
DPR. The neu tralization o fHPLC products DPR1 -3 for LPS (0. 1 ng /m l)was detected by kinetic tu rbidime t-
ric limu lus tes.t The release o f TNF-αand IL-6 in RAW 264. 7 cells after exposure to LPS (100 ng /m l)were
de tected by ELISA. Results　E ight kinds of aqueous ex tracts including DPR d isp layed h igh affinity fo r lipid A
(RU>100 arc /s). Th ree chem ica l components DPR1 - 3 w ith high affinity for lipid A we re go tten. DPR-2
neu tra lized LPS and inhibited the re lease of TNF-αand IL-6 in LPS-induced RAW 264. 7 ce lls in a dose-de-
pendentm anne r. Conclus ion　E ight herbs possess the componentsw ith high a ffinity fo r lip id A. DPR-2, ex-
tracted from DPR, show s anti-LPS ac tiv ity probab ly by binding lipid A and neutralizing LPS.
　　Key words:densefru it pittany roo t-bark;lipopolysaccharide;b io senso r;high perfo rmance liqu id chrom at-
og ram
　　基金项目:国家重点基础研究发展规划项目(“ 973”项目)(2005CB522600);
国家自然科学基金(30371767)
　　　 　　　Supported by the N ationalK ey Basic Resea rch and Deve lopment P lan
o f China(“973” P ro jec ts, 30371767) and the N ationalN a tura l Sci-
ence Founda tion of China (2005CB522600)
　　作者简介:郭毅斌(1971 -),男 ,福建省漳州市人 ,博士研究生 ,主治医师 ,主
要从事脓毒症机制及拮抗策略方面的研究。电话:(023)
68765466, E-m ail:guoy ibin130@163. com
　　通讯作者:郑　江 ,电话:(023)68754435, E-mail:Zheng j@ma i.l tmmu. com. cn
　　收稿日期:2006-10-12;修回日期:2006-12-11
　　内毒素 ( lipopo lysaccha ride, LPS)是 G -菌细胞外
膜的重要组成部分 ,已证实它是介导脓毒症和多器官
功能障碍的主要病原分子[ 1] 。对 LPS及其拮抗策略
的研究一直是国内外医学研究的重点和难点。但迄今
还未有一种有效的抗 LPS药物应用于临床 。资料表
明多种中药具有抗 LPS的作用 ,其抗 LPS的机制涉及
多个方面 ,如灭活 、降低 LPS毒性或促进其代谢等 [ 2] 。
本研究采用生物传感器技术平台 ,以 LPS的生物学活
1654
第 29卷第 17期
2007年 9月 　　
第　三　军　医　大　学　学　报
ACTA　ACADEM IAE　MED IC INAE　M IL ITARIS　TERTIAE　　
Vo .l 29, No. 17
Sep. 2007
DOI牶牨牥牣牨牰牥牨牰牤j牣牨牥牥牥牠牭牬牥牬牣牪牥牥牱牣牨牱牣牥牥牫
第 17期　 郭毅斌 ,等. 白鲜皮抗内毒素活性物质的分离提取与活性研究　
性中心类脂 A( lipid A)为靶点 ,结合传统的中药分离
技术和高效液相色谱(HPLC)法 ,通过对 42种抗炎中
药的筛选 ,从白鲜皮中分离提取活性物质 DPR-2,并研
究其拮抗 LPS的活性 。
1　材料与方法
1. 1　主要试剂和仪器
　　鲎试剂为广州湛江安度斯生物工程公司产品;小鼠 TNF-α
和 IL-6检测试剂盒购自深圳晶美公司 , 为 R＆D公司产品 ,灵敏
度分别为 15 pg /m l和 60 pg /m l;乙腈 , 色谱纯 , 美国 H oneyw ell
