全 文 ：第 34 卷第 4 期
2011 年 8 月
云南中医学院学报
Journal of Yunnan University of Traditional Chinese Medicine
Vol． 34 No． 4
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8． 2011
正交实验结合指纹图谱筛选白鲜皮提取工艺
邓 翀，颜永刚，姚天鹅
(陕西中医学院，陕西咸阳 712046)
［摘 要］目的:筛选白鲜皮中化学成分提取的最佳工艺条件。方法:采用 HPLC /UV法，以多成分相对含
量为评判指标，通过正交实验设计，考察乙醇浓度、乙醇用量、回流时间和回流次数等因素对白鲜皮化学特征
的影响。结果:最佳工艺条件为加乙醇 12 倍量，体积分数 75 %，提取 1 次，每次 1. 5 h。结论:该研究方法综
合中药化学整体特征，为提取工艺评价方法提供借鉴。
［关键词］白鲜皮;正交试验;HPLC;指纹图谱;多指标评价
中图分类号:R284. 2 文献标志码:A 文章编号:1000—2723(2011)04—0025—04
白鲜皮为芸香科植物白鲜 (Dictamnus das-
carpus Turczl)的干燥根皮，是一种常见的中草药，
为历代本草及中国药典收藏。别名有白鲜，藓皮，
地羊膻，金雀儿椒，八股牛，白羊鲜等。其味咸，
苦，性寒，具清热燥湿，祛风解毒，止痒等功效。
临床用于湿热疮毒，黄水淋漓，湿疹，风疹，疥癣
疮癞，风湿热痹，黄疸尿赤等症［1］。目前对白鲜
皮提取工艺的研究报道主要以总浸膏量和白鲜碱为
评价指标进行研究［2 － 3］。由于总浸膏量为评价指标
缺乏准确性以及白鲜碱为评价指标的单一性，本实
验从整体化学成分角度，以 HPLC化学指纹图谱的
多成分相对含量为控制指标考察白鲜皮的提取工
艺，筛选白鲜皮提取工艺。为白鲜皮提取分离提供
依据。
1 仪器与材料
1. 1 仪器
高效色谱仪 (L － 2130 二元泵，L － 2400 检测
器，日本日立公司) ，电子天平 (萨多利斯
GB2042 电子天平 (瑞典) ，0. 1mg) ，电热恒温水
浴锅 (北京市光明医疗仪器厂)。
1. 2 材料
白鲜皮采集于陕西省太白山红河谷 (由陕西
中医学院王继涛高级实验师采集并鉴定) ;白鲜碱
对照品 (购自中国药品生物制品检定所，批号:
111654 － 200301) ;色谱乙 (科密欧公司) ;水为
娃哈哈纯净水;其余试剂为分析纯。
2 方法
2. 1 溶液制备
2. 1. 1 供试品溶液制备
精密称取白鲜皮药材粉末 (60 目筛)约 5g，
以适当的溶剂为提取溶媒，按照实验设计的方法进
行提取，滤过，提取液在 80 ℃水浴浓缩，挥干溶
媒，以 95%乙醇溶解，定容于 100mL 量瓶中。储
存于 4 ℃，冷藏待用。
2. 1. 2 对照品溶液配制
精密称取白鲜碱对照品 10. 81mg，以甲醇溶
解，定容在 25mL的量瓶中作为对照品母液，浓度
为 0. 4324mg /mL;精密吸取对照品母液 2. 0mL，
以甲醇定容在 10mL量瓶中，作为对照品溶液，浓
度为 0. 08648mg /mL。
2. 2 指纹图谱测定方法建立
2. 2. 1 色谱条件
色谱柱:大连依利特 C18 色谱柱;流动相 A
相为乙腈，B相为 0. 4%磷酸水溶液;梯度洗脱程
序:0 ～ 10min，A相 5% ～ 20%;10 ～ 15min，A 相
20% ～ 30%;15 ～ 25min，A 相 30% ～ 30%;25 ～
40min，A 相 30% ～ 45%;40 ～ 60min，A 相 45%
～ 65%;60 ～ 70min，A 相 65% ～ 100%;70 ～
75min，A相 100% ～ 100%［4］。检测波长:228nm;
流速:1mL /min;温度:室温;进样量:10μL。对
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* 收稿日期:2010—12—11 修回日期:2011—01—07
作者简介:邓翀 (1978 ～) ，男，陕西咸阳人，博士，讲师。研究方向:中药质量标准及中药体内分析研究。
2011 年 云南中医学院学报 第 34 卷
照品白鲜碱色谱图见图 1，指纹图谱色谱图见图 2。
2. 2. 2 精密度试验
取同一供试品溶液，连续进样 5 次，28 个共
有色谱峰相对保留时间 RSD 小于 3%，28 个共有
峰面积 RSD不超过 5%，表明进样的精密度良好。
2. 2. 3 重现性试验
取同一供试品 5 份，分别按供试品溶液的制备
方法制备供试品并测定，28 个共有色谱峰相对保
留时间 RSD小于 3%，28 个共有峰面积 RSD 不超
过 5%，表明其重复性良好。
2. 2. 4 稳定性试验
取同一供试品溶液，分别在 0，2，4，8，12h
检测，28 个共有色谱峰相对保留时间 RSD 小于
3%，28 个共有峰面积 RSD 不超过 5%，说明供试