公司产品;SDS-99细菌 LPS测定系统为湛江正杰科学仪器有限
公司生产;美国 Ag ilent公司产 HP1100高效液相色谱仪 , 反相
C18柱 VYDAC218TP, 0. 46 cm ×25 cm ,粒度 5 μm ,孔径 30 nm。
生物传感器及其疏水样品池为美国 The rmo公司产品。
1. 2　42种中药水煎液与 lipid A亲和力的检测
　　取白鲜皮 、赤芍等 42种中药各 100 g, 分别用清水反复冲
洗后 , 再用 2 ～ 4 L蒸馏水漂洗 , 400 m l蒸馏水浸泡 2 h, 90 ～
100℃煎 40 ～ 60 m in, 冷却后 4 000 ×g离心 30 m in,收集上清
液 , 分别取 5 μl上样 , 参照文献 [ 3]方法检测其与 lipid A的结
合反应。
1. 3　白鲜皮水煎液的分离及其与 lipid A的结合活性
检测
　　白鲜皮 5 kg用清水和蒸馏水清洗后 , 90 ～ 100 ℃煎
45 m in, 8 000 r /m in离心 40 m in取上清;大孔吸附树脂分离:上
样后分别用蒸馏水和 50%乙醇洗脱;萃取:取 50%乙醇洗脱液
蒸发去乙醇 , 水溶液加入等量正丁醇萃取 3次;聚酰胺层析柱
分离:取萃取水相蒸发去正丁醇 , 上聚酰胺层析柱 ,分别用蒸馏
水和梯度的乙醇及乙酸洗脱。取白鲜皮分离过程中的各组分
分别负压抽干 , 以 PBS溶解成 0. 2 m g /m l, 取 5 μl上样 , 同 1. 2
方法检测各组分与 lipid A的结合作用。
1. 4　聚酰胺乙醇洗脱相的 HPLC纯化
　　聚酰胺乙醇洗脱相去乙醇后经分析柱检测 , 采用乙腈∶水
=7∶93的流动相 , 流速 0. 4 m l /m in, 15 m in后梯度洗脱 ,检测波
长 230 nm。
1. 5　3种 HPLC纯化产物 DPR-1 ～ 3对 LPS中和能力
的初步检测
　　将 HPLC分析柱分离得到的 3个产物 DPR-1 ～ 3分别与定
量的 LPS等体积混合 , 阳性对照为 LPS组加等量生理盐水 ,
37 ℃孵育 30 m in后 , 采用动态浊度法鲎试验检测孵育后的
LPS值 ,观察 1 μg /m l的 H PLC产物对 0. 1 ng /m l LPS的中和能
力 , 每种产物作 3复管 ,检测结果以 EU /m l表示。
1. 6　DPR-2对 LPS中和能力的检测
　　将不同浓度的 DPR-2与定量的 LPS等体积混合, 配成终浓
度分别为 DPR-2 0、0. 5、1、2、4μg /m l和 LPS 0. 1 ng /m l,其中不加
DPR-2的 LPS组作为阳性对照 ,每个浓度作 4复管 ,方法同 1. 5。
1. 7　DPR-2对 LPS诱导的小鼠 RAW264. 7细胞释放
TNF-α和 IL-6的影响
　　调整 RAW 264. 7细胞悬液浓度为 1 ×106 /m l, 取 0. 25 m l
于 96孔板内 ,置 37 ℃, 5% CO2培养箱培养 2 h;每孔加入终浓
度为 0、4、8、16、32、 64 μg /m l的 DPR-2继续培养 1 h;加入 LPS
(终浓度 100 ng /m l),其中不加 DPR-2的 LPS组作为阳性对照 ,
同时设不加 DPR-2和 LPS的空白对照组 ,每一浓度作 3复孔 ,
置 37℃, 5%CO2培养箱继续 , 取培养 4 h和 12 h的上清用
ELISA法分别检测 TNF-α和 IL-6浓度。
1. 8　统计学分析
　　结果以 –x±s表示 , 采用 SPSS 10. 0统计软件进行单因素方
差分析。
2　结果
2. 1　42种中药水煎液与 lipid A的结合反应测定结果
　　结合反应显示 , 阿胶 、栀子 、大黄 、射干 、青果 、赤芍 、白鲜皮
和金银花等 8种中药水煎液与 lipid A具有较高的特异性结合
能力(RU>100 arc /s)。选择本实验室未进行研究的白鲜皮为
进一步的研究对象。
2. 2　白鲜皮分离组分与 lipid A的结合活性检测
　　通过生物传感器跟踪检测显示 ,白鲜皮的大孔吸附树脂乙
醇洗脱相 、萃取水相和聚酰胺 20%乙醇洗脱相具有与 lip id A
相对较高的结合活性 ,其 RU值分别为 68、74、96 arc /s。
2. 3　白鲜皮聚酰胺 20%乙醇洗相的 HPLC纯化
　　将上述聚酰胺 20%乙醇洗脱相经 HPLC 纯化主要获得 3
种物质 , 其出峰时间分别为 5. 844、8. 982、32. 12 m in。
2. 4　白鲜皮 HPLC纯化产物 DPR-1 ～ 3对 LPS中和能
力的测定
　　3种白鲜皮 HPLC纯化产物 DPR-1 ～ 3与 LPS混合后 , LPS
的检测值分别为 (0. 096±0. 007)、(0. 057±0. 005)、(0. 084 ±
0. 007)EU /m l, 其中 DPR-2对 LPS的中和作用最强(P <0. 01)。
因此 , 在后续的实验中 ,进一步研究 DPR-2的生物学活性。
2. 5　DPR-2对 LPS的中和作用
　　如图 1所示 , DPR-2对 LPS介导的鲎试剂的凝结反应具有
抑制作用 , 并呈剂量效应关系。 当 DPR-2浓度为 1、 2、 4 μg /m l
时 , 对 0. 1 ng /m l的 LPS具有显著的中和作用(P <0. 05)。
a:P <0. 05, b:P <0. 01,与 LPS组比较
图 1　DPR-2对 LPS的中和作用(n=4, x±s)
2. 6　DPR-2对 LPS诱导 RAW264. 7细胞活化的抑制
　　DPR-2在 8μg /m l浓度以上对 LPS诱导的小鼠 RAW264. 7
细胞释放 TNF-α和 IL-6具有显著的抑制作用(P <0. 05), 其抑
1655
制作用呈显著的剂量-效应关系(图 2)。
a:P <0. 05, b:P <0. 01,与 LPS组比较
图 2　DPR-2对 LPS诱导 RAW264. 7细胞活化的抑制
作用(n=3, x±s)
3　讨论
　　中药在脓毒症的治疗中具有较好的疗效 ,中药的
清热解毒功效可能与其抗 LPS和抗病原微生物有关。
但由于中药组成成分复杂 ,尤其是受方法学的限制 ,中
药中抗 LPS作用的有效物质基础通常难以快速有效
地分离并给予阐明。
　　本研究以 LPS的活性中心 lipid A为靶点 ,将 lipid
A包被于生物传感器的样品池中 ,结合文献报道具有
较好抗内毒素作用的中草药 ,选择了 42种中药 ,检测
其水提物与 lipid A结合活性 ,以期发现能与 lipid A特
异性结合并能拮抗 LPS活性的药物 。结果表明赤芍 、
白鲜皮等 8种中药水煎液与 lipid A具有较高的特异
性结合能力 ,提示此 8种中药含有与 lip id A结合的抗
LPS活性物质的可能性相对较大 。在此基础上 ,本课
题组分别针对这 8种中药进行抗 LPS物质基础的分离
提取 ,此前已从赤芍中获取单体物质 1, 2, 3, 4, 6-O-五
没食子酰-β-D-葡萄糖 (PGG),研究证实 PGG可中和
LPS作用并抑制 LPS诱导的人外周血单核细胞活
化 [ 4] 。由于 PGG属鞣质类化合物 ,其临床应用受到限
制 。白鲜皮为芸香科植物 ,鞣质含量少[ 5] ,具有清热
燥湿和祛风解毒的功效 ,文献 [ 6]报道其醇和水提物
均具有抗菌作用 ,尽管青果 、大黄与 lipid A的结合活
性要高于白鲜皮 ,但我们推测其与 lip id A的高亲和力
可能与中药本身鞣质的高含量有关 ,因此选择白鲜皮
作为研究重点。本研究依托生物传感器的跟踪检测功
能 ,层级筛选获得与 lip id A高亲和力的组分 ,最终获
得对 LPS中和效果较好的 DPR-2,此结果也表明生物
传感器平台对目标物质的分离鉴定具有快速准确的引
导作用 。从 DPR-2的分离提取原理分析 , DPR-2对
LPS活性的中和作用机制可能是通过与 lipid A结合
后实现 。由于 LPS生物学活性与 lipid A的空间构象
密切相关 [ 7, 8] , DPR-2与 lipid A的结合可能改变了 lip-
id A的构象 ,影响 LPS与细胞膜相应受体的结合 ,进
而减轻其细胞学效应 。
　　脓毒症是多种炎症介质的诱生 、释放和级联效应
为特征 ,其中 TNF-α是较早释放并起核心作用的炎症
介质 ,而 IL-6则是机体炎症反应的重要标志之一 ,
TNF-α和 IL-6的水平与病情及预后密切相关 [ 9] 。资
料表明白鲜皮对炎性细胞因子及受体具有调节作
用 [ 10] ,本研究证实 DPR-2可剂量依赖性地抑制 LPS
诱导的巨噬细胞活化 ,减少 TNF-α和 IL-6的释放 ,其
机制可能与 DPR-2对 LPS的中和作用有关 。而DPR-2
是否还通过其他途径发挥其对 LPS诱导的炎症反应
细胞活化的抑制作用 ,尚有待进一步的研究。
　　综上所述 ,通过生物传感技术和 HPLC结合传统
的中药分离方法 ,本研究快速有效地从多种中药中筛
选并分离提取具有拮抗 LPS活性的有效物质 DPR-2,
为中药抗 LPS物质基础的分离提取提供新的思路和
方法。
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(编辑　陈聪连)
1656 　　　　　　　　　　　第 　三 　军 　医 　大 　学 　学 　报 　　　　　　　　　　　　第 29卷