品溶液至少在 12h内稳定。
2. 3 提取溶剂选择
取白鲜皮药材粗粉末 (过 4 号筛)5g，分别
用 8 倍量甲醇、乙醇和 0. 2%盐酸水溶液为提取溶
媒，超声 30min，按 “2. 2. 1 项”下色谱条件测
定，根据“2. 8 项”下计算方法计算，选择提取溶
剂。
2. 4 提取方式选择
取白鲜皮药材粗粉末 (过 4 号筛) ，等量精密
称取 2 份，8 倍量的以 95%乙醇为溶剂，分别用超
声法、回流法提取，制备成等体积的溶液。按
“2. 2. 1 项”下色谱条件测定，根据 “2. 8 项”下
计算方法计算，选择提取方式。
2. 5 正交试验法研究白鲜皮提取工艺
对影响醇提取工艺的主要因素溶媒浓度 (因
素 A)、溶剂用量 (因素 B)、提取次数 (因素 C)
和提取时间 (因素 D)进行 L9 (34)实验，因素
水平见表 1。
表 1 因素水平表
水平因素 乙醇浓度 (%) /A 溶剂用量 v /w 提取次数 提取时间 /h
1 55 4 1 0. 5
2 75 8 2 1
3 95 12 3 1. 5
2. 6 样品测定
取正交实验法项下的 9 个供试品溶液吸取
20μL，以指纹图谱测定条件进样分析，记录色谱
图。
2. 7 评价方法
用多指标实验公式法进行数据处理［5］。以 Xij
表示第 i次实验中第 j个指标的测定值 (即 Xij表示
正交实验的第 i 次实验的色谱图中第 j 个色谱峰峰
面积值，其中在正交实验各次实验的色谱图中所选
定的色谱峰是根据活性部位指纹图谱而确定的，它
们相对应的色谱峰的相对保留时间是一致的) ，i =
1，2，…，n;j = 1，2，…，k。首先以各指标的最
大值 (即各色谱图中同一相对保留时间的各色谱
峰中峰面积值最大者)作为参照，对同一指标各
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第 4 期 邓 翀，等:正交实验结合指纹图谱筛选白鲜皮提取工艺
数据进行标准化处理，Dij表示第 j 个指标下的第 i
个测定值的标准化数据。
Dij = 100 × Xij / (Xj)max ［1］
再按各指标的重要程度和各组数据的相对标准
差确定加权系数。以 SDj 表示第 j个指标下 Dij的标
准差，以 RSDj 表示第 j 个指标的相对标准差，则
根据各指标相对标准差赋权为 RSD /RSDj，其中
RSD为指定指标 (参照物白鲜碱)的相对标准差;
根据各指标的重要程度赋权为 Ej，由于不能确定
各组分对药效的贡献大小，故认为指纹图谱中的各
个色谱峰 (群)所代表的各组分 (群)都很重要，
均设为 1。结合各指标的重要程度和各组数据的相
对标准差确定的权重系数为:
Fj = Ej × RSD /RSDj j = 1，2，……，k ［2］
因此，多指标实验公式为:
Pi = Σ (Fj × Dij) /ΣFj i = 1，2，……，n;j
= 1，2，……，k ［3］
［3］式计算所得的兼顾各指标综合效应的公
式，得分越大越好。
3 结果
表 2 正交实验安排及结果表
序号
因素
A B C D
P值
1 1 1 1 1 59. 41697
2 1 2 2 2 55. 77986
3 1 3 3 3 51. 63551
4 2 1 3 2 72. 12781
5 2 2 1 3 68. 60886
6 2 3 2 1 72. 28515
7 3 1 2 3 63. 14929
8 3 2 3 1 66. 09349
9 3 3 1 2 73. 45026
K1 55. 61078 64. 89802 67. 1587 65. 93187
K2 71. 00727 63. 49407 63. 7381 67. 11931
K3 67. 56435 65. 79031 63. 2856 61. 13122
R 15. 39649 0. 892283 3. 873093 5. 98809
3. 1 提取溶媒选择结果
根据实验数据分析，甲醇、乙醇和 0. 2%盐酸
水溶液 3 种提取溶媒的综合评分分别为 56. 43372，
70. 30897，55. 69554。故本实验选择不同乙醇为提
取溶媒。
3. 2 提取方式选择结果
根据对超声和回流提取方式实验数据比较，超
声和回流两种提取方式综合评分分别为 66. 73388，
71. 04552，故本实验选择回流为提取方式。
3. 3 正交试验结果
在前述提取条件初筛的基础上，采用 4 因素 3
水平正交实验法对溶媒浓度、提取溶剂倍量、回流
时间、回流次数进行优化研究，试验设计见表 1。
将各白鲜皮提取液分别定容至 25mL 量瓶中，
0. 45μm滤膜滤过后，用 “2. 2. 1 项”色谱法测定
各溶液中 28 个共有峰面积为指标，对数据进行标
准化处理，结果及极差分析见表 2，方差分析见表
3。
表 3 公式评分方差分析表
误差来源 自由度 偏差平方和 方差 F 显著性
A 2 130. 5978 65. 29892 48. 73079 *
B 2 2. 679986 1. 339993
C 2 8. 968696 4. 484348
D 2 20. 10449 10. 05225
注:F0. 05(2，2)= 19，当 F大于 19 说明有统计学意义。
以多指标实验公式法统计分析 P 值为考察指
标，由表 2 中极差 R 值大小显示，各因素作用主
次为 A ＞ D ＞ C ＞ B;由表 3 中方差分析结果表
明［6］:因素 A具有显著性差异，以 A2B3C1D2 组合
为佳，即最佳工艺条件为料液比 12 倍，乙醇浓度
75%，提取次数 1 次，提取时间 1. 5h。
3. 4 验证试验
根据正交实验结果对 A2B3C1D2 工艺条件重复
3 次实验，以验证该工艺的合理性和稳定性，结果
无显著性差异，RSD值为 2. 433。最后确定的最佳
提取工艺为料液比 12 倍，乙醇浓度 75%，提取次
数 1 次，提取时间 1. 5h。
4 讨论
中药药效是多成分、多靶点整体作用的结果，
在对中药的提取工艺优选过程中，若只采用某单体
成分含量为优化指标，不能反映全方的整体效应。
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2011 年 云南中医学院学报 第 34 卷
在以往对中药的提取工艺研究中，往往只局限于以
干浸膏得率、单体含量和化学部位含量为指标进行
工艺的优选，具有一定的局限性。本文对白鲜皮醇
提工艺优化的过程中，尝试采用未知结构成分的模
糊数据 (特征色谱峰面积之和)相结合的形式，
进行多指标综合评定优化提取工艺，较之于以往可
以更全面地反映提取物的成分信息。
尽管指纹图谱可以提供较为丰富的中药提取物
信息，但是本实验中采用紫外检测器，只能提供药
液中具有紫外吸收的成分的相对含量信息;且指纹
峰所对应成分的药效作用尚不完全清楚，在中药提
取工艺的优化方面尚不能实现所有药效组分的提取
与检测。在未来工作中，有待于结合现代高通量筛
选技术，追踪各成分的药物活性;同时，可以尝试
建立药液的液质联用指纹图谱，借助质谱等更加灵
敏、通用的检测系统，进行全成分的高效分析、检
测，提高中药制剂的提取效率和制剂水平，推进中
药研究的现代化进程。
［参考文献］
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(编辑:迟 越)
Orthogonal Combination Fingerprint Screening Extraction
Bark of Root － bark of Densefruit Pittany
DENG Chong，YAN Yong － gang，YAO Tian － e
(Shanxi Traditional Chinese Medicine College，Xianyang Shanxi 712046，China)
［ABSTRACT］ Objective:Chemical composition of Root － bark of Dense fruit Pittany screen extraction of
optimum conditions． Methods:Using high － performance liquid chromatography with UV detection，the relative
content of multi － component as evaluation index，by the orthogonal experimental design，studying the concentration
of ethanol，ethanol，reflux time and numbers effect chemical characteristics of Root － bark of dense fruit Pittany．
Results:The optimum reflux extracting condition obtained:adding12folds of 75% alcohol，extracting once，Ever-
y1. 5h． Conclusion:The study of method evaluate the overall hydro － chemical characteristics of traditional Chinese
medicine，for evaluation of extraction process for reference．
［KEY WORDS］ root － bark of densefruit pittany;orthogonal test;HPLC;fingerprint;multiple indicator
assessment
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